Résumé
fond
Nano-hydroxyapatite (NHA) est un biomatériau idéal potentiel de régénération osseuse. Cependant, les études ne sont pas encore pour caractériser le comportement des ostéoblastes humains issus de l'os alvéolaire sur NHA. Ainsi, le but de la présente étude était d'évaluer l'influence de Nhà sur l'adhérence, la prolifération et la différenciation de ces cellules dérivées de l'os alvéolaire.
Méthodes
ostéoblastes alvéolaires humains primaires ont été collectées à partir de la crête alvéolaire d'un mâle patients parodontale pendant la chirurgie d'exérèse osseuse et cultivées sur des plaques de culture revêtues soit polylysine ou polylysine avec nano-hydroxyapatite (POL /NHA) composite. Résultats Les cellules ont été cultivées et observées pendant 14 jours, puis évalués en vue d'éventuelles modifications à ostéoblastes homéostasie évaluée par réaction inverse quantitative chaîne transcriptase-polymerase (temps réel RT-PCR), la microscopie électronique à balayage et microscopie à force atomique. de
PCR en temps réel a révélé une augmentation significative de l'expression des marqueurs sélectionnés de la différenciation des ostéoblastes (protéine morphogénétique osseuse (BMP) -2, -5, -7, ALP, COLL-1A2, OC, ON) dans les cellules cultivées sur la POL substrat /NHA. En outre, par rapport à la surface de POL, les cellules cultivées sur le POL /substrat NHA ont démontré de meilleures propriétés de ostéoconductifs, comme en témoigne l'augmentation de l'adhésion et la diffusion, probablement en raison de la rugosité de surface accrue du composite. De Conclusions
l'expression accrue de PGB et les biomarqueurs ostéoinducteurs suggèrent que nano-hydroxyapatite peut stimuler la prolifération et la différenciation des ostéoblastes alvéolaires locaux et favoriser ainsi la régénération osseuse au niveau des sites de régénération osseuse alvéolaire.
ostéoblastes Mots-clés
Nanohydroxyapatite humaines osseuses alvéolaires matériel supplémentaire régénération électronique
La version en ligne de cet article (doi:. 10 1186 /1472-6831-14-22) contient du matériel supplémentaire, qui est disponible pour les utilisateurs autorisés
Contexte
La principale. préoccupation de parodontologie est la réhabilitation des dents parodonte compromis, peut-être visant à la régénération parodontale complète des tissus [1]. Idéalement, ce processus comprendrait la formation d'os nouveau, nouveau ligament parodontal et nouveau cément, ou plutôt un nouvel attachement sur la racine qui a déjà été privé de tout l'appareil de fixation [2]. Les approches thérapeutiques qui tentent d'atteindre cet objectif incluent l'utilisation de différents matériaux de greffage (autogène, allogène, xénogène et des greffes alloplastiques), les barrières physiques pour la régénération tissulaire guidée (RTG), les protéines de matrice dérivée de l'émail et de divers facteurs de croissance [3, 4 ].
on suppose que l'utilisation de greffons osseux ou des matières alloplastiques entraînerait aussi bien dans la repousse de l'os alvéolaire et la formation d'une nouvelle couche de cément avec des fibres de collagènes insérées sur la surface de la racine précédemment parodontite impliqué [5]. Le mécanisme d'action peut se faire soit par la stimulation de l'ostéogenèse (nouvelle formation osseuse à partir des cellules formant l'os contenu dans la greffe), ostéoconduction (lorsque la greffe sert d'échafaudage pour la formation d'os de l'os hôte adjacent), ou ostéo-induction ( la matrice de la greffe osseuse contient des substances osseuses induisant qui aboutissent à la formation osseuse dans les tissus environnants même si elle ne le tissu osseux) [6]. matériaux alloplastique sont présumés pour favoriser la cicatrisation osseuse par ostéoconduction et ensuite se comporter comme un échafaudage pour ce processus [5].
