Contexte
Résumé
Le but de la présente étude était d'examiner les réponses in vitro de cellules de GRE au titre de la combinaison de centrifuge et les forces de compression, en fonction de leur expression de HSP70 ARNm.
Méthodes
les cellules ERM ont été positifs pour CK19 indiquant qu'elles ont été tirées de l'épithélium odontogène. les cellules cultivées ont été appliquées ERM force centrifuge et force de compression à une à trois fois par les forces mécaniques. Après l'addition des forces, les cellules ont été observées en utilisant un microscope électronique à balayage (SEM) et on a mesuré l'expression de HSP70 ARNm par RT-PCR. Aide Résultats
observation MEB ont montré les cellules ont été rasées immédiatement après l'application d'une force mécanique, mais des saillies nucléaires récupérées identique à la commande 3 heures plus tard. Une expression significativement plus élevé de HSP70 ARNm a été observée dans les cellules de la GRE sous force mécanique par rapport à la commande, mais il a diminué progressivement avec le temps. Aucune accumulation d'expression HSP70 ARNm a eu lieu avec une force intermittente. Conclusions de Toutefois, l'expression de HSP70 ARNm avec une force intermittente répété 3 fois était significativement plus élevée par rapport à la force appliquée par intermittence seulement une ou deux fois.
Ces résultats suggèrent que les cellules expriment ERM HSP70 ARNm en réponse à une force mécanique, et que la force intermittente maintient le niveau d'expression de l'ARNm HSP70.
Mots-clés
HSP70 épithéliale reste de Malassez Force mécanique in vitro centrifugation Contexte
Il est connu que l'espace du ligament parodontal (PDL) est maintenue tout au long de la vie. Certaines études ont rapporté que le reste épithéliale de Malassez (ERM) contribue très probablement à l'entretien de la largeur PDL [1]. L'ERM est séparée de gaine épithéliale de Hertwig (HERS) au stade de développement embryonnaire racine de la dent. EAÉR cellules sont étroitement liés et sont entourés par une membrane basale continue. Lorsque les cellules de la papille dentaire sont fixées à la sienne, la membrane basale interne du EAÉR est intermittente immédiatement après que les cellules commencent à synthétiser une matrice dentinaire. cellules du sac dentaire migrent ensuite entre les HERS fragmentées [2]. Après le cément synthétisé par ces cellules mésenchymateuses du sac dentaire, les cellules épithéliales agrègent pour former des amas de cellules nommées l'ERM, qui sont à nouveau entourés par une membrane basale continue et sont généralement situés près de la zone de cément dans le PDL ou dans le cément après la éruption des dents, et ne sont pas liées au vieillissement [3]. Carrie et Katchburian ont rapporté que l'apoptose des cellules ERM peut faire partie du mécanisme du chiffre d'affaires du MCE [4]. De nombreuses études ont rapporté à la fois morphologiques et des changements fonctionnels de cellules ERM dans diverses conditions in vivo [5-7]. Inoue et al. a rapporté que la régénération est survenue lors d'une cavité osseuse PDL-dent alvéolaire a été préparé, cependant, dento-alvéolaire ankylose a eu lieu 2 mois après l'opération. Ils ont observé que pas ERM existe dans le PDL régénérée et ils ont conclu que l'absence de l'ERM doit être lié avec ankylose dento-alvéolaire [5]. En outre, Yamashiro et al. a rapporté que la dénervation du nerf alvéolaire inférieur conduit à une distribution réduite de l'ERM à 1 semaine et dento-alvéolaire ankylose se produit à 6 semaines. Ils ont également confirmé que le récepteur de l'ERM était immunitaire positive pour trkA, qui montre une haute affinité pour le récepteur NGF et ils ont conclu que le nerf sensitif pourrait jouer un rôle régulateur dans le maintien de l'ERM [6]. Mine et al. observé le processus de guérison de la PDL après dent replantation chez le rat et par rapport au groupe occlus avec le groupe non-occlus. Ils ont constaté que l'ankylose alvéolo-dentaire a été clairement détectée dans le groupe non occlus, mais n'a pas été détecté dans le groupe occlus. Ils ont conclu que les stimuli occlusales favorisent la régénération du PDL et empêchent alvéolo-dentaire ankylose [7]. Ces faits suggèrent que la réduction de la distribution du MCE dans le PDL pourrait précéder l'apparition de alvéolo-dentaire et que l'ankylose des stimuli mécaniques doivent empêcher alvéolo-dentaire ankylose. Cependant, seules quelques études ont été rapportés sur les changements de l'ERM dans les différents types de forces mécaniques in vitro [8].
