Résumé
Contexte
Un certain nombre d'agents pathogènes peut provoquer la destruction grave de l'appareil parodontale au cours de la parodontite. Le but de ce travail
a été le développement d'un dispositif de diagnostic pour l'utilisation au point de nécessité pour la détection des pathogènes parodontaux pour permettre une thérapie personnalisée pour le traitement de la parodontite. Méthodes
Ce système de test est basé la réaction en chaîne par polymérase de l'ADN isolé à partir d'agents pathogènes parodontaux et a été examiné pour détecter avec précision des séquences spécifiques d'espèces sur une puce en rotation avec des réactifs lyophilisés pour une réaction en chaîne par polymérase. La préservation des réactifs a été optimisé pour assurer leur stabilité pendant le stockage.
Résultats
Dans les travaux en cours, nous avons développé un dispositif de point-of-care modèle et a montré une preuve de concept. Elle exige faible volume d'échantillon, est timesaving et peut donc faciliter le diagnostic et le traitement des maladies parodontales précoce.
Conclusions
Le dispositif développé peut fournir un diagnostic rapide de la composition et la quantité de la flore buccale des patients et pourrait aider à évaluer la stade de l'infection de la parodontite. Cela peut faciliter une optimisation des approches thérapeutiques afin d'éviter certaines des conséquences les plus graves de la maladie.
Mots-clés
quantification bactérienne parodontite PCR en temps réel microbiens diagnostic lyophilisation électronique matériel supplémentaire
La version en ligne de ce article (doi:. 10 1186 /s12903-015-0155-y) contient du matériel supplémentaire, qui est disponible pour les utilisateurs autorisés
Contexte
Environ 90% des problèmes d'expérience de la population dentaires ou orales du monde au cours de leur. durée de vie [1]. 11,2% des adultes sont touchés par la parodontite sévère, ce qui en fait un sujet pertinent dans le secteur des soins de santé dentaire [2].
Parodontite est une réponse inflammatoire complexe du corps humain contre les micro-organismes, ce qui peut conduire à la destruction du tissu sévère la cavité buccale [3]. les facteurs de risque
conduisant à des infections ont été identifiés comme le tabagisme, le diabète, l'apparition de micro-organismes spéciaux, l'obésité, psychologiques et aspects hygiéniques. En outre, les facteurs génétiques, l'âge, le sexe et l'origine ethnique pourraient également jouer un rôle dans le développement de la maladie parodontale [4].
Pour le diagnostic de parodontite, plusieurs pratiques ont été établies. examens parodontales directs comprennent la anamnèse des patients, des mesures de profondeur de sondage de poche et niveau d'attache clinique et la prise de radiographies dentaires. En outre, des tests de susceptibilité génétique ou l'examen de la microflore sous-gingivale et le fluide gingival sont des méthodes facultatives pour évaluer la maladie parodontale [5]. En fonction des résultats du diagnostic médical et le stade de la maladie, une thérapie appropriée suit. Des approches telles que l'optimisation de l'hygiène buccale, professionnelle régulière nettoyage, mise à l'échelle /débridement et le surfaçage radiculaire, l'utilisation d'antibiotiques pour contrôler la formation de la plaque bactérienne et de l'inflammation, et même dans les cas extrêmes chirurgie peut être nécessaire pour éviter la perte des dents [6].
Parmi les espèces d'environ 600-700 bactériennes qui vivent dans les zones sous-gingivales, seuls quelques-uns d'entre eux sont associés à la parodontite et peut conduire à des changements significatifs dans la communauté microbienne orale, la quantité et la composition [7, 8]. Afin d'évaluer le stade d'infection et de parodontite commencer un traitement efficace, il est utile de déterminer à la fois l'identité des espèces en interaction, ainsi que le nombre total d'agents pathogènes vivants dans les poches parodontales. Le travail présenté ici se concentre sur les espèces de bactéries montrées à être associée à la parodontite, qui peuvent être délimités en trois classes sur la base de pathogénicité: E. corrodens, F. nucleatum, P. micra
sont peu pathogènes, P. intermedia, C. rectus, E. nodatum
sont modérément pathogène et A. actinomycetemcommitans, P. gingivalis, T. denticola
organismes fortement pathogènes [9]. Malgré le fait que d'autres espèces, l'expression de marqueurs biologiques typiques et le style de vie individuelle des personnes peuvent influencer le développement de la maladie, ainsi, la détection de ces espèces de marqueur peut être une première étape dans le processus d'identification d'une maladie ou condition médicale plus en détail.
