Résumé de l'arrière-plan
Un élément clé pour le succès à long terme des implants dentaires est l'intégration de la surface de l'implant avec les tissus hôtes environnantes. Modification des surfaces d'implants en titane peut améliorer l'activité des ostéoblastes, mais leurs effets sur les cellules des tissus mous ne sont pas claires. L'adhésion des kératinocytes humains et de fibroblastes gingivaux pour contrôler le titane commercialement pur (CpTi) et deux surfaces préparées par oxydation anodique a donc été étudiée. Etant donné que des piliers d'implants sont exposés à un environnement riche en bactéries in vivo
, l'effet des bactéries orales sur l'adhérence des kératinocytes a également été évaluée.
Méthodes
Les surfaces ont été caractérisées par microscopie électronique à balayage (MEB). Le nombre de cellules adhérentes et force de liaison, ainsi que la vitalité des fibroblastes et kératinocytes ont été évalués en utilisant la microscopie à balayage laser confocal après coloration avec Live Morte Bac
lumière /. Pour évaluer l'effet des bactéries sur l'adhésion et de la vitalité, les kératinocytes ont été co-cultivées avec un consortium streptococcique-quatre espèces.: Résultats
analyse SEM ont montré les deux surfaces oxydées anodiquement être nano-structuré avec des degrés de pore- différents densité. Plus de 24 heures, les deux fibroblastes et kératinocytes bien collés aux surfaces nanostructurées, bien qu'à un degré moindre que pour CpTi (fourchette 42-89% des niveaux sur CpTi). La force d'adhérence des kératinocytes est supérieure à celle des fibroblastes, mais aucune différence dans la force d'adhérence n'a pu être observée entre les deux surfaces nanostructurées et le CpTi. Le consortium de streptocoques commensal nettement réduite kératinocytes adhérence sur toutes les surfaces ainsi que compromettre l'intégrité de la membrane des cellules adhérentes.
Conclusion
Tant la vitalité et le niveau d'adhérence des cellules des tissus mous sur les surfaces nanostructurées était semblable à celui CpTi. Co-culture avec des streptocoques a réduit le nombre de kératinocytes sur toutes les surfaces à peu près au même niveau et a causé des dommages aux cellules, ce qui suggère que les bactéries commensales pourrait affecter l'adhérence des cellules des tissus mous en butée des surfaces in vivo.
Mots-clés
kératinocytes orale gingivale fibroblastes attachement cellulaire implant dentaire modification de la surface des bactéries orales matériel supplémentaire électronique
La version en ligne de cet article (doi:. 10 1186 /1472-6831-14-75) contient du matériel supplémentaire, qui est disponible aux utilisateurs autorisés.
Contexte
en raison de leurs généralement de bons résultats cliniques, les implants dentaires sont maintenant un traitement commun pour remplacer les dents perdues ou manquantes. Les éléments essentiels pour le succès à long terme de tels implants sont la formation d'une liaison stable entre le tissu osseux hôte et la surface de fixation (ostéointégration) et l'intégration du composant transmuqueuse, ou d'une butée, avec les tissus mous. Auparavant, beaucoup de recherches ont porté sur l'optimisation de l'ostéointégration, mais plus récemment, l'accent a été mis à inclure le développement de biomatériaux qui améliorent la formation d'une barrière de tissu mou péri-implantaire. Dans la cavité buccale, des butées d'implant faisant saillie à travers la muqueuse sont exposées à un milieu complexe contenant de la salive et exsudat gingival, ainsi que des micro-organismes. La charge microbienne dans la cavité orale est très élevée, et jusqu'à 700 espèces différentes ont été identifiés [1]. Après mise en place, la surface de butée devient rapidement colonisé par des bactéries orales, qui peut entrer en compétition avec les cellules des tissus épithéliaux et conjonctifs pour la liaison à la surface (pour revue voir [2]). Des exemples typiques des premiers colonisateurs sur les tissus durs et mous de la cavité buccale sont streptocoques, y compris Streptococcus gordonii
, Streptococcus oralis
, Streptococcus mitis
et Streptococcus sanguinis
, ainsi que des espèces telles que Actinomyces
naeslundii [3, 4]. Le respect de ces micro-organismes à la surface d'appui peut fournir des sites de liaison pour une nouvelle série de colonisateurs pour aboutir finalement à la formation de la plaque d'âge mûr [5, 6].