En général, la réponse au stress est considéré comme représentant un mécanisme de défense cellulaire contre les perturbations environnementales [9- 12]. Si les cellules sont exposées soit à une légère ou modérée, une contrainte suffisante pour en réguler l'expression des protéines de choc thermique (HSP), ils sont souvent capables de survivre à la suite, sinon létales stimuli de stress. HSP peut être exprimé par tous les types de cellules et ils jouent un rôle de protection contre une variété de facteurs nuisibles, y compris les oxydants, l'inflammation, l'hypoxie, l'hyperthermie et aussi des stimuli mécaniques comprennent la force orthodontique [10-14]. En outre, une forte apoptose induite par la force orthodontique des fibroblastes PDL, et de nombreuses cellules ERM a également diminué dans l'apoptose [15, 16]. Il a été confirmé que HSP70, qui sert à maintenir l'homéostasie a agi comme un cochaperone par HSP40, peut inhiber l'apoptose en interférant avec la fonction du facteur d'induction de l'apoptose (AIF) [17]. L'effet de HSP70 sur apoptotique protéase activant FACOR 1 (Apaf-1) représente probablement sa capacité à conférer une résistance à l'apoptose induite par le stress rapporté et son expression existe dans le PDL tout au long de la vie [18]. Le but de
la présente étude était d'examiner les réponses des cellules ERM sous forces mécaniques in vitro, en termes de l'expression de l'ARNm codant pour HSP70, qui est une protéine de résistance au stress.
Méthodes
cellules porcine ERM de culture cellulaire ont été donné par le professeur Yoshihiro Abiko (Pathologie orale de Hokkaido University Medical science). Les cellules ERM ont été cultivées dans du milieu essentiel minimum (MEM) supplémenté avec 10% de sérum de fœtus bovin (FBS) et de la gentamycine dans 75 boîtes de culture mm dans une atmosphère humidifiée de 95% d'air et 5% de CO
2 à 37 ° C. Après la sous-culture 3 fois, les cellules ERM ont été inoculées dans 35 mm plats. Lorsque les cellules ont été cultivées pendant 7 jours et a atteint 70% de confluence, ils ont été utilisés pour les expériences
expérience exploratoire:. Détermination de la force mécanique in vitro (Fig. 1)
Fig. 1 L'illustration montre les méthodes de force mécanique de l'application. Pour la centrifugation, le rotor tourne à 4800 tpm pendant 20 minutes pour charger la force mécanique (type 1). Pour la force de compression, d'un couvercle en verre, 24 x 24 mm2, 0,2 g en poids, a été placé sur la surface cellulaire pendant 20 min (type 2). Combinaison de type 1 et de type 2 (type 3)
Type 1: La force centrifuge (4800 rpm) pendant 20 min (n = 4
)
Type 2: Compresser force (20 min) (n
= 4)
type 3: Compresser la force + force centrifuge (4800 rpm) pendant 20 min (n = 4
)
pour la force centrifuge, horizontal rotor microplaques dans une centrifugeuse Hitachi (HimacCT6D®) ont été utilisés . L'expérience centrifuge mentionnée par Redlish et al. établit un modèle de pression par centrifugation des cellules PDL in vitro [19, 20]. Après que les boîtes de culture de 35 mm ont été insérés dans l'adaptateur de rotor, le dispositif a été fixé à une force centrifuge de 4800 tours par minute (47,2 kPa, de 482 g /cm 2), qui est presque identique à une force d'expansion rapide [13 ].
