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fréquence du micronoyau chez les enfants exposés à la combustion de la biomasse dans la région amazonienne du Brésil juridique: un study

 

Résumé de l'arrière-plan
L'Amazone de cas de contrôle représente une superficie de 61% du territoire brésilien et subit des changements majeurs résultant de désordre économique développement, en particulier l'avancée de l'agrobusiness. Composition de l'atmosphère est contrôlée par plusieurs processus naturels et anthropiques, et les émissions de combustion de la biomasse est l'une avec l'impact majeur sur la santé humaine. Le but de cette étude était d'évaluer le potentiel génotoxique des polluants atmosphériques générées par la combustion de biomasse à travers le test du micronoyau dans les cellules buccales exfoliée d'écoliers dans la région amazonienne du Brésil.
Méthodes
L'étude a été réalisée pendant les saisons sèches dans deux régions de l'Amazonie brésilienne. L'essai a été effectué sur les cellules épithéliales buccales de vieux 574 écoliers entre 6-16 ans.: Résultats
Les résultats montrent une différence significative entre les fréquences du micronoyau chez les enfants exposés à la combustion de la biomasse par rapport à celles d'une zone de contrôle.
Conclusions
La présente étude a démontré que, dans la biosurveillance situ en utilisant une analyse de coût sensible et faible (test du micronoyau buccal) peut être un outil important pour le suivi de la qualité de l'air dans les régions éloignées. Il est difficile d'attribuer l'augmentation de la fréquence des micronoyaux observés dans notre étude à tout élément toxique spécifique intégré dans les matières particulaires. Toutefois, la contribution de la présente étude réside dans la preuve que l'augmentation de l'exposition aux particules fines génère une fréquence de micronoyaux accrue dans les cellules épithéliales orales des élèves
matériel supplémentaire électronique
La version en ligne de cet article (doi: 10. . 1186 /1472-6831-12-6) contient du matériel supplémentaire, qui est disponible pour les utilisateurs autorisés.
Background The Amazon étend de l'océan Atlantique aux pentes orientales des Andes, avec 61% de la zone appartenant au Brésil, où il est appelé l'Amazonie brésilienne. La région a été affectée de l'environnement en faisant progresser le développement économique, en particulier l'agro-industrie et de l'élevage. Cela a provoqué des changements dans l'utilisation des terres, ce qui entraîne une augmentation de la déforestation et l'augmentation de la combustion de biomasse dans les deux forêts et les pâturages des zones indigènes [1, 2]. Plusieurs études montrent que la formation des pâturages est la principale utilisation des terres dans les régions nouvellement déforestées [3]. La canne à sucre est un exemple de l'agro-industrie qui est en expansion rapide dans le biome amazonien, entraîné par l'incitation politique à produire et à consommer de biocarburants à l'échelle nationale et internationale. Le Brésil est l'un des plus grands producteurs de biocarburants dans le monde, avec plus de production concentrée dans la région du Midwest. Bagasse brûlant au moment de la récolte est largement pratiquée dans la production brésilienne pour faciliter la récolte et d'augmenter le rendement de la coupe manuelle; cependant, cette archaïques procédure entraîne une augmentation des concentrations de polluants dans l'atmosphère [4-7] La ​​biomasse de la combustion de. est un processus de combustion de la matière organique qui se caractérise par une composition multi-élémentale et la distribution granulométrique [8, 9], ce qui représente un exposition combinée à plusieurs polluants et effets sur la santé associés à l'exposition multiple. PM a la capacité d'adsorber de nombreux composés mutagènes présents dans l'environnement et les transporter à travers les branches respiratoires à la membrane basale capillaire alvéolaire [10]. de fines particules fines et ultra sont particulièrement toxiques pour les cellules [11]. La présence d'un mélange complexe de polluants de l'air peut être en mesure, à des concentrations élevées ou après une exposition à long terme, à induire des lésions génotoxiques dans les cellules humaines [12]. Les dégâts génotoxique principale générée par l'exposition à des polluants provenant de la combustion de biomasse sont des types oxydatives de dégâts. (Par exemple: 8-oxodG) et la formation d'adduits de l'ADN qui, si elles ne sont pas réparées peut provoquer une mutation dans l'ADN [13-15]
