jonctionnels gingivaux humains
Résumé de l'arrière-plan
Cette étude vise à observer les caractéristiques morphologiques et identifier les caractéristiques de la fonction de l'épithélium de jonction (JE) tissus et cellules JE cultivées.
Méthodes
sections de paraffine de molaire humaine ou prémolaire du côté gingival vestibulo-linguale ont été préparés à partir de 6 sujets. Coloration HE et l'analyse d'images ont été réalisées pour mesurer et comparer la différence morphologique entre JE, épithélium buccal gingivale (OGE) et de l'épithélium sulculaire (SE). L'immunohistochimie a été appliqué pour détecter le motif d'expression de la cytokératine 6/5, 7, 18/08, 13/10, 16, 17, 19 et 20 dans JE, SE et HES. D'autre part, les cellules primaires humaines JE et HES ont été cultivées in vitro. Cellule d'identifier a été confirmé par histologie et immunohistochimie. Dans un modèle de co-culture, TEM a été utilisé pour observer la formation de fixation entre les cellules JE et surface de la dent.
Résultats de JE humaine était un tissu unique qui était différent de SE et OGE dans la morphologie. De même, la morphologie des cellules JE a également été notamment comparé avec des cellules OGE cultivées in vitro. En outre, les cellules JE avaient une période d'incubation plus longue que les cellules OGE. Different expression de plusieurs CKs illustré JE était une caractéristique de faible différenciation et la haute régénération. Après avoir été co-cultivées pendant 14 jours, des couches de cellules multiples, semblable à une membrane sous-sol et des structures hémidesmosome semblables ont été apparus à la jonction de la membrane cellulaire JE et la surface de la dent. De Conclusions
JE est un épithélium spécialement stratifié à faible la différenciation et de la capacité de régénération élevée dans le tissu gingival à la fois in vivo et in vitro. Dans le modèle de co-culture, les cellules JE humains peuvent former des structures sous-sol de type membrane et hémidesmosome-comme dans environ 2 semaines.
Mots-clés
Junctional épithélium gingival Oral épithélium Cytokeratin immunohistochimie Co-culture électronique matériel supplémentaire
La ligne version de cet article (doi:. 10 1186 /1472-6831-14-30) contient du matériel supplémentaire, qui est disponible pour les utilisateurs autorisés
Contexte
gingivale épithélium se compose de trois régions:. orale épithélium gingival ( OGE), l'épithélium sulculaire (SE) et Junctional épithélium (JE). JE est un gingival épithélium spécialisé de localisation à la jonction des tissus mous parodontale et les tissus durs, et la fixation de la couronne ou de la racine comme un collier. JE cellules sont uniformes dans la forme (soit à plat ou à la broche) et alignée parallèlement à la surface de la dent, contenant de grands espaces intercellulaires en raison de jonctions cellulaires détendue [1]. En tant que structure spéciale au dento-gingival jonction, JE est différent des autres épithéliums (OGE, SE) à l'origine, la morphologie cellulaire, la prolifération et la différenciation [2, 3]. Pendant ce temps, il a été rapporté que l'encéphalite japonaise est essentielle pour maintenir l'intégrité du parodonte [4, 5], et est un domaine clé primaire pour le début des parodontopathies et les traitements [6]. En outre, un neutrophiles-défensines a été trouvé à se localiser dans l'épithélium de jonction, qui a des effets importants sur l'intégrité épithéliale et le fonctionnement (kératinocytes adhérence, la propagation et la prolifération), et les effets sont au-delà de leurs activités antibactériennes [7]. Cependant, il est encore difficile et controversé à propos de JE dans la différenciation, l'activité phagocytaire, mécanisme de son attachement à la surface de la dent, la réparation et le mécanisme de reconstruction après une blessure [5, 8].