Dans les dents naturelles invasion bactérienne dans les tissus mous parodontaux est limitée physiquement par la muqueuse gingivale, ce qui forme un joint étanche autour du col de la dent. L'épithélium agit également comme une barrière physiologique grâce à la libération de molécules impliquées dans l'immunité innée, y compris des peptides antimicrobiens et des cytokines, ainsi que l'initiation des réponses inflammatoires [7]. Dans le cas des implants dentaires la barrière naturelle constituée de l'épithélium de jonction et le ligament parodontal est manquant, augmentant ainsi l'importance d'une manchette des tissus mous des cellules épithéliales et les fibroblastes étroitement attaché à la butée. Des études chez les chiens ont suggéré la muqueuse péri-implantaire peut former un joint par l'intermédiaire d'une manchette de la muqueuse bien kératinisée, analogue à celle des dents naturelles environnantes [8] et des couches de cellules épithéliales ont été identifiés en étroite association aux surfaces de titane implantées dans l'oral muqueuse [9]. Par ailleurs, l'étude histologique indiquent que les cellules epitheliales peuvent se fixer aux surfaces en titane au moyen d'hémi-desmosomes semblables à ceux trouvés dans la lame basale interne [10]. L'agencement des tissus mous à l'interface de la muqueuse a été démontré être influencée par une modification de l'implant de titane topographie de surface avec oxydation ou gravure à l'acide, ainsi que la modification chimique de laminine 5 [11, 12]. Récemment, le rôle de nanostructures sur des surfaces d'implants en titane dans la guérison des tissus est devenu un centre d'intérêt majeur. Nanostructures, y compris des nanopores et nanotubues, peuvent être créés par l'oxydation anodique, un procédé électrochimique dans laquelle les variables telles que la tension, la concentration et le temps d'électrolyte peut être modifiée pour créer différents nanotopographies. Cependant, alors que les effets des modifications au niveau du nanomètre sur l'activité des ostéoblastes ont été largement étudiés [13, 14], la connaissance de la façon dont nanostructures influencent la guérison des tissus mous péri-implantaire est actuellement limitée. Les rares in vivo
études qui ont été menées chez le rat [15], les chiens [16] ou des êtres humains [17] (Wennerberg
et al.) Suggèrent que l'utilisation de surfaces de butée nanostructuré de titane pourrait améliorer des tissus mous guérison. Une vitro
étude par Zile et al
. [18] a révélé que la densité des kératinocytes sur des surfaces nanotubulaires et nanorugueuse a été augmenté par rapport à celle sur les surfaces de titane classiques alors que pour les fibroblastes, ces études ont montré l'adhésion cellulaire accrue sur les surfaces nanostructurées préparés par oxydation anodique [19], mais a diminué l'adhésion à titane revêtements nanostructurés sur silicone [20]. Bien que ces in vitro
études en ont fait la lumière sur les effets positifs possibles de ces surfaces, in vivo
, la situation au cours des premières étapes de la guérison est beaucoup plus complexe, où l'attachement des cellules se produit en présence de bactéries orales colonisatrices début tels que les streptocoques oraux. Par conséquent, dans cette étude, nous avons étudié l'adhésion des kératinocytes humains et les fibroblastes gingivaux aux surfaces de titane nano-structurés et également évalué l'effet d'un consortium bactérien contenant Streptococcus gordonii
, Streptococcus oralis
, Streptococcus mitis
et streptocoque sanguinis
sur l'adhérence des kératinocytes à la surface.