Parmi les bioessais utilisés pour évaluer l'impact des facteurs environnementaux, génétiques et de style de vie sur la stabilité génomique chez l'homme, le test du micronoyau (MN-test) a été mis en évidence pour sa facilité d'utilisation, et en exigeant que les investissements en capital plus faible associée à la précision obtenue en marquant plus grande le nombre de cellules [16]. L'utilisation de cellules épithéliales orales comme bioindicateur des dommages génotoxiques résultant de l'exposition à des carcinogènes environnementaux par inhalation et le tube digestif peut être expliquée par la capacité des cellules à métaboliser des substances cancérogènes et pour être la première barrière physique de ces voies, ce qui entraîne une plus grande incidence de la cancers humains dans les cellules épithéliales [17]. Micronoyaux (MN) sont des structures résultant de chromosomes entiers ou fragments chromosomiques qui sont en retard à l'anaphase lors de la division nucléaire, ce qui nous permet de détecter l'action des agents clastogènes et aneugéniques [17-19].
Les enfants sont plus sensibles aux effets de exposition à la pollution de l'air, notamment les maladies respiratoires en termes de danger pour la santé humaine associés à l'exposition à la biomasse des polluants brûlants [20-23]. Une étude menée par Huen et al. [24] chez les enfants et les adultes à travers le test du micronoyau oral suggéré une plus grande vulnérabilité à la pollution de l'air liée à la circulation chez les enfants. Cette sensibilité des enfants à la pollution de l'air peut être expliqué par un niveau plus élevé d'activité physique et de passer plus de temps à l'extérieur et par conséquent, ils sont plus exposés à la pollution de l'air extérieur [25], ainsi que l'immaturité des poumons et le système immunitaire [26]. Les études de biosurveillance chez les enfants sont affectés dans une moindre mesure par les facteurs confondants tels que le tabagisme et les habitudes de consommation alcoolique, l'exposition professionnelle et le style de vie (par exemple .: le type de régime), qui sont des facteurs de grande préoccupation chez les adultes [16]. La relation entre l'exposition aux polluants de l'air et la formation de micronoyaux dans les cellules buccales des enfants a été décrit par Huen et al. [24] dans l'État-Unis d'Amérique, Iurchenko et al. [27] et Maimulov et al. [28] en Russie, Sycheva et al. [29] au Vietnam et Lahiri et al. Méthodes
Site d'étude de
[30] en Inde.
Le but de cette étude était d'évaluer le potentiel de génotoxicité des polluants biomasse de combustion grâce à l'essai de micronoyau dans les cellules buccales exfoliée d'écoliers dans la région amazonienne du Brésil. L'étude a été menée dans deux zones d'essai (Tangará da Serra (TS) et Porto Velho (PV)) et une zone de contrôle (Chapada dos Guimarães (CH)). Tangará da Serra (TS) a une population de 83,431 habitants répartis sur une superficie de 11,391.314 km 2, situé dans une zone de transition entre les biomes Amazon et Cerrado et présente les caractéristiques d'une zone urbaine dans la région amazonienne; la région a la plus grande production de canne à sucre et contient les deux plus grandes usines dans le sud de l'Amazonie brésilienne [31-33]. Porto Velho (PV) a une population de 428,527 habitants répartis sur une superficie de 34,096.429 km 2, situé dans un district rural sur les rives de la rivière Madeira dans le biome amazonien; la population a des caractéristiques typiques des habitants des berges amazoniennes [33]. Les deux zones d'essai sont dans une région avec des cycles typiques de la sécheresse et de la pluie qui modifient les niveaux de pollution de l'air, et se trouve dans le chemin de dispersion du panache de pollution résultant des incendies en Amazonie légale et de la pollution des pays voisins, affectant ainsi la santé respiratoire de la la population exposée, en particulier la morbidité chez les écoliers [6, 34, 35] Chapada dos Guimarães. (CH) a une population de 17,821 habitants répartis sur une superficie de 5,983.595 km 2 et, a été choisi comme zone de contrôle due sa meilleure qualité d'air. Il n'y a pas de production ou de la canne à sucre combustion industrielle et la circulation automobile est la lumière, par rapport aux autres municipalités concernées. Il a également été choisi pour les similitudes dans les variables météorologiques (précipitations, température et humidité) par rapport à d'autres municipalités impliquées dans cette étude [6, 32, 33].