Si les types d'espèces bactériennes vivant dans les poches parodontales peuvent être identifiés, cette information peut être utilisée pour mieux classifier la nature et de la gravité de l'infection et d'adapter une thérapie personnalisée qui convient le mieux à inverser son cours [10].
Seuls quelques points de dispositifs de soins pour l'acide nucléique détection basée ont été développés et établis sur le marché jusqu'à présent. GeneXpert de Cepheid, par exemple, est un dispositif automatisé pour la réaction en chaîne par polymérase (PCR) avec des cartouches de préparation d'échantillon spécial pour les agents pathogènes de la tuberculose, le SARM ou streptocoques du groupe B. Cependant, ce système à coût élevé ne permet pas la possibilité de mettre en œuvre plusieurs réactions multiplexées en un seul essai. IQuum a récemment présenté l'analyse PCR-driven du VIH dans 1,5 h en utilisant l'analyseur LIAT et Lutz et al.
Démontré un système lab-on-a-feuille réalisant une réaction d'amplification pour le SARM en moins de 20 minutes [11]. En outre, Van Oordt et al. [12] ont rapporté en 2012 à propos d'un système intégré pour la détection d'acide nucléique ou immunoessais avec l'aide d'une plate-forme de Labdisk jetable.
Dans la présente étude, le développement d'un simple à utiliser, le système de laboratoire sur puce à faible coût pour la détection, l'identification et la quantification des bactéries parodontales est la considération primordiale dans la conception de l'essai biologique moléculaire et dispositif de diagnostic. Le système de diagnostic se compose de deux éléments principaux: une cartouche microfluidique, qui contient tous les réactifs PCR nécessaires dans un format déshydraté, et un périphérique matériel responsable de la conduite et le contrôle du flux de travail. Ce dernier est un ensemble de blocs de chauffage divisé radialement contenant plusieurs zones de température stables pour les différentes étapes de la PCR, combiné avec un moteur rotatif situé contenant un (PC), la puce de PCR de montage pour un polycarbonate. Cette puce héberge l'échantillon du patient dans des chambres de réaction et tourne à travers les zones de température sur le bloc de chauffage afin d'effectuer la PCR. Le montant de la hausse amplicon peut être détectée par des mesures de fluorescence.
Dispositifs de rotation Conceptuellement similaires existent, comme la Focus 3M ™ Integrated Cycler, qui utilise la combinaison de la force centrifuge et de l'énergie infrarouge comme source de chauffage pour la PCR. L'analyse des échantillons est réalisée soit dans un disque universel jetable pour les essais des utilisateurs ou pour des maladies particulières dans une puce avec des kits spécifiques nécessitant de nombreuses étapes de pipetage ou le refroidissement des réactifs [13]. Aussi Sun et al.
[14] a montré 2007, une puce électronique circulaire pour amplification application ferrofluides et les forces magnétiques, révélant le problème du faible débit d'échantillons.
La base d'amplification et de système de mesure de laboratoire sur puce présentée dans ce travail a le potentiel d'optimiser le diagnostic de parodontite classiques à l'avenir en réduisant au minimum laboratoire étapes de manipulation et de permettre la réalisation rapide de PCR, en évitant un temps d'échantillons de patients de transport longue. En outre, la configuration à puce peut être intégrée avec des modules pour l'isolement de l'ADN dans les versions ultérieures. De cette façon, nous cherchons à éliminer les étapes fastidieuses et de main-d'œuvre au cours de la préparation des échantillons.