Les méthodes histologiques classiques d'investigation de JE in vivo sont simplistes dans l'approche et limitée dans le domaine de l'observation [9-12]. Au cours des dernières années, les chercheurs ont étudié le JE en utilisant des modèles de culture cellulaire in vitro et des techniques cytologiques moléculaires utilisant des animaux et /ou les cellules OGE humaines, les cellules épithéliales du ligament parodontal et les cellules épithéliales orales [13-16]. Bien que ces cellules sont des cellules épithéliales orales, ils ne peuvent modéliser les cellules EJ primaires complètement en raison des différences dans la source, la morphologie, la structure, la différenciation et les stimuli qui induisent la prolifération. Le plus cytokératines (CK) sont des protéines de filaments intermédiaires de la famille du cytosquelette et constituent la principale les protéines structurales dans les cellules épithéliales. Comme nous le savons, l'expression de kératines est l'une des caractéristiques définitives des cellules épithéliales et reflète les propriétés biologiques des cellules épithéliales, y compris leur origine, le développement, le type histologique, et le niveau de différenciation [17, 18]. Plusieurs recherches ont étudié l'expression et la distribution d'une variété de CKs (CK-pan, 5/6, 7, 8/18, 10/13, 16, 17, 19, 20) dans les tissus parodontaux des humains et des animaux, et expression de certains kératines dans l'épithélium gingival ont été déterminées [15, 19-21]. Par exemple, les motifs d'expression de CK10 /13, 16, 19 de JE ont été différent de celui de HES et SE; L'expression particulièrement élevé de CK19 dans toutes les couches de JE a fait, il est devenu un marqueur characteristical histologique pour JE in vivo [3, 22-24]. Cependant, les expressions des différents types de cytokératine dans JE et la différence avec OGE et S'ont pas été systématiquement signalés.
Dans cette étude, les caractéristiques morphologiques des tissus JE ont été examinés par l'observation histologique, l'analyse de l'image et l'immunohistochimie. L'expression et la distribution d'une variété de CKs ont été déterminées dans les tissus JE et comparés avec HES et SE. En outre, les cellules JE et OGE primaires ont été cultivées. Le modèle de structure et la croissance morphologique des cellules JE et OGE primaires ont été observées et les expressions de kératines spécifiques (CK-pan, 19, 10/13, 16) ont également été détecté par immunohistochimie. Nous soupçonnons d'identifier les propriétés biologiques uniques (morphologie, le potentiel de régénération) de JE in vivo et in vitro. En outre, les cellules cultivées JE humaines ont été ensemencées directement sur les tranches de racines humaines dans une culture composite afin d'explorer le processus de JE nouvel attachement. Cela fournirait des preuves expérimentales pour une étude plus approfondie de la façon dont une nouvelle attache se produit après la chirurgie parodontale et la formation de la cicatrisation des tissus péri-implantaires en clinique
. Les caractéristiques morphologiques des Méthodes de tissus épithéliales gingivaux humains
échantillons gingivaux humains ont été isolés à partir de spécimens mandibule de deux patientes avec améloblastome mandibulaire quatre hommes et. Ils étaient non-fumeurs sans aucune autre maladie. Le site de l'âge et de l'échantillonnage était la liste dans le tableau 1. Une chirurgie ablative a été réalisée dans le département de pathologie buccale à l'hôpital affilié de la neuvième populaire à Shanghai Jiao Tong University entre Septembre et Octobre 2010. L'étude a été approuvée par le comité d'éthique local , et le consentement éclairé a été obtenu de tous les patients. molaire inférieure ou la prémolaire et ses tissus gingivaux distants du site de la tumeur avec une morphologie normale gingival ont été sélectionnées par l'observation clinique. En outre, les échantillons de moins de 3 mm de profondeur détectée par sondage parodontal ont été recueillies et fixées dans 10% de formaldehyde à température ambiante pendant 24 h. Les échantillons ont été placés dans Plank-Rychlo décalcification solution (70 g de AlCl
3, 56 ml d'acide formique, 85 ml d'acide chlorhydrique et de l'eau distillée ajoutés à 1 litre) pendant 2 semaines après qu'ils ont été coupés perpendiculairement à la axe long de la dent le long du côté vestibulo-linguale en utilisant une scie à main. Enfin, plusieurs sections épaisses de 5 mm de dents et des tissus gingivaux dans le centre de la dent ont été obtenus à partir de chaque échantillon. Ensuite, ces sections ont été soumis à l'éthanol déshydratation et inclus en paraffine. Trois blocs de paraffine ont été choisis au hasard dans chaque échantillon et en série sectionnées à 4 pm. Les coupes ont été colorées avec de l'hématoxyline-éosine (HE) et observées au microscope optique. La largeur, l'épaisseur, la zone de JE et la largeur de SE sur le côté buccal ont été mesurées par AXIOPLAN 2 dimensions de l'image analyse system.Table 1 mesurées chez l'homme et JE SE
Exemple no.