Méthodes
titane
surfaces des disques de titane (8 mm de diamètre et 2 mm d'épaisseur) avec trois surfaces différentes ont été utilisées dans cette étude. Les disques en titane commercialement pur (CpTi) ont été utilisées comme témoins (C) et deux surfaces oxydées anodiquement (N1 et N2) ont été utilisées comme surfaces d'essai. N1 a été préparé par oxydation anodique de titane commercialement pur alors N2 a été préparé par oxydation anodique sur l'alliage de titane (TiAl
6V 4). Auger analyse par spectroscopie électronique a révélé la couche d'oxyde sur les surfaces N1 et N2 pour être supérieure à 100 contacts angles d'épaisseur et la moyenne nm pour le contrôle des surfaces N1 et N2 ne présentaient pas de différence significative (51 ° ± 2, 42 ± 1 ° , 38 ° ± 0,3 °, respectivement) [21]. Les mesures de profilométrie de la rugosité moyenne (Sa) a montré que toutes les surfaces ont une topographie lisse avec Sa de 0,18 pm pour la surface de commande et 0,17 um et 0,21 um respectivement N1 et N2 des surfaces [21]. Avant toute utilisation, les disques de titane ont été nettoyées par un traitement aux ultrasons dans 70% d'éthanol PRO-analys pendant 2 x 10 minutes, suivie d'un lavage avec de l'eau ultrapure stérile pendant un temps supplémentaire de 2 x 10 minutes. La microscopie électronique
balayage The morphologie de surface des disques de titane a été examinée à l'aide d'un Ultra microscope électronique à balayage 55 Zeiss. Les images ont été prises avec un détecteur d'électrons secondaires à 8000 grossissement en utilisant une tension d'accélération de 10 kV et une ouverture d'objectif de 30 um.
Des fibroblastes gingivaux humains
cultures de fibroblastes gingivaux humains ont été établies à partir de biopsies gingivales obtenues à partir de deux sujets sains (âgés de 11-13 ans) avec aucun signe clinique de la maladie parodontale. La Centrale d'Ethique Commission de révision suédoise, Stockholm a approuvé la collecte des biopsies et l'établissement des lignées cellulaires de fibroblaste (numéro de registre 377/98). des morceaux hachés de tissu gingival ont été explantées à 25 cm 2 flacons de culture tissulaire (Falcon) contenant 5 ml de DMEM complémenté avec de la pénicilline (50 unités /ml), streptomycine (50 ug /ml) et 5% de sérum de foetus de veau (FCS ) (Invitrogen Life Technologies, Ecosse, Royaume-Uni). les fibroblastes gingivaux obtenus par traitement à la trypsine de l'excroissance de cellules primaires ont été cultivées à 37 ° C avec 5% de CO 2 et régulièrement repiquées en utilisant 0,025% de trypsine dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 0,02% d'EDTA à 90% de confluence. fibroblastes gingivaux humains entre les 9e et 14e passages ont été utilisés dans cette étude.
kératinocytes orales humaines
kératinocytes immortalisés oraux humains normaux (OKF6 /TERT-2) [22] obtenu à partir de Dr James Rheinwald (Brigham and Women 's Hospital, Boston, USA), ont été ensemencées dans des boîtes de culture dans un milieu de kératinocytes exempt de sérum (Gibco) supplémenté avec 0,2 ng ml -1 facteur de croissance épidermique humain recombinant, 25 ug d'extrait d'hypophyse bovine ml -1 mM CaCl 0,3 2 contenant 1 UI ml de pénicilline -1 et 1 pg de streptomycine ml -1 (milieu DF-K) et cultivées dans 5% de CO 2 dans l'air à 37 ° C. Le milieu a été changé après 1 jour et tous les 2-3 jours suivants jusqu'à ce que les cellules a atteint 30-50% de confluence. Les cellules ont été repiquées en utilisant 0,05% de trypsine-EDTA (Gibco). Les disques de titane
adhésion cellulaire essai ont été placées dans des boîtes à 24 puits de culture de tissus (Becton Dickinson), ensemencés avec soit des kératinocytes ou des fibroblastes gingivaux (1 x 10 < sup> 5 cellules dans 1 ml de milieu DF-K ou DMEM supplémenté avec de la pénicilline (50 unités /ml), streptomycine (50 ug /ml) et 5% de sérum de veau foetal, respectivement) et incubées dans 5% de CO 2 l'air à 37 ° C pendant 24 heures. Ce point de temps a été choisi car un nombre suffisant de cellules avait adhéré pour que les résultats soient la division cellulaire fiable, mais peu avait eu lieu. Les disques ont été doucement lavées avec du PBS pour éliminer les cellules non-inscrits et colorées à l'aide en direct /Dead Bac
kit de coloration Light (Molecular Probes). Les cellules adhérentes ont été visualisées en utilisant un microscope à fluorescence. Pour évaluer dans quelle mesure les cellules ont été fixées au substrat, une procédure de lavage normalisée a été utilisée pour éliminer les cellules faiblement adhérentes [23]. Disques dans des boîtes de culture contenant 1 ml de PBS ont été agités à 100 tours par minute pendant 2 x 5 minutes (agitateur rotatif IKA Vibrax, GMBH & amp; Co., Allemagne). Les cellules restantes après cette procédure ont été comptées manuellement après coloration avec Live /Dead Bac
kit de coloration à la lumière et la capture d'une image par microscopie à fluorescence. Le nombre de cellules restantes après le lavage a été exprimée comme un rapport de contrôle (nombre de cellules présentes avant le lavage).