Méthodes
souches /conditions de culture /isolement de l'ADN bactérien
parodontite causant des bactéries ont été obtenues à partir de la collection allemande de micro-organismes et cultures cellulaires (DSMZ, Braunschweig, Allemagne) et cultivées dans un milieu approprié (voir les fichiers supplémentaires 1: Tableau S1). Colonies ou bactéries sédimentées de milieux liquides par centrifugation pourraient être choisis pour l'isolement de l'ADN. purification de l'ADN a été réalisée avec l'aide de la QIAamp Mini KitMD ADN (Qiagen, Hilden, Allemagne) selon les instructions du fabricant. le rendement de l'ADN et la pureté ont été mesurés avec l'instrument NanoDrop 1000 (Thermo Scientific, Wilmington, États-Unis).
PCR
La détection et la quantification des bactéries parodontales amplification ont été effectuées en utilisant un LightCycler 480 II. Les séquences des amorces sont données dans les fichiers supplémentaires 2: Tableau S2. Les amorces pour l'amplification du fragment d'ADN spécifique de l'espèce ont été conçus au cours de ce projet avec l'aide du logiciel Primer3. 16S Universal amorces ont été adoptées à partir de Kommedal et al. [15].
Les conditions de cyclage pour l'amplification sont les suivants: 5 minutes d'incubation initiale à 95 ° C, suivie par 40 cycles d'amplification (95 ° C pendant 10 s, 51 ° C pendant 10 s et 72 ° C pendant 15 s). Après chaque cycle PCR, une analyse supplémentaire de la courbe de fusion a été effectuée pour caractériser les molécules d'ADN produites.
Courbes standard
Pour établir des courbes standard, des séries de dilution de l'ADN bactérien allant de 2 à 2 millions d'équivalents génomiques ont été utilisés dans un quatre fois tentative pour la PCR quantitative en temps réel. Les courbes standard ont été créés par défaut avec la méthode du programme LightCycler points d'ajustement. Pour le nombre de bactéries dans l'ensemble, Porphyromonas gingivalis
servi comme représentant pour 16S PCR avec un nombre moyen de copies de quatre gènes 16S copies. La norme a été mis en place pour obtenir un numéro d'agent pathogène estimée pour la quantification. Il est connu que plusieurs copies du gène 16S peuvent se produire au sein d'un génome de procaryote, avec un maximum de 15 copies de Bacillus thuringiensis
. Ce fait rend difficile l'estimation d'un nombre de bactéries globale réaliste dans une population diversifiée de bactéries avec fortement varier le nombre de copies entre les différentes espèces. Les organismes de parodontite causant utilisés dans notre enquête sont censés être dans la gamme du nombre de copies inférieur selon les informations données dans la base de données ARN ribosomal Operon Copy Number [16]. Pour le prouver, le nombre de copies inconnu pour E. corrodens
a été déterminée au cours de ce travail. Pour les organismes non séquencés, copie la détermination du nombre peut être réalisé avec l'aide de l'analyse par transfert de Southern. Une sonde 16S peut détecter le nombre de régions équivalentes dans le génome restreint, comme indiqué précédemment par Lee et al. [17].
Southern blot
Pour déterminer 16S nombre de copies de E. corrodens
via Southern blot, environ 10 pg d'ADN ont été digérés par les enzymes de restriction Eco RI
HF, Hind III
(New England Biolabs, Ipswich, États-Unis), Nco
I, Pst
I, Xba
I (Jena Bioscience GmbH, Jena, Allemagne) et je FD (Thermo Fisher Scientific de Xho, Waltham, États-Unis) à 37 ° C pendant une nuit. Les échantillons, avec l'amplicon de PCR 16S comme témoin positif, ont été séparés sur un gel d'agarose à 1% à 4 ° C. On a préparé le gel pour le capillaire blot avec dépurination (HCl 0,25 M), la dénaturation (NaCl 1,5 M, NaOH 0,5 M) et de neutralisation (3 M de NaCl, 0,5 M de Tris-HCl), suivie d'une nuit Blot sur une membrane en nylon.