Age
Site
Sampling
Largeur de JE (mm)
Epaisseur de JE (mm)
Espace de JE (mm2)
Largeur SE (mm)
1
21
Premolar
1.135
0.069
0.047
0.325
1.134
0.066
0.045
0.321
1.133
0.064
0.043
0.334
2
28
Molar
1.113
0.062
0.043
0.308
1.102
0.066
0.044
0.303
1.120
0.065
0.044
0.323
3
31
Molar
0.850
0.058
0.041
0.563
0.845
0.059
0.041
0.565
0.847
0.060
0.041
0.554
4
28
Molar
0.838
0.052
0.038
0.550
0.844
0.055
0.040
0.552
0.858
0.056
0.040
0.543
5
33
Premolar
1.105
0.083
0.043
0.785
1.108
0.083
0.043
0.801
1.105
0.083
0.041
0.808
6
38
Premolar
1.081
0.069
0.041
0.625
1.072
0.065
0.038
0.667
1.078
0.069
0.040
0.644
Mean
1.021
0.066
0.042
0.532
Standard écart
0,128
0.009
0,002
0.176
L'échantillon 2, 3 étaient des femmes et la gauche étaient des hommes .
en raison de la séparation de JE avec la surface de la dent après la décalcification, la frontière entre JE et S'a été déterminé en fonction de crêtes épithéliales, kératinisation, de la morphologie cellulaire et la coloration. Selon le procédé de projection, des lignes perpendiculaires ont été tirées de la marge libre de SE jonction de JE et SE, et la partie la plus profonde de JE vers la surface de la dent, respectivement. Les longueurs de projection de SE et JE sur la surface des dents ont été mesurées alors que leurs largeurs. Une ligne perpendiculaire a été établi à la partie la plus épaisse de JE et la distance entre les deux points de la ligne perpendiculaire et de l'épithélium intersection a été mesurée comme l'épaisseur de JE. Une courbe a été tirée de la partie la plus profonde de JE à sa jonction avec SE, y compris toute la région et de la zone JE (Figure 1). Figure 1 Schematics Description de la mesure JE et SE. largeur A. SE; largeur B. JE; C. épaisseur JE; JE humaine et OGE culture de cellules de
D. JE région. Pour la culture des cellules JE et OGE in vitro, des incisions de 2 mm de longueur ont été faites le long buccale et la gencive marginale lingual. Cinq dents saines et entièrement éclaté ont été enlevés avec orthodontique ou touchés dents (12 à 25 ans, une bonne santé bucco-dentaire et la gencive saine clinique). Les dents en même temps que la gencive marginale incisée ont été enlevés. La gencive libre (y compris OGE et SE) a été coupé, autant que possible macroscopiquement. JE tissus fermement attachés au collet de la dent (et non la racine) ont été grattées de la surface de la dent (figure 2), et lavé par une solution de D-Hank contenant des antibiotiques à double pénicilline-streptomycine. Le protocole d'étude a été approuvé par le comité d'éthique de l'hôpital de Zhongshan (No: 2009-173). Figure 2 échantillons JE. A. a éclaté Retirer entièrement la dent touchée avec gingival marginal; B. Coupez l'excédent gencive libre (y compris OGE et SE); C. Reste JE tissu sur le cou de la dent; D. Obtenir tissus JE par grattage sur le cou de la dent; E. Removed tissus JE; F. collet dentaire lisse après le grattage.