Latitude et longitude coordonnées de tous les points collectés dans les zones d'étude sont présentés dans la figure 1. Figure 1 localisation géographique des sites d'étude, délimitant la région de l'Amazonie brésilienne
. test du micronoyau dans les cellules buccales exfoliée
le MN-test a été réalisé sur les cellules épithéliales buccales de 574 enfants âgés de 6 -16 ans (446 enfants directement exposés à la combustion de la biomasse et 128 enfants vivant dans la zone de contrôle). des échantillons de cellules buccales ont été recueillies au cours de la combustion (sec) saison dans la région, qui se produit entre les mois de Mai et Octobre. Les échantillons provenant de TS et CH ont été recueillies en Août 2008, et des échantillons de PV ont été recueillies en Août 2009. Les échantillons ont été obtenus en frottant l'intérieur des joues de sujets de l'étude avec un cytobrosse. Les cellules ont été recueillies dans des flacons d'échantillons contenant 5 ml de solution tampon (EDTA 0,1 M, Tris-HCl 0,01 et 0,02 M de NaCl, pH 7) et transportés au laboratoire. Les échantillons ont été traités selon le protocole décrit par Heuser et coll. [36], et les diapositives ont été évalués selon les critères établis par Tolbert et al. [37]. Un total de 2.000 cellules /enfant ont été analysées à l'aide d'un microscope optique à un grossissement de 1000 X.
Afin de réduire les facteurs de confusion, les fumeurs d'étude exclus, les alcooliques, les patients ou les personnes avec des malformations génétiques. L'influence du pouvoir économique en tant que facteur de confusion a été évaluée à la collecte de cellules buccales dans les écoles publiques et privées lorsque cela est possible. D'autres facteurs tels que l'âge et le sexe ont également été évalués. Toutes les lames ont été analysées de façon codée par la même personne.
L'étude a été approuvée par le Comité d'éthique de l'École nationale de la santé publique (ENSP) /Fondation Oswaldo Cruz (Fiocruz) sous CAAE numéro 0054.0.031.000-08. Tous les parents /tuteurs des enfants ont été informés sur le but de l'étude, ainsi que ils ont signé un document de participation et le consentement à l'étude.
Collecte des données environnementales
Les moyens quotidiens de particules fines (PM 2.5) et des variables météorologiques (humidité et température) dans la région sous l'influence directe des bûchers et dans la zone de contrôle, pendant la saison sèche, ont été obtenus à partir de CATT-BRAMS (Couplé modèle Aerosol et Tracer Transport de l'atmosphérique régionale brésilienne système de modélisation) accessible par le intégré d'information sur l'environnement du système de santé environnementale (http:... //Sisam CPTEC INPE br /msaude /). Une description plus détaillée de ce modèle a été présenté par Freitas et al. Analyse statistique de [38].
Les données de fréquence de micronoyaux (MN ‰) ont été évalués par analyse de variance (ANOVA), suivie d'un test de comparaison de Tukey. Les données de PM 2,5 ont été évaluées par le test de Mann-Whitney. La signification a été déterminée par comparaison avec les données obtenues dans la zone de contrôle. Toutes les données ont été analysées en utilisant SPSS 16.0.
Résultats
La figure 1 montre la région amazonienne juridique et les municipalités impliquées dans cette étude, en plus de la géoréférencement de tous les points échantillonnés dans le test du micronoyau orale.
Tableau 1 montre la concentration moyenne de l'environnement (PM 2,5) et météorologiques variables modélisées par CATT-BRAMS dans toutes les municipalités étudiées (température et humidité). En ce qui concerne les variables météorologiques, nous avons observé que les profils de température et d'humidité sont très similaires dans les domaines évalués. Point de PV a montré plus forte teneur en humidité (68 et 72%) dans les deux périodes modélisées (2008 et 2009) par rapport aux autres points (CH et TS). En ce qui concerne la variable d'environnement, nous avons constaté que PM 2,5 a présenté un profil dans lequel modélisées concentrations dans les zones d'essai étaient significativement plus élevés (TS = 21 et 22 g /m 3; PV = 19 et 16 pg /m 3) que ceux trouvés dans la zone de contrôle (10 et 12 pg /m 3), à la fois pendant periods.Table 1 Répartition des données environnementales et météorologiques des sites d'étude dans les années 2008 et 2009.
données environnementales
Température (° C)
Humidité (%)