Un échafaudage idéal est un matériau biocompatible qui fournit un support mécanique approprié [7]. Il doit posséder une structure similaire à la matrice extracellulaire native, présentent des propriétés de surface favorables, et conduire à une augmentation de l'adhérence, la prolifération et la différenciation des ostéoblastes [7]. Hydroxyapatite (HA) [Ca
5 (PO 4) 3 OH] est un matériau alloplastique, chimiquement similaire au composant minéral de la matrice osseuse qui se traduit par ces propriétés dans une biocompatibilité valeur optimale et [7] . Lorsque HA est greffé sous un périoste sain et os bien vascularisé, le premier devient intégré par un caillot [8], puis libère des ions phosphates dans le milieu environnant, ce qui stimule le néo-ostéogenèse.
Un facteur fondamental régissant l'intégration optimale des HA avec de l'os est la dimension des cristaux. particules HA avec des dimensions proches de la taille des cristaux naturels trouvés dans les tissus durs vertébrés (ie, allant de 1 à 10 nm), sont maintenant disponibles [9], et ils ont été signalés à imiter la matrice extracellulaire de l'os de la taille et de la structure [dix]. Des études in vitro
menées dans le but de comprendre le mécanisme d'action de ce matériau de taille nanométrique ont décrit un effet stimulateur sur les cellules souches mésenchymateuses [11], une augmentation de l'absorption des protéines et des ostéoblastes adhérence par rapport aux micro-taille traditionnelle HA [12, 13], la stimulation de la prolifération des cellules de type ostéoblaste humain entraînant la formation osseuse [14], et la stimulation de la fixation des cellules PDL [15]. Malgré cela, il y a peu d'information à ce jour en ce qui concerne les réponses des ostéoblastes alvéolaires humains en contact avec ce matériau de greffage une fois le défaut osseux est rempli. Ainsi, le but de notre étude était d'évaluer in vitro
les effets de Nhà sur l'adhésion et la prolifération des ostéoblastes alvéolaires humaines et de déterminer l'impact que ce matériau alloplastique a sur l'expression de biomarqueurs de la formation osseuse au cours HA-médiée Méthodes
Isolation des ostéoblastes primaires humains de Fresh os humain retiré de la crête alvéolaire ont été obtenus avec l'approbation du comité d'éthique de l'Université Sapienza de Rome et a informé le consentement du patient de la régénération osseuse parodontale..
humain primaire ostéoblastes alvéolaires (HOBS) ont été récoltées à partir d'un 53-year-old patients parodontale mâle pendant la chirurgie parodontale resective selon un protocole validé précédemment [16, 17].
spécimens d'os récoltés ont été stockés dans une solution saline équilibrée de Hank (HBSS, Sigma ALDRICH, St. Louis, MO) contenant 100 U /ml de pénicilline et 100 mg /ml de streptomycine jusqu'à la transformation. Pour le traitement, des échantillons d'os ont été rincés dans une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,4, fragmenté avec un scalpel, et digérées dans une solution de 1 mg /ml de collagénase de type IV et de 0,25% de trypsine (dans du PBS) à 37 ° C pendant 30 min avec agitation, suivi de deux étapes de digestion supplémentaire pendant 40 min et 90 min, tel que précédemment décrit [18, 19]. Les cellules obtenues à partir des deuxième et troisième digestions ont été recueillies, centrifugées et remises en suspension dans Eagles modifié de Dulbecco (DMEM, Gibco-BRL, Rockville, MD) supplémenté avec 50 U /ml de pénicilline, 50 pg /ml de streptomycine, 4 mmol /l L- glutamine et 10% de sérum fœtal bovin (FBS, Hyclone, Thermo Scientific, Wilmington, dE). Les cellules d'adhérence, la prolifération et la morphologie ont été inspectés visuellement par microscopie (Nikon Eclipse TS100, Nikon, Tokyo, Japon) sur la période de 2 semaines. Après que les cellules ont atteint 70-80% de confluence, elles ont été détachées avec de la trypsine-EDTA, recueillis et utilisés pour des expériences entre les passages 2 et 4.