Dans la culture primaire, les tissus JE ont été digérés avec 2 ml de solution de travail DispaseII à 4 ° C pendant 16-18 heures. L'épithélium a été séparé de la lamina propria par une pince, puis les couper en morceaux, digéré avec 4 ml de 0,025% de trypsine-EDTA 0,01% pour 5-8 minutes avec agitation. La digestion a été arrêtée par addition d'une solution de D-Hank contenant 10% de FBS, puis on a filtré en utilisant un tamis de 180 um d'acier inoxydable, puis centrifugation. Les précipités ont été mélangés (milieu de croissance des kératinocytes défini) DKGM pour former une suspension cellulaire. Les cellules ont été ensemencées dans des plaques à 24 puits à 2 x 10 5 cellules /ml et placés dans un 37 ° C, 5% CO 2 incubateur. Le milieu a été rafraîchi au bout de 3 jours pour la première fois, puis une fois par jour. Dans la culture de passage, les cellules ont été soumises à des passages à 60-70% de confluence par addition de 0,25% de trypsine-EDTA à 0,02% à 37 ° C pendant 5-8 min. Lorsque les cellules paraissaient arrondies au microscope, la digestion a été arrêtée. Ensuite, les cellules ont été suspendues et centrifugés. DKGM a été ajouté pour former une suspension cellulaire, et distribuée dans de nouvelles boîtes de Pétri. D'autre part, les cellules ont été traitées comme HES cellules EJ ci-dessus. Différemment, le tissu OGE a été coupé en petits morceaux de 5 x 5 mm 2. La suspension de cellules OGE a été ensemencées à des densités allant de 5 à 10 x 10 5 cellules /ml dans des boîtes de Pétri de 60 mm de diamètre. Les cellules cultivées ont été observées quotidiennement en utilisant inversé à contraste de phase microscope pour suivre leurs conditions de morphologie et de croissance. En outre, la suspension à des passages d'une cellule unique a été inoculé à des densités allant de 2 à 5 × 10 5 cellules /ml sur le couvercle glisse des boîtes de Pétri stériles. Ensuite, traité avec H & amp; courbe
de croissance cellulaire dans les cellules JE et OGE E de coloration lorsque les cellules ont été cultivées à 60% de confluence, et observées à l'aide d'un microscope optique pour suivre les changements sur la morphologie et la structure
JE primaire, Les cellules OGE. à 100% de confluence ont été digérés pour former une suspension cellulaire unique et ensemencées à une densité de 2 x 10 plaques 4 /cm 2 à 24 puits. Les cellules dans deux puits aléatoires ont été comptés par jour en utilisant un hémocytomètre. Une courbe de croissance des cellules a été tracée par le nombre moyen de cellules chaque jour en fonction du nombre de jours. Le temps de doublement a été obtenu à partir de la courbe de croissance qui pourrait indiquer la longueur du temps nécessaire pour les cellules de doubler en nombre lors de la phase logarithmique.
Analyse immunohistochimique des tissus gingivaux épithéliales humaines et des cellules cultivées in vitro
immunohistochimique streptavidine conjuguée à la peroxydase procédé (SP) a été réalisée sur le tissu gingival humain par incubation avec anti-CK 6/5 (clone D5 /16B4), anti-CK 7 (VO-TL12 /30), anti-CK 18/08 (clone Zym5.2) anti-CK 10/13 (clone DE-K13), anti-CK 16 (clone LL025), anti-CK 17 (clone E3), anti-CK 19 (clone A53 /BA2) et anti-CK 20 (clone KS20 0,8). Ces anticorps monoclonaux cytokératine anti-humains ont été obtenus auprès de Zymed (U.S.A.). tissu de la glande parotide humaine a été coloré comme témoin positif [25] et l'anticorps primaire remplacé par PBS a été utilisé comme témoin négatif. La procédure immunohistochimique de coloration a été réalisée par les instructions du fabricant Ab. Simplement, les sections déparaffinées ont été incubées avec une solution de pepsine à 37 ° C pendant 5 à 10 minutes, et incubées avec un sérum de blocage à température ambiante pendant 30 min. L'anticorps primaire à 1h50 dilution a été ajouté dans le groupe d'étude et le contrôle positif. PBS au lieu de l'anticorps primaire a été ajouté dans le contrôle négatif. Après avoir été mis en incubation à 4 ° C pendant une nuit, les sections ont été incubées dans la solution de travail avec un anticorps secondaire marqué à la biotine à la température ambiante pendant 30 min, suivi d'une solution de streptavidine-peroxydase de raifort marquée à la température ambiante. solution chromogène DAB a été ajouté pendant 5-10 min. Les coupes ont été rincées à l'eau courante, re-colorées avec de l'hématoxyline et montées. D'autre part, les cellules adhèrent à des passages pour couvrir les feuillets ont été fixés en utilisant 10% de formaline neutre. Les cellules ont été traitées comme ci-dessus JE tissus. Dans ces cellules, la CK-Pan, CK19, CK10 /13 et CK16 a été détectée. Le cytoplasme des cellules positives CK était tachée et a été classé comme négatif (-) sans colorant, faiblement positif (+) avec la coloration jaune, positive modérée lumière (++) avec coloration de positif jaune ou forte (+ + +) avec coloration brun [26].