Pour la force, un verre de couverture compression, 24 x 24 mm 2 en taille et 0,2 g en poids, a été directement mis sur la surface des cellules (Fig. 1). Il n'y a pas eu de rapport au sujet de la force centrifuge avec des matériaux de compression. Hoshina et al. utilisé 9,0 g plaque de verre, cependant, les cellules sous la plaque de verre avec la force centrifuge a entraîné la mort [14]. Ensuite, nous avons essayé de trouver la force de compression appropriée sous 0,2 g couvercle en verre.
Pour la combinaison de la compression et la force centrifuge, un verre de recouvrement (24 x 24 mm 2, 0,2 g) a été placé directement sur les cellules et était les cellules de enlevées après centrifugation à 4800 rpm. dans chacun des 3 types ci-dessus ont été cultivées en continu pendant 12 heures et sans aucune force a été utilisée comme témoin.
comme un résultat, le type 3 a montré une expression significativement plus élevé de HSP70 ARNm que le contrôle, type1 et type2 (Fig. 2). Ainsi, nous avons décidé d'utiliser le groupe centrifugation et le couvercle en verre combiné en tant que le groupe expérimental. Figue. 2 expression HSP70 ARNm à 3 h après différents stimuli mécaniques. Type 3 montre une expression significativement plus élevé de HSP70 ARNm que le contrôle, ainsi que le type 1 et le type de couverture 2. Il n'y avait pas de différence significative entre le contrôle, le type 1 et de type 2, bien que les deux types 1 et 2 ont tendance à être plus élevé par rapport au groupe témoin. ** P
& lt; 0,01
électronique à balayage microscopique des cellules ERM de (SEM) des observations ont été observées avant, immédiatement après et 3 h après la force mécanique à l'aide d'un Elionix ERA-8900FE émission de champ faisceau d'électrons 3D rugosité de surface analyseur (4Channel 3 dimensions microscope électronique à balayage ( 4CH-3D-SEM, Elionix Co., Ltd., Tokyo, Japon) à une tension d'accélération de 15 kV. pour les observations MEB, les cellules ont d'abord été fixées avec du glutaraldéhyde à 2% pendant 1 h à 4 ° C. Les cellules ont ensuite été déshydratés dans une série graduée d'éthanol, séché par tétraméthylsilane (Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne), puis revêtu par pulvérisation avec au-Pd (Bio-Rad, Tokyo, Japon). La hauteur des cellules a été mesurée comme une coupure d'une ligne système sur le chiffre de la ligne de compteur à l'aide image J logiciel d'analyse (NIH, Bethesda, MD, USA). conception
Experimental
Experiment 1
cellules ERM ont été recueillies à l'aide racleur de cellules après l'addition de la force mécanique à 3 h , 6 h, 12 h, 24 h et 36 h, et l'expression de l'ARNm HSP70 a été mesurée. cellules ERM sans aucune force ont été utilisées comme contrôle.
Expérience 2
Expérience 2 a examiné si le nombre de forces mécaniques intermittentes influence l'accumulation de l'ARNm HSP70 (tableau 1). Le verre de couverture a été retirée après la centrifugation et la culture a été poursuivie jusqu'à ce que la prochaine force.Table conception 1 Expérience supplémentaire de l'expérience 2
Temps
Groupe 1
Groupe 2
Groupe 3
0
-
-
-
3 h
-
-
force
6 h
-
force
force
9 h
force
force
force
12 ARNm
h
ARNm
ARNm
force, Addition de la force centrifuge; un ARNm, l'isolement de l'ARN; -, Aucune force
Groupe 1: Neuf heures après la culture, une force centrifuge (4800 rpm) a été appliquée pendant 20 minutes et les cellules ont été observées 3 h après une culture continue
Groupe 2: Six heures après la culture. une force centrifuge 1 er (4.800 tpm) a été appliquée pendant 20 minutes et 3 heures après que la culture continue, un 2 e la force centrifuge (4 800 tours par minute) a été appliquée pendant 20 minutes et les cellules ont été observées 3 h . après culture continue
Groupe 3: Trois heures après la culture, un 1 er la force centrifuge (4800 rpm) a été appliquée pendant 20 min et 3 h après la culture continue, un e la force centrifuge 2 ( 4 800 tours par minute) a été appliquée pendant 20 minutes et 3 heures après que la culture continue, un 3 e la force centrifuge (4 800 tours par minute) a été appliquée pendant 20 minutes et les cellules ont été observées 3 heures après que la culture continue (tableau 1).