Souches bactériennes
isolats cliniques de S. gordonii
(HC7), S. mitis
(BA7), S. oralis
(89C) et S. sanguinis
(FC2) ont été utilisés dans cette étude. S.
gordonii, S. mitis
et S. sanguinis
ont été obtenus à partir de la plaque dentaire proximal, tandis que S. oralis
a été isolé à partir d'une infection péri-implantaire. S.
gordonii a été identifié par des tests phénotypiques positifs pour acétyl-glucosaminidase de N, N
-acetylgalactosaminidase, α-fucosidase et β-galactosidase en identification de S. mitis
était basée sur phénotypique positif identification de tests pour acétyl-galactosaminidase, N
-acetyl- glucosaminidase, β-galactosidase et sialidase de N. de S. sanguinis
a été basée sur des tests phénotypiques négatives pour sialidase, arbinosidase, L- fucosidase, α-glucosidase et ferme adhésion à la MSA agar et S. oralis
a été identifié sur la base des tests phénotypiques positifs pour la -acetylglucosaminidase et sialidase de N et un test négatif pour D-fucosidase, en plus de séquençage du GDH et
gènes ddl [24]. Les bactéries ont été cultivées sur gélose au sang dans une atmosphère de 5% de CO 2 dans l'air à 37 ° C. Les colonies ont été transférées dans un bouillon Bacto Todd-Hewitt (TH) (Becton Dickinson & amp; Co) et ont été cultivées pendant une nuit à 5% de CO 2 dans l'air à 37 ° C. Les suspensions ont été transférées dans un bouillon de TH frais et on fait incuber à 37 ° C jusqu'à ce que la phase de croissance semi-exponentielle a été atteint (A 600 ≈ 0,5), ce qui correspond à 10 7 cellules /ml. Se connecter cultures en phase de chaque souche ont ensuite été mélangés (1: 1: 1: 1) pour donner un consortium de quatre espèces et centrifugé (4000 g
) pendant 10 min. Les pastilles ont été ensuite remises en suspension dans un milieu de kératinocytes exempt de sérum (Gibco) supplémenté avec 0,2 ng ml -1 facteur de croissance épidermique humain recombinant, 25 ug d'extrait d'hypophyse bovine ml -1 mM CaCl 0,3 effet de 2 pour donner une concentration finale de 10 7 cellules /ml. de bactéries orales sur kératinocytes adhésion
pour étudier l'effet des bactéries buccales sur kératinocytes adhérence, les disques en titane ont été ensemencées avec 1 ml de OKF6 /tertio 2 cellules et elles ont été laissées se fixer pendant 16 heures. Après ce temps, 1 ml du consortium bactérien quatre espèces contenant 10 7 cellules dans un milieu de kératinocytes exempt de sérum comme décrit ci-dessus, ont été ajoutés et les disques ensuite incubées dans 5% de CO 2 dans l'air à 37 ° C pendant 8 heures supplémentaires. Après un temps total d'incubation de 24 heures, les disques ont été lavés doucement avec un milieu de kératinocytes sans sérum pour éliminer les cellules non-inscrits et les cellules adhérentes restantes colorées avec Live /Dead Bac
kit de coloration Light (Molecular Probes) avant la visualisation dans un microscope à fluorescence. Afin d'évaluer la force de l'attachement des bactéries cellules traitées par le substrat, la même procédure de lavage standard tel que décrit ci-dessus a été utilisé. En variante, les disques de titane ont été ensemencées avec 1 ml du consortium bactérien quatre espèces contenant 10 7 cellules dans un milieu de kératinocytes exempt de sérum (5% de CO 2 dans l'air à 37 ° C) pendant 2 heures et on le lave trois fois avec un milieu de kératinocytes sans sérum avant l'addition de 1 x 10 5 cellules dans 1 ml de milieu de kératinocytes exempt de sérum pendant 22 heures.