Co-culture de cellules JE humaines et des tranches de racines
dents tranches étaient les mêmes échantillons recrutés pour les cellules primaires JE. Les échantillons ont été imbriqués déchets en utilisant une curette de Grace pour enlever la membrane parodontale. Ils ont été fixés dans 10% de formaline neutre pendant 12 h, et décalcifiés en utilisant une solution de décalcification Plank-Rychlo pendant 2 semaines. Les couronnes dentaires ont été enlevés et les dents ont été sectionnés le long de la surface de la racine en films dentaires de 5 x 5 mm 2 dans la taille et 1-1,5 mm d'épaisseur. Les films ont été lavés pendant 2-3d et trempées dans une solution de D-Hank contenant des antibiotiques à double pénicilline-streptomycine à 4 ° C avant utilisation. Le JE suspension de cellules humaines à des passages a été inoculé à une densité de 5 x 10 5 cellules /ml sur les tranches de racine avec le cément de surface dans des plaques à 24 puits, 2 à 3 tranches par puits, et placés pendant 14 jours en à 37 ° C 5% de CO 2 saturation d'humidité incubateur. Le milieu a été rafraîchie 3 D plus tard, puis une fois par jour
d'observation en utilisant TEM:. Tranches de racines ont été recueillies 3, 5, 7, 9, 11, et 14 jours après l'inoculation, respectivement, et fixé à 2% de glutaraldéhyde à 4 ° C pendant 2 h. tranches de racines, avec le cément de surface haut, ont été coupés en petits morceaux de 5 x 1 x 1 mm, de post-fixées à l'acide osmique à 1% à 4 ° C pendant 2 h, déshydraté à l'éthanol, trempée par de l'oxyde de propylene à la température ambiante pendant 24 h et inclus dans l'araldite. Les échantillons noyés ont été découpés en tranches ultrafines, qui ont été colorées avec du citrate de plomb, suivie par l'observation par MET (PHILIP CM-120, Pays-Bas) pour suivre la formation de cellules JE fixation à la surface du cément.
Résultats de Morphological analyse des tissus de l'épithélium gingivaux humains
Sous le microscope, JE était court et bande, progressivement épaissi de l'émail-cément jonction au coronale. Après colorées avec HE, aucune kératinisation ou crêtes épithéliales existaient dans les tissus JE qui a été divisé en couche basale et la couche suprabasale, tandis que les crêtes épithéliales kératinisées ou épithélium partiellement kératinisé, denses et irrégulières en saillie dans le tissu conjonctif adjacent ont été trouvés dans SE sombre tachée et OGE les tissus (figure 3A). De plus, les cellules JE étaient différentes de SE et OGE dans la morphologie et avait frontière claire avec SE (figure 3B). Les cellules dans les tissus JE étaient uniformes dans la forme, soit à plat ou à la broche, alignés parallèlement à la surface de la dent et les jonctions cellulaires étaient desserrés avec espace intercellulaire évident. Cependant, les cellules SE et OGE étaient tous les polygones irréguliers et étroitement alignés avec moins ou même pas d'espace intercellulaire. En outre, les cellules JE étaient abondantes dans les organites et le noyau était grande, et de même, les noyaux des cellules SE et OGE ont aussi grande, mais hyperchromatiques. En outre, les cellules SE et OGE présentées les caractéristiques structurales typiques des cellules squameuses et pourraient réciproquement transformer sans limite claire. Figure 3 HE coloration du tissu gingival humain. A. La région entre les flèches est JE (x150); B. La frontière entre JE et SE, la flèche pointe à la frontière (x1200).
Selon les mesures dans l'analyse de l'image, le tissu JE était 1.021 ± 0.128 mm de largeur, 0,066 ± 0,009 mm d'épaisseur, et 0,042 ± 0,002 mm 2 dans la zone, tandis que, la S'était 0.532 ± 0,176 mm de largeur (tableau 1).