pour l'hybridation, la biotine PCR Labeling master (Jena Bioscience, Jena, Allemagne) a été utilisé pour générer une sonde. 16S amorces et l'ADN matrice de E. corrodens
ont été appliquées pour produire un amplicon biotinylé par incorporation de dUTP biotinylé pendant la PCR. La sonde a été purifiée avec le Gel NucleoSpin® et PCR Kit de nettoyage (Macherey-Nagel, Düren, Allemagne). Pour assurer une séquence cible complète pour l'hybridation, un examen des sites de coupe possibles au sein de la séquence a été réalisée: une incubation enzymatique de l'amplicon 16S avec les enzymes susmentionnées et contrôle ultérieur en comparant la taille de la bande de amplicon digéré à l'ADN de contrôle dans un agarose le gel a été effectué. Le plus après la pré-hybridation pendant la nuit à température ambiante, suivie d'une incubation de 2 heures à 42 ° C, l'hybridation avec une sonde de 200 ng /ml de tampon a été effectué. procédures d'hybridation et de détection ont été réalisées comme décrit dans le Kit biotine chromogénique Detection (Thermo Scientific, Schwerte, Allemagne), pour obtenir un précipité de couleur.
PCR-on-a-chip
La PCR a été mis en œuvre sur 1 mm d'épaisseur PC puces avec des cavités qui contiennent un volume de 10 pi de mélange réactionnel. Les puces ont été scellées avec des feuilles d'étanchéité (nerbe plus GmbH, Winsen /Luhe, Allemagne) des deux côtés avec le mélange de PCR intégré.
Pour l'amplification, la puce PCR tourne sur le dispositif de thermocyclage, qui est représenté sur la figure. 1. En bref, il est composé de six blocs disposés en cercle en forme de tarte tranche de chauffage, trois d'entre eux pour la réalisation de dénaturation, recuit et allongement étapes et trois blocs supplémentaires pour la réalisation de changements rapides de température à l'intérieur des cavités. Figue. 1 périphérique thermocyclage avec différentes zones de température et une puce PCR en rotation. A gauche: un dessin schématique illustre l'agencement des éléments chauffants (Ta = température de recuit) et le détecteur de fluorescence. Une puce de rotation passe chaque zone et à 72 ° C, le signal de fluorescence est mesuré. L'image de droite montre le laboratoire mis en place, y compris le moteur et le contrôle de la température de conduite
Pour preuve de concept de l'appareil, une PCR bien établie de S. aureus
(ATCC 2592), avec une taille d'amplicon de 279 pb a été utilisé. Les conditions de cyclage étaient 5 min initiale de dénaturation, suivie de 30 s à chacun des séquentielles 95, 61 et 72 ° C, les étapes d'amplification pour un total de 40 cycles, avec 5 s ont passé sur les plaques situées entre chacune des trois. < lyophilisation de br> la réaction mélanger lui-même a été optimisé avec plusieurs additifs tels que décrits ci-après 'lyophilisation section' afin d'augmenter la PCR-compatibilité de PC et de permettre la lyophilisation du mélange.
Un test pour déterminer la effet de la lyophilisation de réactifs PCR sur la réaction d'amplification a été réalisée en utilisant le E. corrodens
PCR spécifique du système d'essai bien caractérisé. Le mélange de PCR contenait une concentration finale de 0,25 uM de chaque amorce, 50% 2x SBYR vert Mastermix (Roche, Mannheim, Allemagne), 5% de tréhalose, 0,25 pg /pl de BSA, 0,75% de PEG 8000, 10 ng d'ADN et le reste ddH
2O. Le mélange de la lyophilisation a été congelé à -80 ° C pendant 15 min, et enfin lyophilisé pendant trois heures dans un lyophilisateur prérefroidi. Le stockage à long-temps jusqu'à quatre mois à 4 ° C et la température ambiante ont été comparés, avec des mélanges protégés de la lumière, à la fois avec et sans l'addition de polymerase de stabilisation tréhalose, en utilisant le système LightCycler pour la PCR en temps réel. les résultats d'un contrôle négatif a été exécuté lors de la lyophilisation pour exclure toute contamination au cours du processus.
courbes standard
Pour la détection et la quantification des dix bactéries parodontite causant utilisés dans cette étude, et de déterminer les limites de détection , des analyses quantitatives de PCR ont été établies. En utilisant une série de dilutions des nombres de copies du génome bactérien, des courbes standards ont été créées en fonction des courbes d'amplification résultants. A titre d'exemple, les courbes standard de C. gingivalis et E. corrodens
sont donnés à la Fig. 2. Pour obtenir des résultats fiables et reproductibles, l'efficacité de la PCR devrait être supérieur à 1,8. Des courbes d'étalonnage ont été établies pour les bactéries périodontiques restantes de la même manière. Figue. 2 courbes standard: le point (CP) par rapport à la concentration de l'échantillon de traverser. un gingivalis C avec un rendement de 1,80 allant de 20 à 2 millions de bactéries, et (b) E. corrodens avec un rendement de 1,99 allant de 200 à 2 millions de bactéries. Toutes les données sont présentées sous forme de moyennes ± les limites de détection de DD déterminées par le LightCycler 480 II étaient les suivantes: P. intermedia
2000 copies /réaction, 20 copies /réaction de C. gingivalis, C. rectus
2 copies /réaction, A. actinomycetemcommitans
10 copies /réaction, 10 copies /réaction de P. gingivalis, E. corrodens
200 copies /réaction, P. micra
2000 bactéries, T. denticola
20000 copies /réaction, compte globale de 200 copies /réaction.
Southern Blot
La endonucléases de restriction Eco RI
, Hind
III, Nco
I, Pst I
, I et Xho de Xba
I ont été utilisés pour estimer le nombre de 16S operons présents dans le génome de E. corrodens.
Ces enzymes ont en outre été testés pour assurer qu'il n'y avait pas de site de coupe dans la région 16S où la sonde de détection hybridant au cours de la Southern Blot, afin d'empêcher l'apparition d'un trop grand nombre des bandes résultant de la liaison de la sonde pour couper des séquences cibles. Comme on le voit sur la Fig. 3, un nombre maximum de quatre bandes ont pu être détectées après la coupe avec Eco
RI, Hind
I. de III et Pst La présence de moins de bandes visibles pour la restriction avec Nco
I, I et Xho de Xba
je pourrais être le résultat de l'émergence de longs brins d'ADN contenant deux ou plusieurs régions 16S après enzymatique incubation. Selon nos enquêtes, un certain nombre de 16S opéron de quatre est très probable pour E. corrodens
, en utilisant donc P. gingivalis
, qui contient le même numéro de 16S opéron, comme le standard pour estimer le nombre de bactéries dans l'ensemble, semble être très approprié. Figue. 3 16S nombre de copies de E. corrodens déterminée par hybridation Southern. L'ADN génomique a été coupé avec 1) Eco
RI, 2) Hind
III, 3) Nco
I, 4) Pst
I, 5) Xba
I, 6) Xho
I. 7) contrôle positif. RI, Hind III et Pst
Eco
I montrent le nombre maximum de 4 bandes
PCR-on-a-chip
mesures Premières de fluorescence ont été réalisées avec le système de mesure de fluorescence Qiagen ESElog placé directement au-dessus de la zone de température C à 72 ° de l'appareil de thermocyclage, qui est responsable de l'étape d'allongement de la PCR. Le ESElog USB E470 /D520 est adapté pour la détection du SYBR colorant vert d'ADN-intercalant contenue dans le mastermix PCR.
Pour chaque cycle au cours de laquelle la puce contenant l'échantillon passe à travers chacune des différentes zones de température sur le dispositif de thermocyclage, la hausse continue de la fluorescence correspondant à la quantité de amplicon spécifique de cadeau de S. aureus à ce moment-là a été mesurée. L'augmentation résultante de la fluorescence mesurée sur 40 cycles par le détecteur peut être vu dans la figure. 4. Fig. 4 détection de fluorescence en temps réel. Singleplex PCR indiqué sur le système de laboratoire sur puce. une mesure de fluorescence exemplairement montré pour deux échantillons. b résultant amplicon sur un gel d'agarose
2% Au cours des étapes de chauffage, la formation de bulles dans les chambres de PCR a conduit à des aberrations dans le cadre de l'amplification comme le montre exemplairement dans le cycle 20 et 39 de l'échantillon 2 (voir Fig. 4a). Néanmoins, l'augmentation attendue de la fluorescence et un résultat PCR positif de la 279 région de pb ciblée de S. aureus
ont démontré dans les tests initiaux (voir Fig. 4b). Lyophilisation de
préservation de l'activité biologique de la polymerase après lyophilisation a été démontrée pendant la période examinée de quatre mois. E. corrodens évaluation PCR spécifique de
montre que ce stockage à long terme à 4 ° C après lyophilisation n'a pas conduit à des modifications de la courbe d'amplification, tandis que le stockage à température ambiante aplatie au cours typique de la courbe et sa caractéristique exponentielle augmenter. Dans ce cas, les temps réel des points de passage PCR se sont produits de façon retardée (voir la figure 5 et fichiers supplémentaires 3:. Tableau S3). Figue. 5 Test lyophilisation. Comparaison de l'activité de la polymérase après 1 (a) et 4 (b) des mois de stockage) le stockage lyophilisé mixes.1-3 PCR à 4 ° C, 4) de stockage à 4 ° C sans addition de tréhalose, 5-7 ) le stockage à température ambiante, 8) de stockage à température ambiante sans addition de tréhalose, 9) PCR témoin négatif, 10) contrôle négatif conservé à 4 ° C, 11) contrôle positif après lyophilisation
l'ajout de tréhalose au mélange PCR révélée essentielle pour le stockage à long terme, en particulier à la température ambiante. Discussion et conclusions Amplification avec le mélange de réaction sans tréhalose conduit à un signal faible, des niveaux inférieurs globaux de fluorescence et CPs retardée après stockage à température ambiante pendant quatre mois.
parodontite est une maladie omniprésente dans le monde entier avec la nécessité de diagnostics efficaces un traitement rapide et l'inhibition de la progression afin d'éviter la perte des dents. En outre, les infections buccales peuvent potentiellement conduire à des maladies secondaires graves comme la septicémie, systémique ou d'un trouble cardio-vasculaire et la pneumonie [18].
Afin de faciliter la détection et la quantification des espèces de bactéries indicatrices de la maladie, nous avons développé une PCR-driven dispositif de point-of-care pour l'identification des agents pathogènes parodontite associée et a montré des fonctionnalités de base.
le test de PCR quantitative pour les souches bactériennes a été développé avec succès et les courbes standard ont été mis en place avec le système LightCycler. Pour la quantification absolue, des concentrations inconnues d'échantillons peuvent être comparés avec des courbes standards déjà établis, où au moins un échantillon standard unique de concentration connue tombant dans la plage de la courbe importée doit être inclus dans chaque essai PCR pour servir de référence. Ximénez-Fyvie et al.
Déjà montré en 2000 que les échantillons de plaque sous-gingivale des patients en bonne santé contiennent souvent le nombre de bactéries beaucoup plus faibles, de sorte que les limites de détection obtenus ici de seulement deux bactéries dans certains cas, sont aptes à analyser le souvent très élevé la charge bactérienne dans les cas de parodontite existantes [19]. Développer le dispositif comporte en outre, la procédure de quantification décrite sera transférée sur le dispositif de point de soins pour permettre l'analyse d'échantillons de patients dérivés dans le futur.
Analyse par transfert de Southern pourrait identifier quatre copies de la région 16S dans le génome de E. corrodens
. Cette méthode évite le séquençage du E. complète corrodens
génome, dont la séquence complète est pas encore disponible. Toutefois, ce nombre pourrait être plus élevé dans le cas de la coupe incomplète par les enzymes de restriction ou dans le cas de deux ou plusieurs zones de 16S étant situés sur un fragment d'ADN résultant de digestion de restriction. Néanmoins, ces résultats montrent que l'utilisation de P. gingivalis
comme représentant pour les bactéries parodontopathogènes est approprié pour générer la courbe standard pour le nombre de bactéries globales avec 16S typiques nombre de quatre exemplaires. L'utilisation de cette bactérie pour la génération d'une courbe standard universel pour l'évaluation de la numération microbienne totale a déjà été décrit par Kirakodu et al.
[20].
Comme une preuve de concept, le test PCR pourrait être représenté pour travailler dans les puces PCR en rotation sur plusieurs zones de chauffage sur un appareil de thermocyclage spécialement conçu. En raison du faible volume de réaction nécessaire et l'absence de nécessité de chauffage et de refroidissement étapes par les blocs chauffants eux-mêmes, le temps de réaction était d'un tiers plus rapide que dans les thermocycleurs classiques, même sans précautions supplémentaires prises pour optimiser les différentes étapes de la PCR.
à l'avenir, cette réaction sera optimisée avec raccourcies dénaturation /étapes de recuit et PCR-additifs ou polymérases rapides, par exemple un KAPA2G rapide DNA Polymerase (Kapabiosystems, Wilmington, États-Unis) avec un temps d'élongation d'environ 1 s /kb conduisant ainsi à une durée de réaction d'ensemble est considérablement raccourcie. En outre, une réduction supplémentaire du volume de réaction peut accélérer le transfert de chaleur, réduisant par conséquent la quantité requise de réactifs et des coûts [21].
Dans notre système de point-of-care, les étapes de pipetage pour les réactifs individuels sont minimisés conduisent à moins les sources d'erreur et d'augmenter la commodité pour l'utilisateur final. Par conséquent, l'utilisation de mélanges réactionnels lyophilisés a été testée afin de permettre le stockage à long terme. Il a été démontré que la Taq polymérase de pourraient être protégés contre la dégradation et la perte d'inactivité lorsqu'il est conservé à 4 ° C, bien qu'une certaine activité réduite était manifeste lors d'un stockage à température ambiante pendant quatre mois. Sur la base de ces résultats, le mélange de réaction est adapté pour le stockage dans les réfrigérateurs conventionnels.
Cependant, des études à long terme pour examiner la durée de conservation des mélanges de réaction sont en cours de réalisation afin de voir si Taq
est endommagé après une plus longue période de temps après le processus de déshydratation. Entreprises le système optique de détection de fluorescence a été intégrée sur le dispositif, révélant le problème de la formation de bulles au sein de l'échantillon au cours de la PCR. Mélange PCR dégazage, une teneur plus élevée en glycérol et en modifiant l'hydrophobie comme suggéré par Trung et al., Hôtels et Jankowski et al.
[22, 23] ne pas éliminer complètement ce problème et les aberrations occasionnelles au cours de mesures de fluorescence ont été observées . Retrofitting du système avec un bloc de chauffage ou d'un ventilateur à air chaud en haut de la puce avec des cavités de grande taille peut aider à prévenir l'évaporation et la formation de bulles ultérieure.
Dans le développement de ce dispositif, un module de purification d'ADN sur puce seront intégrés dans la puce et les réactions multiplex avec des sondes fluorescentes spécifiques de séquence doivent être établies afin d'éviter l'utilisation de colorants intercalants non spécifiques. En outre, des tests de biomarqueurs pourraient être mises en œuvre dans la construction de la puce, ce qui permet de caractériser et d'optimiser l'état de santé des patients.