analyse d'image et les statistiques de les expériences ont été effectuées trois fois en utilisant la cellule indépendante et des cultures bactériennes. Pour toutes les expériences, les images ont été prises dans les mêmes vingt points normalisés sur les surfaces, en évitant le centre et les bords extrêmes des disques. Les résultats pour les surfaces d'essai ont été comparés à contrôler en utilisant ANOVA, avec un post-test de Bonferroni et les valeurs p inférieures à 0,05 ont été considérées comme significatives.
La morphologie de surface de résultats
La surface micrographies MEB du contrôle CpTi et les surfaces oxydées anodiquement, sont représentés sur la figure 1. la surface du disque de commande CpTi ont une topographie anisotrope analogue à celle des implants commerciaux usinées. Les deux surfaces oxydées anodiquement (N1 et N2) ont des pores dans la gamme de 50 nm. Sur la surface N1, le pore-densité était élevée et les pores ont été distribués uniformément sur la surface alors que sur les surfaces N2, les pores plus éparpillée et regroupés, donnant lieu à des zones de libre-pores plus grands. Figure 1 images MEB de CpTi et des surfaces oxydées anodiquement. Des images représentatives de la commande (CpTi) (C), et les surfaces oxydées anodiquement (N1 et N2). La barre d'échelle représente 1 um.
Attachement des fibroblastes gingivaux humains à des surfaces de titane nanostructurés
adhésion des fibroblastes gingivaux humains aux trois surfaces, le contrôle CpTi, N1 et N2 a été étudié. Les cellules ont été laissées adhérer pendant 24 heures avant marquage avec un bac
lumière Vivant /Mort et de la visualisation dans un microscope à fluorescence. L'analyse des images a révélé que les cellules ont une morphologie allongée caractéristique des fibroblastes (figure 2a). Sur la surface de commande CpTi, la densité cellulaire était relativement élevée (figure 2a), ce qui correspond à environ 781 ± 87 mm de cellules 2 (figure 2b). Les niveaux de couverture pour la surface N2 étaient (669 ± 26 cellules mm -2), correspondant à 85% de contrôle, alors que la couverture sur la surface N1 (328 ± 84 cellules mm -2) correspond à 42% de contrôle (Figure 2a, b). La réduction de la surface N1 est significative au niveau de 5% par rapport au contrôle. Ainsi, les fibroblastes gingivaux ont montré une capacité légèrement inférieure à adhérer à la N1 qu'à la commande et les surfaces de N2. Figure 2 Respect des fibroblastes gingivaux humains au contrôle CpTi (C) et nano-structuré (N1 et N2) surfaces. (A) des cellules adhères ont été colorées avec la lumière de Live Morte Bac /et visualisées dans un microscope à fluorescence. La barre d'échelle représente 50 um. (B) Les graphiques montrant le nombre moyen de cellules adhérentes ± SEM de trois expériences indépendantes. Les données ont été analysées en utilisant ANOVA avec post-test de Bonferroni (* p & lt; 0,05).