d'analyse morphologique du gingivales humain cultivé des cellules JE et OGE in vitro
afin d'observer les cellules JE clairement et identifier les caractéristiques, les cellules JE et OGE ont été cultivées in vitro. Par conséquent, initialement ensemencé des cellules EJ primaires ont présenté une morphologie diverses, telles que polygonale plate, en forme de broche, de forme ovale et sphérique. Après 24-96 heures d'incubation, les cellules adhérant au fond de la boîte de Pétri, le cytoplasme tourné sombre, la membrane était rude, et 2-3 cellules de pliage ont été entièrement étirés. Les noyaux étaient grandes et souvent 2 à 3 nucléoles dans chaque cellule. Après 7 jours, les cellules se sont peu à peu en période de croissance rapide et étendue le long du plat bord Pétri au centre. Scattered mitose et de cellules clones ayant une morphologie angulaire ou fusiforme apparaissaient comme le montre la figure 4A. Après 10 à 12 d, des clones de cellules ayant une morphologie diverses, de taille non uniforme des taches formées confluentes (figure 4B). Dans le premier passage, les cellules ont adhéré au fond plat et étiré en 24-48 heures après l'inoculation, les cellules présentent une morphologie similaire avec des cellules primaires; Dans le second passage, les cellules ont montré JE morphologie irrégulière comme les pseudopodes 'cellules géantes, et vacuolisation cytoplasmique (figure 4C); Dans les passages suivants, la morphologie était plus irrégulière et la prolifération cellulaire semblait ralentir, même présenter le vieillissement et la mort des signes (Figure 4D). Figure 4 Observation de JE et OGE morphologie des cellules (cellules primaires). Des clones de cellules A. JE formés (la flèche x 200); B. A 10-12 j, les cellules présentent une morphologie encéphalite japonaise non uniforme et un agencement dispersé (x 200); C. Le troisième passage JE cellules multiples «cellules géantes» est apparu (la flèche × 200); D. Le 5ème passage des cellules JE a montré des signes de vieillissement et de la mort (× 400); E. les clones cellulaires OGE formés et développés (la flèche x 200); F. A 7-9 d, les cellules OGE a présenté une morphologie uniforme, arrangement serré, et kératinisant 'analogue à la pierre de pavage' (x 200); G. Dans le troisième passage de cellules géantes "cellules OGE est apparu (x 200); H. Le 7ème passage des cellules OGE a montré des signes de vieillissement et de la mort (× 400)
Comme les cellules OGE, initialement ensemencé des cellules primaires présentent des formes polygonales ou sphériques et respectées au fond plat dans les 24-72 h.; Après 5 jours, des clones de cellules formées avec une morphologie triangulaire ou polygonale, cependant, ces cellules étaient plus uniformes que les clones de cellules EJ de la même période (figure 4E); Après 7-9 d, les clones OGE agrandies et ont convergé, puis bien organisé et a montré typique pavé-like 'kératinisation (Figure 4F); 11.09 après d, les cellules étaient confluentes à environ 100%; Dans le second passage, les cellules ont adhéré et étirés en 48 h. Et puis les «cellules géantes» sont apparues (figure 4G); Après avoir été repiquées pour 4 fois, les cellules étaient principalement «cellules géantes» et la prolifération ralentit aussi avec le vieillissement et la mort des signes (Figure 4H).
Après cela, les cellules JE et OGE ont été colorées avec HE et observées au microscope. En conséquence, les cellules sont apparues JE morphologie diverses (en forme de fuseau, triangulaire, ovale), taille non uniforme, l'arrangement détendu, grandes et sombres noyaux colorés et des divisions multiples nucléaires telles que mentionnées ci-dessus (figure 5A). Cependant, les cellules OGE étaient de taille uniforme, bien agencé, typiquement kératinisé, et avec des noyaux ronds dans le centre, ainsi que des divisions nucléaires visibles (figure 5B). Par conséquent, JE ont été significativement différents de HES dans la morphologie des cellules. Figure 5 H & amp; E coloration des cellules JE et OGE (cellules seconde à des passages, H & amp; E × 400). cellules A. JE présente non uniformes dans la taille et la morphologie, arrangement dispersé, grandes et profondément colorées noyaux et divisions nucléaires multiples; cellules B. OGE étaient uniformes en taille et en forme, bien disposé, et «Pavé-like 'kératinisant. état des cellules JE et OGE cultivées
croissance in vitro
Nous analysons ensuite les conditions de ces deux cellules de croissance. Il y avait plus de cellules OGE cultivées par rapport à JE. Par conséquent, la période d'incubation des cellules EJ pour fixer et proliférer a été 07.01 d in vitro, alors que pour les cellules HES était 03.01 d, un peu plus court. La phase logarithmique et le pic de cellules JE croissance sont apparus dans la 8 e - 12 e d (ne durent pendant 5 jours), tandis que des OGE était 4 e - 11 e d (8 journées). Après 12 d, les cellules JE et OGE étaient tous deux entrés dans une période de stagnation. En outre, le nombre de cellules JE est passé de 6 × 10 4 /ml à 12 × 10 4 /ml pendant 9-12 jours, et les cellules OGE est passé de 7 × 10 4 /ml à 14 × 10 4 /ml pendant 6-10 jours. Selon les statistiques, le temps de doublement cellulaire des cellules JE était 48-60 h, tandis que OGE était 72-96 h. Dans l'ensemble, OGE présentent plus doucement courbes que JE (Figure 6). Comme on le voit sur la figure 7, les cellules ont été passées avec succès JE 5 fois pendant HES 7 fois dans la présente expérience. La qualité des cellules JE repiquées considérablement diminué après le 3ème passage, mais après 4 e passage dans les cellules OGE. Figure 6 courbe de croissance des cellules JE et OGE. Les cellules de l'encéphalite japonaise sont en phase de latence (1-7 jours après l'inoculation), la phase exponentielle (8 à 12 d), et la phase de plateau (12d par la suite). cellules OGE étaient en phase de latence (1-3 jours après l'inoculation), phase exponentielle (4-11 d), et la phase de plateau (12 d par la suite).