PM2.5 (ug /m3)

2008
2009
2008
2009

2008
2009
Chapada dos Guimarães (CH)
26
25
51

62
10
12
Tangará da Serra (TS)
25
24

57
68
21 ##
22 ##
Porto Velho (PV)
28
27
68
72
19 ##
16 ## obtenu
données pendant la saison sèche (mai-Octobre). ## P
& lt; 0,01 par le test de Mann-Whitney.
Les résultats présentés dans le tableau 2 montrent une différence statistiquement significative entre les MN ‰ obtenues dans les zones d'essai (TS = 1,43 ± 0,84 et PV = 1,13 ± 0,63) par rapport à la zone de contrôle (CH = 0,29 ± 0,41). Les résultats de la TS et PV ont montré une accumulation de la fréquence des micronoyaux de 4,9 et 3,8 fois plus élevée que celle observée dans la zone de contrôle, respectivement. L'étude a également évalué l'influence d'autres paramètres tels que le type d'école, sexe et âge (années) sur MN ‰. Les résultats montrent que la fréquence des micronoyaux obtenus chez les écoliers exposés à la combustion de biomasse était significativement plus élevée (TS = Ecole privée: 1,30 ± 0,4 et l'école publique: 1,46 ± 0,9; PV = école publique: 1,13 ± 0,63) que celle observée dans la zone de contrôle ( CH = Ecole privée: 0,27 ± 0,36 et l'école publique: 0,3 ± 0,44). En ce qui concerne le type d'école, les résultats ont montré aucune différence significative (p & gt; 0,05
) entre les résultats des écoles publiques par rapport aux écoles privées. Lorsque l'on compare MN ‰ obtenu dans les écoles publiques en TS et PV, on voit que la fréquence des micronoyaux des étudiants de TS (1,46 ± 0,9) était légèrement plus élevé que dans le PV (1,13 ± 0,63), mais pas de manière significative. En ce qui concerne le sexe, il n'y avait pas de différence significative entre les MN ‰ des étudiants masculins et féminins dans tous les domaines étudiés. Aucune différence en ce qui concerne le paramètre d'âge a été observée lorsque l'on compare l'âge au niveau de chaque site. En général, des différences significatives ont été observées lorsque l'on compare les données obtenues dans les sites TS et PV par rapport à CH dans tous les paramètres, sauf entre MN ‰ chez les enfants de 07 ans à partir de PV qui était non significatif par rapport au témoin (p & gt; 0,05
). Tableau 2 fréquence du micronoyau de cellules buccales exfoliée chez les enfants.
micronoyau de fréquence (MN ‰)
Chapada dos Guimarães (CH)
Tangará da Serra (TS)
Porto Velho (PV)

N

Mean

SD

N

Mean

SD

N

Mean

SD


Par le site
128
0,29
± 0,41
245
1,43 **
± 0,84

201
1.13 **
± 0,63
Autres









paramètres:










type d'école





< td>



Ecole privée 57
0,27
± 0,36
42
1,30 **
± 0,40
-
-
-


écoles publiques
71
0,30
± 0,44
203
1,46 **
± 0,90
201
1.13 **
± 0,63
Sexe









Homme
54
0,27
± 0,36
110
1,50 **
± 0,82

108
1,08 **
± 0,61
Femme
74
0,30
± 0,44
135
1,39 **
± 0,85
93
1,18 **
± 0,65
âge (années)





< td>



≤ 7
18
0,19
± 0,31
46
1.20 **
± 0,83
14
0,89
± 0,56

8-9
28
0,29
± 0,46
55
1,33 **

± 0,87
27
1,06 *
± 0,54
10-11
28

0,27
± 0,40
59
1,57 **
± 0,83
32
1.11 * *
± 0,74
12-13
27
0,31
± 0,40
57
1,54 **
± 0,92
49
1,10 **
± 0.69
≥ 14
27
0,35
± 0,43
28
1,54 **
± 0,51