Un dosage basé sur le nombre de cellules prélevées par une procédure de lavage standard, a été utilisé pour déterminer la force d'adhérence des fibroblastes sur le trois surfaces. Le nombre de cellules adhérentes restantes après que le traitement a été mesurée et calculée en pourcentage du nombre initial de cellules sur la même surface. Ceci a révélé que, sur la surface de contrôle CpTi, 33 ± 0,7% des cellules restant après le lavage alors que pour les surfaces N1 et N2, les chiffres correspondants étaient de 44 ± 6,8% et 23 ± 2,7%, respectivement. Le respect de ces données indiquent qu'il n'y avait pas de différence entre la force d'adhérence des fibroblastes gingivaux au contrôle CpTi et les surfaces nanostructurées. des kératinocytes orales aux surfaces de titane
Les autres cellules des tissus mous d'importance pour intégration des implants dentaires sont des kératinocytes par voie orale, et par conséquent l'adhérence de ces cellules sur les trois surfaces a également été testée. Au bout de 24 heures, les kératinocytes sont viables et se sont révélés comme des amas de cellules avec une morphologie typique polygonale, réparties uniformément sur toute la surface des disques de titane (Figure 3a). Sur la surface de commande CpTi, le nombre moyen de cellules était de 470 ± 73 mm -2. Le nombre moyen de cellules sur la surface N1 (419 ± 107 mm -2) était similaire à celle du CpTi alors que, sur la surface N2 était un peu plus faible (284 ± 27 mm -2). Ces valeurs correspondent à 89% et 60%, respectivement, du niveau de la surface de contrôle. Aucune de ces différences est significative au niveau de 5% (Figure 3b). La force d'adhérence des kératinocytes à la surface a été examinée en utilisant le test de lavage. Des proportions semblables de cellules sont restées attachées sur toutes les trois surfaces après le lavage, ce qui suggère que la force d'adhérence des kératinocytes n'a pas été influencée par la présence de nano-structures (colonne de gauche, tableau 1). Figure 3 Respect des kératinocytes humains par voie orale à un contrôle CpTi (C) et nano-structuré (N1 et N2) surfaces. (A) des cellules adhères ont été colorées avec la lumière de Live Morte Bac /et visualisées dans un microscope à fluorescence. La barre d'échelle représente 50 um. (B) Les graphiques montrant le nombre moyen de cellules adhérentes ± SEM de trois expériences indépendantes
Tableau 1 kératinocytes sur CpTi (C) et les surfaces nanostructurées (N1 & amp; N2). Après un lavage standard, exprimée en pourcentage de la les niveaux de pré-lavage pour les kératinocytes de la même surface restant sur les surfaces après lavage
surface
- bactéries
+ bactéries
C
83 ± 5,5%
96 ± 0,3%
N1
75 ± 1,4%
83 ± 3,5%
N2
94 ± 1,5%
87 ± 4,6%
Influence de streptocoques oraux sur la liaison de kératinocytes
Dans la zone où la butée émerge à travers l'épithélium buccal, les kératinocytes attachés à la surface d'appui sont exposés à la microflore buccale. Par conséquent, on a étudié l'influence d'un consortium de premiers colonisateurs sur kératinocytes adhésion. La présence de bactéries pendant les dernières 8 heures de la période d'observation a provoqué une nette diminution du nombre de kératinocytes présents sur toutes les surfaces par rapport au niveau observé en l'absence de bactéries (figure 3b), bien que cette différence ne soit pas significative au niveau de 5% (figure 4a, b). Un petit nombre de bactéries ont été trouvées comme des grappes associées à la fois la surface de titane et les kératinocytes adhérents. Ces données suggèrent donc que la présence de bactéries, soit réduit la capacité des kératinocytes à se lier aux surfaces ou provoqué le détachement des cellules adhérentes. Fait intéressant, le noyau des kératinocytes exposés aux bactéries pendant 8 heures a montré une coloration rouge ou orange avec le bac
lumière en direct tache /Dead qui n'a pas été observé dans les kératinocytes non exposées (figure 5). Ceci indique que l'iodure de propidium a pénétré dans les cellules et est indicative d'endommagement de la membrane cellulaire. La présence des bactéries ainsi, non seulement a semblé causer une diminution nette du nombre de cellules adhérentes au substrat après 24 heures, mais également affecté la viabilité cellulaire. Pour étudier l'effet des bactéries sur la force d'adhérence des kératinocytes, l'essai de lavage a également été appliqué à des cellules préalablement exposés à la bactérie. Après ce traitement, aucune diminution significative du nombre de cellules présentes à la surface par rapport aux niveaux de pré-lavage a été observée pour l'une des surfaces (colonne de droite, tableau 1). Ces résultats suggèrent donc la bactérie n'a pas affecté la force d'adhérence des kératinocytes sur les différentes surfaces. L'adhésion des kératinocytes aux surfaces déjà colonisés par le consortium des streptocoques oraux a également été étudiée. Au bout de 2 heures, la couverture de surface par le consortium était d'environ 50%, et 20 heures après leur addition, seule adhérence sporadique des kératinocytes a été observée (données non présentées). Ainsi, la présence de bactéries colonisant les premières sur les surfaces de titane clairement inhibé la fixation subséquente des kératinocytes. Figure 4 Respect des kératinocytes humains par voie orale à un contrôle CpTi (C) et nano-structuré (N1 et N2) surfaces incubé avec un consortium de streptocoques oraux. (A) des cellules adhères ont été colorées avec la lumière de Live Morte Bac /et visualisées dans un microscope à fluorescence. La barre d'échelle représente 50 um. (B) Les graphiques indiquant le nombre moyen de cellules adhérentes ± SEM de trois expériences indépendantes.