Figure 7 numéros de passage des cellules et le nombre de cellules par passage pour JE et les cellules OGE. (Cellules JE ont été repiquées cinq fois. Cellules OGE ont été repiquées 7 fois).
Analyse immunohistochimique des tissus gingivaux épithéliales humaines et des cellules cultivées in vitro
Afin d'identifier profondément les caractéristiques fonctionnelles de JE, plusieurs CKs ont été analysés. Dans les tissus de l'épithélium gingivaux humains, l'expression de CK5 /6 et CK20 était similaire bien que CK5 /6 était plus fort teinté. Ils ont été positifs colorés dans la couche suprabasale (surtout près de la surface) et négatif teinté dans la couche basale; L'expression de CK7 et CK17 était négatif ou seulement faiblement positif en très peu de cellules; Dans CK10 /13 et CK16, ils ont été exprimés dans toutes les couches de JE, mais seulement dans la couche supra-basale de HES et SE; L'expression de CK10 /13 était fort positif et CK16 était faiblement positif ou positif; CK19 a été détecté dans toutes les couches de JE avec une forte expression positive, tandis que son expression dans OGE et S'a été limitée à la couche suprabasale et aucune coloration a été observée dans la couche basale. La frontière entre JE et S'est clairement dû à la différence de coloration CK19; Le profil d'expression de CK8 /18 était à un niveau inférieur qui était semblable à CK19, sauf la couche basale de OGE et SE. En outre, il a également montré une faible expression positive dans la couche suprabasale (près de la couche basale) dans certaines tranches. Les descriptions détaillées étaient dans le tableau 2 et la figure 8.Table motif 2 Expression des différentes cytokératines à JE, OGE et SE de l'anticorps
CK
Échantillon no. (N)
Slice pas. (N)
JE
OGE
SE
b
sb
b
sb
b
sb
D5/16B4
5/6
6
20
-
++
-
+
-
+
OV-TL12/30
7
6
10
-
-
-
-
-
-
Zym5.2
8/18
6
15
++
++
+
-*
+
-*
DE-K13
10/13
6
20
+++
+++
-
+++
-
+++
LL025
16
6
18
+
+
-
++
-
+
E3
17
6
11
-
-
-
-
-
-
A53/BA2
19
6
10
+++
+++
+++
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+++
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Ks20.8
20
6
14
-
+
-
+
-
+
Note: b: couche basale, sb: couche suprabasale, -:. Négatif, +: positif faible, ++: positive modérée, +++: fortement positif, *: faible expression positive dans la couche suprabasale dans certaines tranches
Figure 8 immunohistochimie tache de tissus gingivaux humains (× 100). Coloration contre différents cytokératines a été réalisée. A. CK5 /6; B. CK7; C. CK8 /18; D. CK10 /13; E. CK16; F. CK17; G. CK19; H. CK20; tissu gingival I. humain a été utilisé comme témoin négatif; J. tissu de la parotide humaine a été utilisé comme témoin positif.
Dans les cellules en culture, les cellules JE et OGE ont été colorées positivement pour CK-Pan (Figure 9A, B). coloration fortement positive de CK19 a été observée dans les cellules JE (Figure 9C), mais seulement un petit nombre de cellules OGE dispersées ont été colorées positive (Figure 9D); Le CK10 /13 tache des deux cellules JE et OGE étaient faibles positifs ou positifs (Figure 9E, F); D'ailleurs, les deux cellules de types ont été dispersés positivement colorées avec CK16 (figure 9G, H). Les contrôles négatifs ne sont pas colorées dans toutes les conditions (Figure 9i, J). Figure 9 immunohistochimique coloration des cellules JE et OGE (cellules du deuxième passage, SP × 400). cellules A. JE, CK-Pan positif; cellules B. OGE, CK-Pan positif; cellules C. JE, CK19 fortement positive; cellules D. OGE, CK19 dans un très petit nombre de cellules positives dispersées; E. JE cellules, CK10 /13 faiblement positif au positif; F. OGE cellules, CK10 /13 faiblement positif au positif; cellules G. JE, CK16 dispersés positif; cellules H. OGE, CK16 dispersés positifs; cellules I. JE, témoin négatif; cellules J. OGE, contrôle négatif.