79
1,22 **
± 0,58
* p
& lt; 0,05 et ** p
& lt; 0,01 par le test de Tukey. N = Nombre d'enfants examinés. SD = Déviation standard Discussion
. Parmi les rares études évaluant les dommages génétiques chez les écoliers exposés à la pollution de l'air, aucun a évalué les dommages générés par l'exposition aux polluants libérés par la combustion de biomasse dans la région amazonienne.
Une étude menée par Sisenando et al. [6] dans la même région de l'Amazonie légale a montré une délimitation de deux périodes climatiques bien définies (sèches et pluvieuses). Cette concentration fait des influences et de la dispersion des polluants, étant donné que la pollution générée par la combustion de biomasse en Amazonie atteint son apogée au cours de la saison sèche (Mai-Octobre). Résultats de PM 2,5 modélisée dans la région étude montrent que TS et les zones PV présentées valeurs beaucoup plus élevées de matières particulaires que la zone de contrôle, cette validation du choix du CH en tant que témoin dans cette étude et corrobore l'étude d'évaluation de la toxicité des Sisenando et al. [6] qui a également choisi cette même zone témoin. En ce qui concerne les variables météorologiques, les résultats présentés ne montrent aucune différence significative entre les températures moyennes modélisées entre les zones. Une humidité plus élevée à Porto Velho en comparaison à d'autres points est justifiée par le fait que la zone fait partie du biome amazonien et souffre par conséquent une plus grande influence de l'humidité provenant de la forêt amazonienne [39, 40].
fréquence de référence MN obtenu CH (zone de contrôle) est en accord avec les valeurs observées par Holland et al. [17] dans l'article de revue du projet micronoyau humain sur les cellules Exfoliated buccales (HUMN XL) en ce qui concerne la ligne de base observée dans les articles qui ont évalué les polluants environnementaux. Comparaison entre les zones exposées et non exposées à la pollution ont montré que les enfants exposés à la pollution ont une fréquence plus élevée de micronoyaux. Ces résultats corroborent les études par Maimulov et al. [28] en Russie, Lahiri et al. [30] L'Inde, Huen et al. [24] Chen et al. [41] aux États-Unis qui a évalué l'influence de la pollution de l'air dans la formation de micronoyaux chez les enfants. Le plus haut ‰ MN observée dans TS par rapport à PV mais pas significative confirme les résultats de la matière particulaire sur le modèle que TS a été la zone la plus exposée dans les deux périodes analysées. Cette différence de concentration de particules observée dans TS peut être associée à la combustion de la canne à sucre dans la région. Sisenando et al. [6] et Alves et coll. [9] ont montré la capacité génotoxique des polluants générés par la combustion de la canne à sucre dans la région en utilisant le TS bioindicator Tradescantia pallida in situ et ex situ