en temps réel transcription inverse PCR (RT-PCR)
l'ARN total a été extrait selon la méthode de guanidium acide thiocyanate /phenochloroform, en utilisant un réactif d'isolement de l'ARN total (réactif Trizol, Invitrogen, USA) selon les instructions du fabricant. Les ARN ont été reverse-transcrits en ADNc en utilisant un cycleur thermique Oligo (dT) (Invtirogen), RNase Inhibitor (Takara), la transcriptase inverse (Takara), un mélange de dNTP et un tampon PCR d'ARN (Sigma). Une analyse RT-PCR quantitative a été réalisée avec un LightCycler ™ (Roche Diagnostics, Mannheim, Allemagne) en utilisant l'ADN double brin colorant SYBR Green 1 (Roche Diagnostics) afin d'observer le niveau d'ARNm. amorce de séquence et de la taille utilisée dans cette étude sont montrés dans le tableau 2. La quantification a été effectuée en comparant les niveaux obtenus avec des échantillons standard comme une étude antérieure [21]. Dans la présente étude, les concentrations de l'ADNc dans les échantillons non stimulés ont été de 0,2, 0,5, 1,0 et 2,0 ul. Les analyses des courbes de fusion ont été effectuées après l'amplification par PCR pour confirmer et aucune amorce gradateur dans les produits de PCR. Les ratios d'expression de l'ARNm HSP70 ont été ajustées par la valeur de la GAPDH.Table 2 séquence et la taille de Primer de gène de ménage utilisé dans cette étude
Gene
Sequence
Size
HSP70
Forward
5’-CGGACGAGTACAAGGTTGA-3’
206
Reverse
5’- CTCTTTCTCCGCCAACTG-3’
GAPDH
Forward
5’-AGGGGCTCTCCAGAACATCA-3’
196
Reverse
5’-GCCTGCTTCACCACCTTCTT-3’
Les données d'analyse statistique sont présentés en moyenne ± SD. La signification des différences a été créé par ANOVA suivi par les tests de Scheffe utilisant Excel 2013 (Microsoft, Redmond, WA, USA). Les différences sont considérées comme significatives à p
& lt; 0.01.