observation TEM de la formation de cellules JE attachement à enraciner les tranches
Enfin, la formation de fixation entre les cellules JE et surface de la dent a été étudiée par un modèle de co-culture. JE cellules et des tranches de racines ont été co-cultivées in vitro. Ensuite, les cellules JE sur la surface de cément humaine ont été observés. Trois jours après l'inoculation, les cellules sont sphériques et non totalement étirées (figure 10A); Cinq jours plus tard, le nombre de cellules JE sur la surface de cément accrue et une partie des cellules ont été étirée (Figure 10B); A 7 d, les cellules JE ont été entièrement étirés pour être plate-forme, fixée à la surface de cément avec membrane cellulaire, mais ne semblaient pas la membrane basale claire et structures hémidesmosome-like (Figure 10C); À 9d, des cellules EJ a semblé avoir un petit nombre de dépôts denses aux électrons, comme hémidesmosome à la membrane cellulaire locale attachée à la surface du cément (flèches, Figure 10D); À 11-14 d, il y avait une augmentation significative du nombre de cellules dans des tranches de racines, et les cellules multicouches apparu (Figure 10E). En outre, un grand nombre de dépôts denses aux électrons est apparu à la membrane cellulaire cément surface de jonction. Enfin, la membrane basale-like et des structures de hémidesmosome-like ont été formées (flèches, Figure 10F). La figure 10 observations TEM de la formation structurelle de cellules JE fixation à la surface du cément. A. A 3 d, il y avait un petit nombre de cellules sur la surface de cément, les cellules étaient sphériques, ne pas étirer (TEM × 13500); B. A 5 D, les cellules à la surface du cément augmenté en nombre, et une partie des cellules étirée (MET × 9700); C. A 7 d, cellules complètement étirée pour être plate-forme, et fixée à la surface de cément, mais ne forment pas des structures membrane basale-comme et hémidesmosome comme clairs (TEM × 24500); D. A 9d, des cellules EJ a semblé avoir un petit nombre de dépôts denses aux électrons, comme hémidesmosome à la membrane cellulaire locale attachée à la surface du cément (flèches, MET × 33 000); E. À 11-14 d, il y a eu une augmentation significative du nombre de cellules sur la surface de cément, et les cellules multicouches est apparu (TEM × 7400). Rapport de F. un grand nombre de dépôts denses aux électrons (flèches) est apparu au JE membrane cellulaire cément surface de jonction, formant les structures membrane basale-comme et hémidesmosome-like (TEM × 46000).
JE est un tissu humain unique gingival épithélium
Selon l'observation des tissus, nous avons constaté que humain normal tissus JE appartenait à un simple épithélium stratifié. Les cellules étaient uniformes dans la forme, relativement plus faible dans la différenciation, sans kératinisation et crêtes épithéliales in vivo. Ceci est probablement dû à son emplacement au fond du sillon gingival, la fixation de la surface de la dent et sont rarement soumis à une stimulation externe. Cependant, la SE et OGE sont exposés à l'environnement de la cavité buccale et présentent des caractéristiques typiques des cellules épithéliales squameuses. Ils ont été un polygone en forme, étroitement aligné, kératinisée dans la couche de surface avec des crêtes épithéliales denses projetées dans le tissu conjonctif, et présentent une frontière claire avec JE. Dans des expériences préliminaires, des crêtes épithéliales ont également été observés dans JE de l'atrophie gingivale ou des poches parodontales. Ceux-ci donnent à penser que la stimulation externe et de l'inflammation peut conduire à la formation de crêtes épithéliales. En outre, les résultats d'analyse de l'image a montré que JE était seulement d'environ 1 mm de longueur, 60 um de largeur et de 15 à 20 couches de cellules profondes. Ce résultat a montré que le volume de tissu JE était extrêmement faible et difficile à recueillir, qui est l'une des principales raisons pour lesquelles JE est difficile à étudier. D'autre part, les cellules EJ et HES ont été isolées et cultivées in vitro. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.