Figure 5 Effets d'un consortium de streptocoques oraux sur des kératinocytes. kératinocytes orales humaines ont été cultivées sur des surfaces de contrôle (C) en l'absence (panneau de gauche) ou en présence (panneau de droite) d'un consortium de streptocoques oraux. La barre d'échelle représente le rapport de 50 um.
Auparavant, beaucoup de travail a mis l'accent sur la modification de TiO 2 surfaces pour améliorer ostéo-intégration et les études ont étudié à la fois l'adhésion des ostéoblastes in vitro
[13, 14] et le tissu intégration in vivo
[25]. Cependant, il existe encore d'importantes lacunes dans nos connaissances en ce qui concerne l'adhérence et la fonction des cellules des tissus mous à l'interface d'appui-muqueuse. Dans cette étude, l'adhésion des kératinocytes et des fibroblastes à deux surfaces; formé par une oxydation anodique sur CpTi (N1) et d'autre part, formé par oxydation anodique d'un alliage de titane (N2), a été comparée à celle d'une surface de contrôle de CpTi. Les deux surfaces modifiées étaient nano-structurées avec des pores dans les 50 nm gamme couvrant toute la surface. Toutefois, ils diffèrent dans les pores densité, avec des pores plus faible densité et distribués avec les grandes surfaces sans pores du N2 plutôt que sur la surface N1. Ainsi que des modifications à l'échelle nanométrique, l'oxydation anodique peut provoquer des changements dans la surface du matériau en vrac, et de TiO 2 Les couches superficielles de N1 et N2 ont été démontrées pour contenir des niveaux plus élevés d'anatase cristalline que le contrôle CpTi [21]. Bien que les effets cytotoxiques sur les bactéries ont été observées en présence d'un rayonnement UV [26], on sait peu sur les effets de anatase de surface associée à des cellules eucaryotes. Dans cette étude, cependant, les N1 et N2 surfaces anatase riches ont démontré aucun effet cytotoxique sur soit des fibroblastes ou des kératinocytes.
Le schéma de liaison des fibroblastes gingivaux humains était quelque peu différente de celle des kératinocytes. Les fibroblastes et les kératinocytes sont capables de se lier à la commande CpTi et les surfaces nano-structurées. Cependant, alors que le niveau d'adhérence des fibroblastes aux surfaces N2 était similaire à celle sur le contrôle CpTi, adhérence à la surface N1 a été significativement réduite. Pour les kératinocytes, même si le nombre de cellules a été un peu plus bas sur la N2, il n'y avait aucune différence significative dans la densité cellulaire globale sur les surfaces nanostructurées par rapport à celui du contrôle CpTi. Les données montrent ainsi que la présence et la distribution des pores eu aucune influence sur l'adhésion des kératinocytes orales alors que pour les fibroblastes gingivaux, une forte densité de pores adhérence réduite. Cela donne à penser que la liaison des fibroblastes gingivaux a été affecté par la nature du substrat, alors que celui des kératinocytes n'a pas été influencé dans la même mesure. Dans une étude réalisée par Ma et al.
, La présence de nanotubules avec un diamètre d'environ 100 nm réduit l'adhérence des fibroblastes par rapport à un contrôle de titane poli [27] tandis que Guida et al
. a montré une augmentation de fibroblaste adhérence aux surfaces nanostructurées oxydés par rapport à des contrôles de titane tournés [19]. Conclusions concernant les effets des nano-structures sur la fonction de fibroblaste sont donc difficiles à tirer de la littérature actuelle. Pour les kératinocytes, les données sont limitées, mais Zile et al
. [18] ont montré que les surfaces de titane nano-tubulaires favorisent l'adhérence par rapport aux surfaces de nano-lisses classiques. Dans cette étude, le nombre de kératinocytes adhérents à la surface en titane classique était comparable à celle observée pour les surfaces de commande de leur étude, même si aucune augmentation de la densité cellulaire sur les surfaces nanostructurées utilisées ici ont été observées.
La formation de un joint d'étanchéité entre l'implant et les tissus mous environnants devrait contribuer au maintien des tissus sains autour d'un implant [28, 29]. Des études menées chez des chiens ont révélé que les dérivés surfaces en titane nanoporeux sol-gel peuvent induire le développement des interactions entre hémidesmosomaux la muqueuse buccale et la surface d'implant [16]. De même, chez des sujets humains, le contact entre la muqueuse et les implants dentaires en titane a été augmentée en présence de films d'oxyde de titane, un sol-gel dérivé [17]. Par conséquent, la force d'adhérence des kératinocytes et des fibroblastes a été étudié en utilisant un procédé qui élimine les cellules faiblement jointes. Une méthode similaire a été utilisée précédemment pour enquêter sur l'adhérence des cellules épithéliales et les fibroblastes au titane [23]. Les résultats de cette étude ont révélé aucune différence dans la force d'adhérence des kératinocytes ou des fibroblastes aux surfaces anodiquement oxydé par rapport au témoin CpTi ce qui suggère que les nano-structures ne sont pas influencer la force de fixation de chaque type de cellule.
Ceci est en accord avec les résultats d'une autre étude in vitro
où la force d'adhérence des fibroblastes n'a pas été affectée par les conditions et les matériaux de surface [30]. Cependant les fibroblastes ont été enlevés dans une plus grande mesure de toutes les surfaces que les kératinocytes, ce qui indique une force d'adhérence globale plus faible pour ces cellules.
Plupart vitro
études dans de l'influence des propriétés de surface de l'implant sur l'adhésion de la cellule hôte ont été entreprises dans des environnements sans bactéries. Cependant, quand une surface de butée est placée dans la cavité buccale, la capacité des cellules des tissus mous, en particulier des kératinocytes, à adhérer peut être influencée par la présence de micro-organismes dans l'environnement buccal. L'effet d'un consortium de début streptocoques colonisatrice sur l'adhérence et la force d'adhésion des kératinocytes a donc été étudié. Kératinocytes adhésion était largement inhibée lorsque les bactéries étaient déjà présents sur les surfaces de titane suggérant que la guérison des tissus mous pourrait être fortement influencée par la présence de biofilms microbiens sur la surface de butée. L'exposition de la fixation des kératinocytes dans les mêmes bactéries, réduit la densité de cellules d'environ 50% et l'intégrité de la membrane cellulaire des cellules restantes a semblé être compromise. Alors que les dommages des cellules observée ici est quelque peu surprenant étant donné que les streptocoques oraux sont normalement pas considérés comme des pathogènes, des résultats similaires ont été obtenus dans des études in vitro
où ostéoblastes ont été exposés à la commensal de la peau, Staphylococcus epidermidis
[31, 32] . Il est connu que les streptocoques commensal produire une gamme de produits finaux métaboliques, y compris le lactate, l'acétate, l'éthanol et le formiate ainsi que des enzymes (glycosidases et protéases) et les antigènes bactériens, y compris l'acide lipotéichoïque (LTA) qui peuvent être considérés comme des mécanismes possibles pour l'observé les dommages cellulaires [33, 34]. Alors que les kératinocytes peuvent répondre à LTA par Toll-like récepteurs [35], les effets d'autres substances sur la fonction de kératinocytes ne sont actuellement pas bien compris.