Résultats
observations MEB
Les cellules ERM ont été étalées et des saillies du noyau et du cytoplasme aplaties étaient évidents dans le groupe témoin. Les saillies du noyau est aplatie immédiatement après la centrifugation et les saillies nucléaires ont de nouveau été observées à 3 h après la centrifugation (fig. 3). Figue. 3 observations au MEB. Les noyaux arrondis et le cytoplasme des cellules aplaties ERM cultivées ont été observées dans le groupe témoin. seules des cellules aplaties sans aucune saillie nucléaires ont été observées immédiatement après la centrifugation et quelques protubérances de noyaux ont été observés à 3 h après la centrifugation. Barre d'échelle, 10 pm
La hauteur moyenne des cellules ERM était de 1,4 ± 0,2 um dans le groupe témoin. La hauteur des cellules ERM était de 0,78 ± 0,18 um immédiatement après la centrifugation et récupéré au niveau de contrôle à 3 h après la centrifugation. La hauteur des cellules ERM immédiatement après la centrifugation était significativement inférieure à la fois le contrôle et à 3 h après la centrifugation (Fig. 4). Figue. 4 hauteur de cellule après la centrifugation. La hauteur des cellules ERM juste après centrifugation était significativement inférieure à la fois le contrôle et à 3 h après centrifugation. ** P
& lt; 0.01 Expression de HSP70 ARNm par l'expérience de forces mécaniques 1
L'expression de l'ARNm HSP70 par le groupe expérimental (centrifugation et compression) était significativement plus élevé que le groupe témoin à toutes les périodes étudiées (Fig. 5) . L'expression de l'ARNm HSP70 du groupe expérimental était la plus élevée à 3 h après l'ajout de la force. Le niveau de HSP70 ARNm d'expression n'a pas été stable et a diminué avec le temps. Figue. 5 expression HSP70 ARNm à 3 h, 6 h, 12 h, 24 h et 36 h après la force mécanique. L'expression de l'ARNm HSP70 à 3 h après la centrifugation est la plus élevée et l'expression a progressivement diminué jusqu'à 36 heures. Le niveau d'expression de l'ARNm ne reste pas constant et a disparu avec le temps. ** P
& lt; 0,01, comparativement à 3 h après l'expérience de la force mécanique 2
L'expression de l'ARNm HSP70 par le groupe de contrôle était significativement plus faible que les 3 autres groupes (p
& lt; 0,01). Il n'y avait pas de différence significative entre les 3 différents groupes de forces mécaniques (fig. 6). Le nombre de stimuli mécaniques intermittents n'a pas montré de différence en termes d'expression de l'ARNm HSP70, ce qui signifie qu'une fois que l'expression de l'ARNm HSP70 a eu lieu, il n'y avait aucune accumulation d'expression. Figue. 6 HSP70 expression de l'ARNm à 12 h après les stimuli intermittents 1. L'expression de HSP70 ARNm du groupe témoin était significativement plus faible que les 3 autres groupes. Il n'y avait pas de différence significative entre les 3 groupes différents de contraintes mécaniques. Le nombre de fois des stimuli mécaniques n'a pas montré de différence en termes d'expression de l'ARNm HSP70. ** P
& lt; 0,01
Discussion
Bien que le PDL est continuellement exposé à des contraintes mécaniques telles que les forces de compression ou forces d'extension lors de l'occlusion et à mâcher [10-12], les réponses au stress sont considérés comme représentant un mécanisme de défense cellulaire contre les perturbations dues à l'environnement l'expression régulée à la hausse des HSP [17]. Ces études ont démontré que les cellules ERM réduisent les fonctions de formation de tissu osseux et augmentent alvéolaire de la résorption osseuse et empêchent le PDL d'être sensibles à dento-alvéolaire ankylose [3, 18].
Il a été montré précédemment que les HSP jouent un rôle essentiel à maintenir l'intégrité des structures cytosquelettiques en raison de leur fonction en tant que chaperons moléculaires [9, 22]. Kaarniranta et al. ont analysé les effets de la pression hydrostatique (CV) sur l'expression du gène HSP par les fibroblastes humains primaires et a rapporté que l'expression du gène de HSP70 a été détectée dans des fibroblastes humains [23]. Leurs résultats suggèrent que HSP70 peut jouer un rôle important dans les premiers stades de l'adaptation des cellules à l'expression de chargement mécanique. De plus, Lui et Kong ont rapporté que HSP70 a été trouvé transitoirement upregulated pendant la dépolarisation et conservés AIF dans le cytosol pour éviter l'apoptose [17] Lee et l'al de.. a rapporté que l'addition d'une centrifugation intermittente à des cellules MC3T3-E1 stimulait leur activité ALP [24]. L'expression de l'ARNm HSP70 à 3 h après centrifugation a été le plus élevé, puis a diminué progressivement avec le temps jusqu'à 36 h dans cette étude. L'expression de l'ARNm HSP70 avec une force intermittente toutes les 3 h était significativement plus élevé que le contrôle, cependant, le niveau de la transcription de l'ARNm HSP70 n'a pas été maintenue. Il est suggéré que les cellules ERM répondent à chaque force mécanique, mais ils n'ont pas maintenir le niveau de la transcription de l'ARNm HSP70 dans le but de protéger et de soutenir leurs fonctions homéostatiques.