poly-L-lysine et la poly-L-lysine NHA préparation de revêtement
un millilitre par 25 cm 2 de 0,01% de poly-L-lysine, la solution (POL Bioreagent, poids moléculaire 150,000-300,000, filtrée stérilement, Sigma-Aldrich) a été utilisé pour revêtir les surfaces des plaques de Petri. Les échantillons ont été agités doucement à 4 ° C, à 1200 tours par minute pendant 10 minutes afin d'homogénéiser la stratification. Les surfaces ont ensuite été rincées à l'eau stérile et on les laisse sécher à la température ambiante. Par la suite, 10 mg de poudre NHA (Ghimas Spa, Casalecchio di Reno, BO, Italie) a été remis en suspension dans 1 ml d'eau stérile et utilisé pour enduire les plaques POL-traitées. Enfin, les surfaces revêtues ont été rincées avec de l'eau stérile et on laisse sécher
ostéoblastes-POL et ostéoblastes-POL-nha préparation des échantillons
comportement ostéoblastes a été examiné sur des plaques enduites en utilisant deux tests:. Dans l'essai 1, les plaques revêtues uniquement avec POL ont été ensemencées avec des plaques sur à une densité de 2 x 10 4 cellules /cm 2; dans l'essai 2, plaques ont été ensemencées à la même densité sur des plaques revêtues de POL et de la poudre NHA. Des échantillons de test 1 et test 2 ont été cultivées dans les mêmes conditions expérimentales (de 95% d'humidité, 5% de CO 2, 37 ° C) dans du DMEM contenant 10% de FBS. Des expériences ont été réalisées en triple et répétées trois fois par microscopie électronique à balayage
.
Propriétés de surface des plaques revêtues et ostéoblastes morphologie ont été visuellement examinées par microscopie électronique à balayage (MEB). Après 24 h de culture sur POL ou surfaces POL-nha enduits, les échantillons ont été rincés deux fois avec du PBS, fixé à 2,5% de glutaraldéhyde pendant 1 h, on rince avec de l'eau distillée, déshydratée avec des concentrations graduées d'alcool (50%, 70%, 90% , 100% d'éthanol) et enfin traitée avec du CO 2 au point haut de critique. Les échantillons ont été fixés sur les talons d'aluminium à l'aide d'un ruban de carbone conducteur, puis recouvertes d'une couche d'or de 10 nm (Coating Unité E5000, Polaron Ltd. Watford, Royaume-Uni). Les spécimens ont été observés avec SEM (Leo 1450VP, Carl Zeiss, Jena, Allemagne) à différents grossissements, en utilisant des électrons secondaires à 15 kV.
Microscopie à force atomique
microscopie à force atomique (AFM) a été réalisée à l'aide d'un Nanonics Imaging AFM système (Jérusalem, Israël) dans un mode sans contact et une tension de référence de 0,8-1,0 V entre la pointe et la surface de l'échantillon au cours de toutes les expériences.
expression génique
Après 14 jours de culture sur POL et POL-nha des surfaces, l'ARN a été extrait selon le protocole décrit précédemment [18]. L'ARN a été inversé transcrit en utilisant le kit TaqMan de transcription inverse (Applied Biosystems, Life Technologies, Foster City, CA), en utilisant des hexamères aléatoires. PCR en temps réel a été ensuite effectuée en utilisant un dosage d'expression de SYBR génétique vert (Applied Biosystems) sur un système PCR en temps réel ABI Prism 7300 (Applied Biosystems) pour évaluer les changements dans l'expression des marqueurs ostéogéniques: la phosphatase alcaline (ALP), A2 pro-collagène Type 1 chaîne (COLL-1A2), la protéine morphogénétique osseuse (BMP) -2, BMP-5, BMP-7, ostéocalcine et ostéonectine. Glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) a été utilisé comme contrôle endogène. Les séquences ont été conçues en utilisant le logiciel Primer Express (Applied Biosystems) et synthétisées par primm (Milan, Italie). Amorces sont énumérés dans le tableau 1. Gene expression a été analysée en fonction de la méthode ