Résumé de l'arrière-plan
récepteurs Protease-activés (PARs) sont des récepteurs aux protéines G couplées avec un rôle actif dans la médiation de l'inflammation, la douleur et d'autres fonctions. L'agent pathogène par voie orale (P. gingivalis de la
) de Porphyromonas gingivalis sécrète protéases qui activent PARs. Le but de cette étude était d'élucider le rôle de PARs dans la pathogenèse de la parodontite chronique par analyse de l'expression des PARs dans les cellules humaines gingivales épithéliales (GECS) avant et après P. gingivalis de le traitement des surnageants.
Méthodes
GEC ont été isolés à partir d'échantillons sains de tissus gingivaux humains. L'expression de la Pars à GEC a été déterminé par réaction en chaîne de polymérase-transcription inverse (RT-PCR) et cytométrie de flux. L'effet des protéases de P. gingivalis a été étudiée par temps réel réaction quantitative de la chaîne transcription inverse de la polymérase (QRT-PCR) et cytométrie en flux.
Résultats de PAR-1, PAR-2 et PAR-3 ont été exprimées en GEC. PAR-4 n'a pas été trouvée à la fois par RT-PCR et cytométrie de flux. L'analyse de l'expression génique à l'aide QRT-PCR a montré une régulation à la hausse de l'ARNm de PAR-2 par rapport aux cellules témoins non traitées (P
& lt; 0,05). En revanche, l'expression d'ARNm de PAR-1 et PAR-3 était significativement régulée à la baisse (P
& gt; 0,05) en réponse à P. gingivalis
surnageant par rapport à celle des cellules témoins non stimulées. Cet effet a été abrogée par le TLCK inhibiteur de la protéase (P
& lt; 0,05). Les résultats de cytométrie de flux ont indiqué des niveaux de protéines FER compatibles avec les niveaux d'ARNm dans les résultats des conclusions de QRT-PCR.
Notre étude montre que PAR-1, PAR-2 et PAR-3 sont exprimés en GEC. Les protéases de P. gingivalis jouent un rôle dans la régulation des réponses immunitaires innées à GEC. GEC utiliser PARs à reconnaître P. gingivalis
et la médiation des réponses cellulaires impliqués dans l'immunité innée. Récepteur
Mots-clés
Protease-activé des cellules épithéliales gingivales humaines roteases le Contexte de Porphyromonas gingivalis P
récepteurs Protease-activés (PARs) sont une sous-famille des G récepteurs couplés aux protéines (RCPG) avec quatre membres, pAR-1, pAR-2, pAR-3 et pAR-4, qui jouent un rôle critique dans l'hémostase, la thrombose, le développement embryonnaire, la cicatrisation des plaies, l'inflammation et le cancer progression [1]. L'activation du RAP se fait par un mécanisme unique qui implique un clivage protéolytique spécifique de la séquence N-terminale extracellulaire par une protéase. Ce clivage démasque une nouvelle séquence N-terminale qui agit comme un ligand captif qui se lie au récepteur pour initier plusieurs cascades de signalisation [2-4]. Bien qu'ils partagent le même mécanisme d'action, il a été montré que différents FER sont caractérisées par différentes distributions et les actions biologiques et peuvent être activés par différentes protéases [5]. La thrombine est un activateur majeur de PAR-1, PAR-2 et PAR-3. D'autres activateurs importants de PAR-1 comprennent la protéine C activée (APC) et de la matrice métalloprotéinase-1 (MMP-1); tandis que la trypsine et la tryptase mastocytaire humaine active PAR-2 et de la trypsine et de la cathepsine G activent PAR-4. En termes de déclencher des réponses de signalisation en aval, PAR-1, PAR-2 et PAR-4 peut signaler de manière autonome, tandis que PAR-3 est principalement considéré comme un co-récepteur pour PAR-1 et PAR-4 [6-9]. En tant que FER sont exprimés dans une grande variété de types cellulaires, il a récemment été suggéré qu'ils jouent des rôles importants dans les processus physiologiques, tels que la croissance, le développement, l'inflammation, la réparation tissulaire et de la douleur.
L'épithélium gingival est de plus connu sous le nom le régulateur de la réponse immunitaire innée par voie orale à une variété d'agressions, telles que des bactéries et des produits chimiques. Les cellules humaines gingivales épithéliales (GECS), qui sont des facteurs clés de l'immunité innée, non seulement jouent un rôle important dans le maintien de la barrière physique entre l'hôte et l'environnement, mais aussi de participer activement dans le tissu de l'immunité innée [10, 11] en exprimant spécifiquement certains les récepteurs qui sont impliqués dans la réponse immunitaire de l'hôte. Il est largement admis que les cellules utilisent la reconnaissance des récepteurs de modèle pour identifier les bactéries dans leur environnement [12, 13]; cependant, en outre, certains agents pathogènes, tels que Porphyromonas gingivalis
(P. gingivalis
), sécrètent des protéases qui sont reconnues par les cellules via la famille de PARs [14]. RAP sont connus pour être exprimés dans l'épithélium gingival et ont été impliqués dans la pathogenèse de la parodontite [15-18].
La parodontite est une maladie infectieuse chronique qui débute comme une inflammation des tissus parodontaux et provoque finalement la résorption de l'os alvéolaire et la perte des dents. P. gingivalis
est un agent causal majeur de la parodontite chronique. Cette bactérie produit et libère une grande quantité d'enzymes protéolytiques. protéinases trypsine, appelées gingipains, produites par P. gingivalis
se sont révélés agir des agents pathogènes importants [19, 20]. Récemment, il a été démontré que gingipains sont reconnus par les cellules par l'intermédiaire de la famille des PAR, qui sont impliqués dans les processus inflammatoires dans plusieurs tissus. Toutefois, le rôle précis de Pars dans les tissus gingivaux et l'importance de RAP spécifiques dans la pathogenèse de la parodontite restent à élucider. Dans la présente étude, inverser la réaction en chaîne de transcription-polymerase (RT-PCR) a été utilisée pour étudier les taux d'ARNm de PARs et cytométrie de flux a été utilisée pour étudier les niveaux de PARs protéiques dans GEC. En outre, quantitative en temps réel RT-PCR (QRT-PCR) a été utilisée pour étudier les taux d'ARNm de PARs en réponse à surnageant exempt de cellules de P. gingivalis
afin de corroborer les rôles des protéases sécrétées.
Méthodes
GEC humaines primaires de la culture des cellules épithéliales gingivale ont été isolés à partir d'échantillons sains de tissus gingivaux humains chez des patients subissant une extraction de la troisième molaire au Département dentaire, Sir Run Run Shaw Hôpital, école de médecine, Université de Zhejiang, en Chine. Le consentement éclairé écrit a été obtenu à partir de toutes les personnes participant à cette étude. L'étude a été évalué et approuvé par le comité d'éthique de l'affilié Sir Run Run Montrer hôpital de University School of Medicine Zhejiang (20131120). tissu gingival frais a été placé dans D-Hanks contenant 300 U /ml de pénicilline G et 300 ug /ml de streptomycine et on incube à 4 ° C. Dans 1 h, le tissu a été préparé pour obtenir des cellules épithéliales. En bref, le tissu a été coupé en petits morceaux (1 mm x 1 mm), traités avec une solution de 25% dispase II (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) et incubées pendant 18 h à 4 ° C. Après incubation, la couche épidermique de kératinocytes humains a été soulevé du derme et placé dans un tube de centrifugation stérile de 15 ml contenant 2 ml de trypsine-EDTA. Le tissu a été mis à incuber à 37 ° C pendant environ 10 min. Par la suite, GEC isolés ont été ensemencées dans des flacons T-75 (BD Biosciences) à une densité cellulaire d'environ 3 × 10
6 cellules par flacon dans 10 à 15 ml de milieu de kératinocytes exempt de sérum (kératinocytes SFM) à laquelle les suppléments sont ajouté selon les instructions du fabricant (Gibco BRL, Life Technologies, Rockville, MD, USA). Fluides dans les flacons ont été échangées pour un milieu complet frais et gazés avec 5% de CO 2 tous les 2-3 jours. Les cellules ont été repiquées lorsque 75-80% de confluence a été atteinte.
Transcription inverse-PCR (RT-PCR) pour la détermination de l'expression PARs
Pour examiner l'expression de l'ARNm de PARs, l'ARN total a été isolé à partir de GEC (adulte à 70% de confluence) en utilisant le réactif TRIzol® (Gibco BRL, Life Technologies, Rockville, MD, USA) selon le protocole suggéré par le fabricant. La synthèse du premier brin d'ADNc et RT-PCR ont été effectuées en utilisant un kit PromeScript® RT-PCR (Takara Biotechnology Co., Ltd, Dalian, Chine). Les amorces pour PAR-1, PAR-2, PAR-3, PAR-4 et β-actine ont été synthétisés par Sangon Biotech Co., Ltd (Shanghai, Chine; tableau 1). Pour l'amplification de PAR-1, PAR-2 et des produits de ß-actine, la PCR a été réalisée pendant 30 cycles. Le premier cycle comprenait une étape de dénaturation de 5 min à 94 ° C. Cycles 2-30 avaient une étape de dénaturation de 30 s à 94 ° C, 30 s d'hybridation à 60 ° C et 45 secondes d'allongement à 72 ° C. Le dernier cycle comprenait une étape d'allongement de 10 min à 72 ° C. Pour PAR-3 et PAR-4 amplification, PCR a été réalisée pendant 30 cycles. Le premier cycle comprenait une étape de dénaturation de 5 min à 94 ° C. Cycles 2-30 avaient une étape de dénaturation de 30 s à 94 ° C, 30 s d'hybridation à 65 ° C et 45 secondes d'allongement à 72 ° C. Le dernier cycle comprenait une étape d'allongement de 10 min à 72 ° C. produits d'ADN et marqueur de poids moléculaire DL1,000 ™ marqueur d'ADN (Takara Biotechnology Co., Ltd, Dalian, Chine) ont été séparés dans un gel d'agarose à 1,5%, après quoi les gels ont été colorés avec GelRed ™ et visualisés sous light.Table UV 1 Oligonucleotide séquences utilisées pour la RT-PCR
Amorces
séquence oligonucléotidique
Longueur (pb)
Sense (5 'à 3')
antisens (5 'à 3')
PAR-1
CCCGCAGGCCAGAATCAAA
AAAGGGGAGCACAGACACAAACAG
395
PAR-2
CTACTCAGATGACCCCAGAAACT
CCCAAAGTGCTAGGATTACAGG
399
PAR-3
GGCTGGACAGGAGCCACGAT
AGCGGTTGATGCTGATGCAGG
403
PAR-4
GGATCGCCTACCACCTGCGTG
CCCGTAGCACAGCAGCATGG
401
β-actin
AGGGGCCGGACTCGTCATACT
GGCGGCAACACCATGTACCCT
202
culture et surnageants Bactéries collection
P. gingivalis
ATCC 33277 a été acheté auprès de la American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) et en anaérobiose cultivées (80% N 2, 10% H 2 et 10% de CO 2) dans une infusion cœur-cervelle (BHI; Oxoid) d'une plaque de gélose contenant 5% de sang de mouton défibriné enrichi avec 5 g d'extrait /l de levure, 5 mg /l hémine et 10 mg /l de ménadione (Sigma ALDRICH, Dorset, Royaume-Uni) à 37 ° C pendant 5 semaines. Les cultures liquides ont été préparées par inoculation de colonies bactériennes (3-4 jours) à partir de plaques de gélose au sang dans 10 ml de bouillon BHI supplémenté avec 5 g d'extrait /l de levure, 5 mg /l hémine et 10 mg /l de ménadione et incubées pendant 24 h . Dix pour cent inoculum a été transféré dans 90 ml du même milieu et incubée pendant 6 jours. Après cette période de culture, les bactéries ont été récoltées par centrifugation à 10 000 g
pendant 15 min à 4 ° C et les surnageants ont été collectés, stérilisé par filtration sur un filtre de 0,2 mm et conservé à -80 ° C jusqu'à utilisation. Avant le traitement, aliquotes du surnageant ont été utilisés pour la pré-incubation (10 min) avec 1 mmol /l de la tosyl-L-lysine chlorométhylcétone inhibiteur de sérine et cystéine protéase (TLCK; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), qui inhibe gingipains [15, 21].
Caractérisation des surnageants de culture bactérienne et le traitement
les surnageants de P. gingivalis ont été dilués dans du milieu de culture cellulaire et la concentration exprimée en tant que protéine bactérienne totale (mg /ml) présente dans les cultures cellulaires. La concentration en protéine a été déterminée avec un kit BCA Protein Assay (Pierce, Rockford, IL, USA). L'absorbance a été mesurée à 562 nm sur un lecteur de plaque SpectraMax® Plus. L'activité de protease a été mesurée avec un kit Protease Assay ™ (G-Biosciences, St Louis, MO, USA) [22]. L'absorbance du peptide marqué par un colorant a été mesurée à 570 nm pour la détermination de l'activité de la protéase. Chimiquement trypsine stabilisé (MSG-trypsine ™) a été fourni avec le kit comme étalon de protease générale. GEC ont été cultivées jusqu'à 80% de confluence et stimulées avec soit 50 pg /ml de protéine de surnageant de culture à partir des surnageants de P. gingivalis ou de surnageants TLCK-préincubées pendant 6 h [22]. GEC milieu non stimulées a servi de témoin pour les expériences de stimulation. Chaque expérience de stimulation a été réalisée en triple exemplaire, et des cellules de deux à cinq donneurs différents ont été testés.
Quantitative en temps réel RT-PCR (QRT-PCR)
Après la stimulation, l'ARN total a été extrait en utilisant un kit RNeasy (Qiagen, Valencia, CA, USA) et une transcription inverse en utilisant un kit Superscript RT-PCR (Takara, Tokyo, Japon). Quantitative en temps réel RT-PCR a été réalisée en utilisant la machine Applied Biosystems 7500 PCR et le kit SYBR Premix (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) selon les instructions du fabricant. PCR ont été réalisées dans des plaques à 96 puits dans un volume total de 20 ul, y compris l'ADNc et 0,8 ul d'amorces 1 pl (10 pM; tableau 2). expression de l'échantillon a été normalisée contre celle du gène de ménage β-actine, qui a été inclus dans chaque série QPCR. les contrôles de PCR ont été réalisées en utilisant de l'eau au lieu d'ADNc. Toutes les réactions ont été réalisées en double. A chaque point de temps, les expressions des ARNm sélectionnés dans les cellules incubées avec les surnageants de P. gingivalis ou surnageants TLCK-préincubées ont été calculés par rapport au gène de ménage β-actine ( t de ôc) pour chaque échantillon puis exprimée par rapport aux cellules non traitées au même point de temps en utilisant la 2 -ΔΔC
t méthode [23] .Table 2 séquences oligonucléotidiques utilisées pour le produit génique de QRT-PCR
Oligonucleotide séquence
Sense (5 'à 3')
antisens (5 'à 3’)
PAR-1
GTGATTGGCAGTTTGGGTCT
GCCAGACAAGTGAAGGAAGC
PAR-2
CCTGGCCATGTACCTGATCT
GACACTTCGGCAAAGGAGAG
PAR-3
GGTGTGGGCAACAGTTTTCT
GGACTCGCAAGTGTTGTGAA
β-actin
AGGGGCCGGACTCGTCATACT
GGCGGCAACACCATGTACCCT
Cytométrie en flux Les cellules ont été lavées dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), incubées pendant 30 min à 4 ° C avec du PBS contenant 20% de sérum humain normal inactivé par la chaleur, on le lave à nouveau, puis incubées pendant 30 min à 4 ° C avec 15 nM d'anticorps monoclonaux spécifiques (mAb) à pAR-1-4 humaine (PE-conjugué; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA). cytométrie de flux analyses ont été effectuées sur un FACScan (BD Biosciences, San Jose ., CA, USA) les cellules témoins incubées avec des anticorps non spécifiques PE-conjugués obtenus à partir des mêmes fabricants ont été utilisés pour définir le seuil pour le paramètre de fluorescence, de telle sorte que la fraction de cellules avec une fluorescence positive était & lt; 2,5% des cellules totales. le pourcentage de-1-4 pAR cellules positives a été déterminée à partir de la fraction de cellules dans l'échantillon incubé avec des anticorps spécifiques qui ont dépassé le seuil de l'intensité du signal de fluorescence obtenue avec l'échantillon témoin.
analyses statistiques
Toutes les données sont présentée comme la moyenne ± l'écart type (SD). données QRT-PCR sont exprimés en C
t (seuil de cycle), ôc
t (C
PAR t ARNm - C
t β- actine) et la quantification relative (RQ, exprimés en facteur de changement). Les changements de pliage d'expression PARs ARNm ont été calculées en utilisant le -ΔΔC
t la méthode 2 [23]. t de Student
-test a été utilisé pour la comparaison entre les deux groupes. Résultats de SPSS, version 19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) a été utilisé pour l'analyse statistique et P
≤ 0,05 a été considérée comme statistiquement significative.
RT-PCR analyse des PARs en GEC
RT analyse -PCR de l'ARN extrait de GEC a révélé la présence de PAR-1, PAR-2 et de l'ARNm de PAR-3 (Fig. 1). Aucun produit PCR n'a été trouvée pour PAR-4 (Fig. 1). Le résultat montre que RAP-1, PAR-2 et PAR-3 sont exprimés en GEC, mais PAR-4 est pas. Figue. Une analyse par RT-PCR de l'ARNm dans le FER GEC. La RT-PCR a été réalisée en utilisant les amorces spécifiques pour chaque type de PAR, comme décrit dans le Tableau 1. Les produits de PCR ont été soumis à une électrophorèse à travers un gel d'agarose à 1,5%. Les lignes 1-6 représentent β-actine, PAR-4, PAR-3, PAR-2, PAR-1 et Marqueur séparément. analyse RT-PCR a révélé la présence de PAR-1, PAR-2 et PAR-3 ARNm dans GEC. Aucun produit PCR n'a été trouvée pour PAR-4
surnageant de P. gingivalis modifie l'expression des gènes PARs
L'activité protéolytique du surnageant de P. gingivalis
a été démontrée après 4, 8 et 16 h. La pré-incubation du surnageant avec le TLCK inhibiteur de protéase a montré significativement réduit l'activité protéolytique par rapport à celui natif dans le surnageant après 4 et 8 h (P
& lt; 0,05; fig. 2). Pour évaluer l'effet des P. gingivalis
surnageant sur l'expression de PAR-1, PAR-2 et PAR-3 ARNm, GEC ont été cultivées à 80% de confluence et stimulées avec le surnageant pendant 6 h. L'analyse de l'expression génique à l'aide QRT-PCR a montré une régulation positive de l'ARNm de RAP-2 par rapport aux cellules témoins non traitées (P
& lt; 0,05; fig. 3b). En revanche, l'expression d'ARNm de PAR-1 et PAR-3 ont été régulés à la baisse de manière significative (P
& lt; 0,05) en réponse à P. gingivalis
surnageant par rapport à celle des cellules témoins non stimulées (Fig. 3a, c), . La pré-incubation du surnageant des P. gingivalis avec l'inhibiteur de protéase a aboli l'effet TLCK et rétablit les niveaux d'expression d'ARNm de FER à celle des cellules non traitées. Les contrôles établissent en utilisant un milieu bactérien vierge et TLCK montré aucun effet sur l'expression de l'ARNm du PAR-1, PAR-2 et PAR-3 (Fig. 3). Les résultats étaient cohérents avec les études précédentes [22]. Figue. 2 Les activités de la protéase de la surnageant de P. gingivalis ou surnageant TLCK-préincubé. L'activité de protease a été mesurée avec un kit de dosage Protease ™ et a été suivie pendant 4, 8 et 16 h. L'absorbance du peptide marqué par un colorant a été mesurée à 570 nm pour la détermination de l'activité de la protéase. natif surnageant a montré une activité protéolytique nettement plus élevé que le surnageant TLCK-préincubé après 4 et 8 heures. les mesures ont été effectuées en triple exemplaire. Les données sont montrées comme la moyenne de l'écart type (moyenne ± écart type). *, P
& lt; 0,05, par rapport aux valeurs de surnageant indigènes
Fig. 3 PAR-1 (a), le PAR-2 (b), et PAR-3 (c) de l'expression génique en réponse à P. gingivalis
surnageant. l'expression génique a été évaluée par FER quantitative en temps réel RT-PCR (QRT-PCR) en réponse au surnageant exempt de cellules de P. gingivalis et le surnageant
TLCK-préincubé dans GEC. P. gingivalis après le traitement du surnageant, l'expression de RAP-2 a été régulée à la hausse par rapport aux cellules témoins non traitées. A l'inverse, PAR-1 et PAR-3 expression était significativement downregulated. Les données sont montrées comme la moyenne de l'écart type (moyenne ± écart type). *, P
& lt; 0,05, par rapport aux valeurs témoins. Contrôle: sans stimulation de surnageant. P. gingivalis
S: P. gingivalis
surnageant
PARS expression de la protéine évaluée par cytométrie en flux
par cytométrie de flux a montré l'expression de protéines de PAR-1, PAR-2 et PAR-3 par GEC, mais pas PAR-4 expression (Fig. 4). P. gingivalis après le traitement du surnageant pendant 6 h, l'expression de la protéine de RAP-2 a été régulée à la hausse par rapport aux cellules témoins non traitées (P
& lt; 0,05; Fig. 5). A l'inverse, les niveaux de PAR-1 et la protéine RAP-3 étaient significativement régulés à la baisse après le traitement (P
& lt; 0,05). Les résultats de l'écoulement indiqué par cytométrie niveaux de protéine FER compatibles avec les niveaux d'ARNm dans les résultats de QRT-PCR. Figue. niveau 4 protéique de PARs à GEC par cytométrie de flux. a, b, c et d montrent des résultats représentatifs des analyses de la cytométrie de flux de PAR-1, PAR-2, PAR-3 et PAR-4, respectivement. Le résultat a montré GEC exprimé PAR-1, PAR-2 et PAR-3, mais pas PAR-4. Ligne noire: le contrôle isotype. Ligne verte: la figure de anti-PARs. 5 PAR-1 (a), le PAR-2 (b), et PAR-3 (c) d'expression de la protéine en réponse à P. gingivalis
surnageant. PARs expression a été évaluée par cytométrie de flux en réponse à surnageant exempt de cellules de P. gingivalis
et surnageant TLCK-préincubé dans GEC. La cytométrie en flux analyses ont été effectuées sur un FACScan. P. gingivalis après le traitement du surnageant pendant 6 h, l'expression de RAP-2 a été régulée à la hausse par rapport aux cellules témoins non traitées. A l'inverse, PAR-1 et PAR-3 expression était significativement downregulated après le traitement. Les données sont montrées comme la moyenne de l'écart type (moyenne ± écart type). *, P
& lt; 0,05, par rapport aux valeurs témoins. Contrôle: sans stimulation de surnageant. P. gingivalis
S: le surnageant de P. gingivalis
Discussion
parodontite est une infection des tissus parodontaux qui sont la structure de soutien pour les dents. Dans la structure complexe du parodonte, l'épithélium gingival est directement exposée aux bactéries parodontales et leurs produits, en recevant et en émettant des signaux, joue un rôle important dans le dialogue global qui se produit entre les pathogènes et l'hôte. FER sont exprimés et fonctionnent sur GEC en tant que partie du système d'immuno-surveillance. Ces récepteurs sont clairement importants pour les réponses GECS à l'environnement qui peuvent inclure des produits pathogènes ou physiologiques.
Quatre membres de la famille PAR (PAR-1, -2, -3, et -4) ont été identifiés à ce jour. Dans cette étude, nous avons montré que PAR-1, PAR-2 et PAR-3 sont exprimés en GEC, mais PAR-4 est pas exprimée dans GEC. De nombreux chercheurs ont déjà signalé l'expression de Pars à une grande variété de types de cellules, alors qu'il y avait une controverse au sujet de l'expression de RAP [2, 3, 13, 17]. Il y a aussi quelques études sur l'expression de PARs en GEC, mais la plupart des études ont été concernés sur l'expression et le rôle de PAR-2. Une surexpression de RAP-2 a été associée positivement aux paramètres cliniques inflammatoires et les niveaux de l'interleukine-6 (IL-6), IL-8, le facteur de nécrose tumorale alpha, la matrice métalloprotéase-2 (MMP-2), MMP-8, le facteur de croissance des hépatocytes et le facteur de croissance vasculaire endothélial [5, 24, 25]. Une seule étude a révélé PAR-1, PAR-2 et PAR-3 expression dans les cellules KB par RT-PCR et PAR-1, PAR-2 et PAR-3 expression dans GEC par des études immunohistochimiques [17]. Dans notre étude, RT-PCR et cytométrie en flux ont été utilisés pour analyser l'expression des PARs. Les résultats ont été corroborés le PAR-1, PAR-2 et PAR-3 expression dans GEC.
Dans l'épithélium gingival, cystéine protéases spécifiques de l'arginine (Arg-gingipaïne, Rgp) de P. gingivalis
, un pathogène majeur associé à la parodontite chronique, activer PARs et induire l'expression de cytokines inflammatoires [22, 26, 27]. La famille de PAR est structurellement sans rapport avec la famille des récepteurs de reconnaissance de motifs (PRR), mais, comme PRR, ils signalent un danger potentiel dans l'environnement en activant des marqueurs immunitaires innées et les réponses inflammatoires [28]. Cependant, on sait peu sur leur fonction lorsqu'ils sont activés par leur enzymes agonistes, la thrombine et la trypsine ou trypsine enzymes, dans l'épithélium gingival. FER sont exprimées par une grande variété de types de cellules et sont proposés pour jouer des rôles importants dans les processus physiologiques, tels que la croissance, le développement, l'inflammation, la réparation tissulaire et de la douleur [29]. Notre étude a démontré que l'expression de la RAP-2 a été régulée à la hausse par P. gingivalis, le traitement du surnageant par rapport aux cellules témoins non traitées. A l'inverse, PAR-1 et PAR-3 expression était significativement downregulated, après P. gingivalis
traitement surnageant. En fait, l'activation de PAR-2 a été associée à plusieurs états inflammatoires chroniques [3, 30-32]. En outre, in vitro et in vivo ont clairement suggéré que RAP-2 joue également un rôle dans l'inflammation du parodonte [15, 16, 33, 34]. PAR-1 activation, via la thrombine ou humaine activant des peptides, a été impliqué comme un régulateur potentiel de la douleur et l'inflammation [35-37]. Une étude récente a également montré que PAR-1 a été exprimée dans les tissus gingivaux [18] et PAR-1 activation par la thrombine peut jouer un rôle dans la réparation et l'homéostasie des tissus parodontaux [38]. Le rôle de PAR-3 est d'intérêt parce que la fonction de ce récepteur apparemment non-signalisation reste obscure [9, 39, 40]. La capacité de PAR-3 pour générer un signal intracellulaire reste également dans le doute parce qu'il manque le domaine de queue cytoplasmique montré dans d'autres FER, qui est nécessaire pour se coupler avec des protéines G [9]. Une étude récente a démontré que PAR-3 est un facteur déterminant de PAR-1 fonction et PAR-3 peut atténuer les effets de PAR-1 dans l'activation des réponses endothéliales, telles que l'inflammation vasculaire [41]. PAR-3 régule la signalisation PAR1 par dimérisation du récepteur. Il y a eu la controverse sur le rôle de PARs. Dans certains tissus, ils jouent un rôle de pro-inflammatoires [42], tandis que dans d'autres tissus, ils semblent avoir un effet anti-inflammatoire ou protecteur [43]. Cette fonction de protection peut être facilitée par la régulation positive de la RAP-2 et la régulation négative de PAR-1 et de PAR-3 l'expression du gène en réponse aux protéases de P. gingivalis. Conclusions de Toutefois, d'autres études sont nécessaires pour élucider pleinement les rôles de PAR-1, PAR-2 et PAR-3 dans la pathogenèse de la parodontite.
L'étude décrite ici confirme les rôles de PAR-1, PAR -2 et PAR-3 dans les réponses épithéliales gingivales qui peuvent être liés à l'inflammation parodontale. Par conséquent, les mécanismes détaillés sous-jacents aux effets induits par les principaux PARs dans la parodontite, y compris leur corrélation avec les cytokines, nécessitent des recherches plus approfondies. Cette information permettra de mieux comprendre le développement des maladies parodontales et d'informer la stratégie pour l'identification des approches thérapeutiques pour ces conditions.
Déclarations
Remerciements
Nous remercions les dentistes (département dentaire, Sir Run Run Shaw Hôpital, école de médecine, Université de Zhejiang) pour leur aide. Nous remercions le Dr Yu Yunsong et son équipe de recherche (Département des maladies infectieuses, Sir Run Run Montrer Hôpital, École de médecine, Université de Zhejiang) pour leur soutien technique. Ce travail a été soutenu par des subventions de la National Science Foundation naturelles de la Chine (n ° 81000447)
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concurrence. intérêts
Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt en compétition. Les contributions de
auteurs
Dr. Zhang a effectué les expériences et a écrit le manuscrit. Dr Li était en charge de la collecte des tissus gingivaux. Dr. Hu a aidé à effectuer les expériences. Dr. Sheng était responsable de l'analyse des données. Prof. Chen pensé et conçu les expériences. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.