expériences. Alves et coll. [9] a également détecté la présence de HAP à potentiel mutagène élevé (par exemple: benzo [e] pyrène) et n-alcanes dans l'échantillon à travers des filtres en téflon dans la troposphère de Tangará da Serra pendant la saison sèche
Au Brésil,. consommation de légumes, de fruits et de protéines animales est associée à des valeurs culturelles, et la consommation de la supplémentation en vitamine est coûteuse et limitée aux personnes ayant un plus grand pouvoir d'achat. Bonassi et al. [42] dans un article du HUMN Projet XL montre que les facteurs liés au mode de vie et le régime alimentaire peuvent influencer la fréquence des micronoyaux. Dans cette étude, le facteur de l'alcool et la consommation de tabac a été réduite au minimum au moment de la collecte et le facteur culturel a été minimisée en choisissant des zones (test et de contrôle) avec des valeurs culturelles similaires. Bien que dans la région d'étude il y a une différence économique claire entre les utilisateurs des écoles publiques et privées, ce fait n'a pas fourni de différences significatives entre les deux groupes.
Plus récente publication HUMN Projet XL a montré que les personnes qui mangent régulièrement du poisson ont une fréquence de MN de base plus faible par rapport aux non-consommateurs de poissons [42].
Lorsque l'on compare la consommation des ménages par habitant de poissons entre les deux zones d'essai par, nous avons constaté que la consommation de poisson dans le PV était 2,31 fois plus élevé que dans le TS [43 ]. Cela peut aider à expliquer la faible fréquence des micronoyaux observés dans le PV. En ce qui concerne le sexe, les résultats ont montré aucune différence significative entre les hommes et les femmes. Ce résultat corrobore les articles de revue de Neri et al. [16] et Bonassi et al. [42] et ne corroborent pas l'étude de Maimulov et al. [28] qui a montré que les enfants de sexe féminin étaient plus sensibles à la pollution de l'environnement à Saint-Pétersbourg. En ce qui concerne l'âge, les résultats ont montré une augmentation légère mais non significative de la fréquence MN dans tous les domaines. Cette observation est en accord avec Bonassi et al. [42] qui a montré que la fréquence des micronoyaux augmente constamment avec l'âge. En général, des différences significatives ont été observées lorsque l'on compare les données obtenues dans les sites TS et PV avec ceux de CH dans tous les paramètres, sauf entre MN ‰ chez les enfants de 07 ans à partir de PV qui était non significatif par rapport au témoin (p & gt; 0,05
). Ce fait peut être expliqué par la petite taille de l'échantillon dans ce groupe d'âge.
Un fait qui pourrait être considéré comme une limitation de cette étude était le petit nombre d'enfants qui participent à l'étude dans l'école publique de Chapada dos Guimarães et la l'incapacité de mener l'étude à l'école privée de Porto Velho. Cependant, cette étude est marquée par le caractère de pionnier dans l'évaluation de la génotoxicité dans une zone d'accès difficile et avec peu de stations de surveillance de l'environnement.
Conclusions
En conclusion, la présente étude a montré que la biosurveillance in situ en utilisant un sensible et essai de faible coût (MN-dosage buccal) peut être un outil important pour le suivi de la qualité de l'air dans les régions éloignées ou qui n'est pas possible d'avoir une station de surveillance de la qualité de l'air. Considérant que la pollution générée par la combustion de biomasse est un mélange complexe, il est difficile d'attribuer l'augmentation de la MN ‰ observé dans notre étude à tout élément toxique spécifique dans les matières particulaires. Toutefois, la contribution de la présente étude est le fait que nous avons trouvé des preuves significatives que l'augmentation de l'exposition aux PM 2.5 génère une fréquence de micronoyaux accrue dans les cellules épithéliales orales des écoliers
abréviations
PM:.
particules
PAH:
hydrocarbures aromatiques polycycliques
ADN: acide désoxyribonucléique


MCN-test:
test du micronoyau
MN:
micronoyaux
TS:
Tangará da Serra
PV:
Porto Velho
CH:
Chapada dos Guimarães
PM2,5:
particules fines
CATT-BRAMS:
Couplé Aerosol et Tracer Transport Modèle du système atmosphérique Modélisation régionale brésilienne


SISAM:
information environnementale intégrée au système de santé de l'environnement
SPSS:
Statistical package pour les sciences sociales

ANOVA:
Analyse de variance
MN ‰:
micronoyau moyenne Fréquence
HUMNXL:
projet micronoyau humain sur les cellules buccales Exfoliated
MCN-dosage buccale:
buccal test du micronoyau
Déclarations Remerciements
Ce travail. reçu le soutien financier de Fiocruz et MCT-CNPq /CT-18, ainsi que le soutien logistique de UNEMAT et CESTEH /Fiocruz. Les auteurs sont reconnaissants aux chercheurs Eliane Ignotti, Maurecilne L. S. Carvalho, Ilio F. Carvalho et Dionei J. Silva; ainsi que les élèves Adrielle S. de Cruz, Suzan L. S. Perreira, Viviane L. Hunhoff et Ruth Ferreira pour leur soutien dans le développement de ce projet. Les auteurs sont reconnaissants pour le soutien logistique des stagiaires et Prof. Dr. Rivanildo Dallacort de UNEMAT.
Auteurs fichiers originaux soumis pour les images
Voici les liens vers les auteurs originaux soumis les fichiers pour les images. Auteurs 12903_2011_209_MOESM1_ESM.bmp de fichier d'origine pour la figure 1 Intérêts concurrents
Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun conflit d'intérêts
auteurs. Les contributions
a participé à la conception de l'étude, ont effectué des analyses, et ont rédigé le manuscrit; SRBM a participé à la conception des études, des analyses génotoxicité guidée, et a examiné les projets de manuscrits; PA a été impliqué dans la révision et la préparation du manuscrit pour publication; PHNS a été impliqué dans la révision et la préparation du manuscrit pour publication; SSH conçu l'étude, a participé à sa conception et sa coordination et contribué à la rédaction du manuscrit. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.