En général, un problème important pour le traitement et la prévention de la parodontite est que, jusqu'à présent, maison standard des produits de soins dentaires, tels que des brosses à dents et la soie dentaire ne peut pas éliminer totalement la formation de plaque bactérienne et empêcher l'apparition de la maladie [9]. Les mesures thérapeutiques par exemple chirurgie, l'extraction de la dent et, éventuellement, les prothèses dentaires sont un fardeau financier énorme pour les patients ou l'assurance dentaire, si elle est achetée. Pris ensemble, cela montre l'importance de l'élaboration d'un rapide à appliquer, système de point-of-care fiable pour le diagnostic et la classification quantitative des infections parodontales afin de faciliter la mise en œuvre immédiate du plan de soins de santé optimal qui est disponible et pour le stade diagnostiqué de la maladie. Socransky et al.
[10] a montré 1998 dans leur théorie complexe qu'il ya des colonisateurs typiques au début et à la fin de la progression de la maladie parodontale, indiquant les différentes manifestations de la parodontite nécessitant un traitement individualisé respective.
Pour connaître la composition microbienne des échantillons de patients sous-gingivales, les dentistes ont généralement d'envoyer des échantillons de plaque à un laboratoire clinique. Culture, immunologique, ou l'analyse de la sonde d'ADN et des systèmes récemment plus sensibles d'acides nucléiques à base de test tels que le microIDent® (Hain Lifescience, Nehren, Allemagne) peut fournir des informations pour la thérapie optimale, mais toujours avec la nécessité et le coût de l'expédition aux laboratoires [24 ].
le modèle simple système, le point-of-care présenté ici, qui peut être facilement appliqué dans tous les cabinets dentaires, réduit à la fois le temps et les coûts pour le diagnostic et élimine la nécessité pour le transport vers des laboratoires extérieurs et facilite donc les traitements rapides cruciaux A l'avenir. En outre, la puce peut être ajusté et utilisé pour d'autres applications dans des domaines médicaux ayant un besoin pour la détection et l'analyse des agents pathogènes, tels que ceux qui causent la septicémie ou les pandémies régionales /mondiales rapide.
Disponibilité des données à l'appui
données supplémentaires des fichiers supplémentaires 1: Tableau S1, fichiers supplémentaires 2: Tableau S2 et fichiers supplémentaires 3: Tableau S3 supportant les méthodes et les résultats de cet article sont incluses dans les fichiers Excel supplémentaires
abréviations
BSA:.
de sérum albumine bovine
CP:
point de passage
PCR: Polymerase
réaction en chaîne
PC:
polycarbonate
PEG:
polyéthylène glycol
Déclarations Remerciements
Ce projet a été soutenu par le Ministère fédéral de l'économie et de l'énergie (AIF-projet KF2302705AK1). De plus, nous remercions le Dr David M. Smith pour la critique constructive et la révision du manuscrit
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supplémentaires. fichiers
fichiers supplémentaires 1: Tableau S1. Les organismes et les conditions de culture. (XLSX 11 kb) de fichiers supplémentaires 2: Tableau S2. Les séquences des amorces et des dimensions du produit. (XLSX 12 kb) Fichier supplémentaire 3: Tableau S3. Les points de passage (CP) correspondant à la Fig. 5 (XLSX 10 kb) Les intérêts concurrents
Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun conflit d'intérêts. Les contributions des auteurs
CG rédigé le manuscrit, ont effectué des expériences de lyophilisation et PCR-on-a-chip avec KN . LG a contribué à l'analyse Southern blot et JB, NL, LR ont été impliqués dans des expériences de PCR en temps réel. CB a aidé avec l'ensemble de l'appareil et a développé le logiciel pour l'analyse PCR. KV et DK conçu le projet, ont participé à la conception et la coordination. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.