Un avantage à l'utilisation de la force centrifuge est qu'il est possible d'ajouter encore plus de force dans les cellules sans modifier les conditions de culture, telles que moins d'oxygène ou de l'alimentation appauvrie [13]. Salter et al. comme démontré l'intégrine mécanorécepteurs qui relient les composants de la matrice extracellulaire filaments d'actine dans le cytoplasme [25]. Tanaka décrit la possibilité que cette voie par l'intermédiaire de l'intégrine peut lier le noyau au mécanotransduction [26]. observations MEB dans cette étude ont montré que les saillies nucléaires dans le groupe témoin et l'aplatissement des noyaux se sont produits immédiatement après la centrifugation, mais retournés aux formes originales tout de même que le contrôle à 3 h après la centrifugation. Ceci suggère que la force centrifuge peut influencer le parcours structural des filaments d'actine immédiatement après la centrifugation, et que le réseau de transmission de signaux est activé.
Redlich et al. a rapporté que l'application d'une force centrifuge 1000 rpm pour les fibroblastes humains PDL promu la mort cellulaire de 20%, tandis que l'expression de l'ARNm codant pour le collagène de type 1, la métalloprotéinase de matrice et de l'inhibiteur tissulaire de la métalloprotéinase de matrice a été augmenté [19, 20]. Naito et al. a rapporté les effets de 4800 rpm, qui a été utilisé dans cette étude et est considéré comme similaire à la force occlusale et la force de mordre, sur les cellules souches de la moelle osseuse [13]. Ils ont conclu que les cellules soumises à une force centrifuge de 4800 tours par minute a montré une activité et l'expression de l'os liée ARNm de la protéine par rapport aux cellules centrifugées à 600 tours par minute supérieur prolifération cellulaire.
Au contraire, les cellules sous une lamelle couvre-objet comme une force de compression, comme utilisé dans cette étude, ont été rapportés par Hoshina et al. à hypoxique potentiellement devenir et sous-alimentées, mais ils ont conclu que 0,9 g /cm 2 chargement par la plaque de verre avait pas de différence en termes de morphologie cellulaire et l'analyse fonctionnelle [14]. Ils ont rapporté que la force de compression peut supprimer la différenciation cellulaire finale dans la phase de calcification des ostéoblastes. Dans cette étude, l'expression de l'ARNm HSP70 est beaucoup plus élevée dans le cas de la combinaison des forces centrifuges et de compression que la force centrifuge soit seul ou force de compression seul. Ces résultats suggèrent que la force de compression effectue d'abord des changements de l'environnement intracellulaire et que la force centrifuge modifie la structure des filaments d'actine et accélère le changement dans l'expression du gène HSP70.
Conclusions Ces résultats montrent que les cellules expriment ERM HSP70 ARNm en réponse à une force mécanique, et que la force intermittente maintient le niveau d'expression de l'ARNm HSP70. Cependant l'expression de HSP70 diminue avec le temps et, le niveau de transcription du gène HSP70 ARNm n'a pas été maintenue. Pour un examen futur, l'analyse des protéines est nécessaire
. Déclarations
Remerciements
Cette recherche a été partiellement pris en charge par un Oral Health Science Centre Grant 7 du Collège dentaire de Tokyo et par le MEXT (Ministère de l'éducation, de la culture, sports, science et technologie) du Japon, 2010-2012. Je tiens à remercier les membres du ministère de la physiopathologie clinique pour leur assistance technique
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concurrence. intérêt
les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt en compétition. les contributions de
auteurs
KM, TN et TI a conçu le plan de recherche. HK, KN et TSO effectué l'étude morphologique des cellules. HK, TSO AAW et KM effectué l'analyse de l'ARN et l'analyse statistique. KN, TN et TI a écrit le papier. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.
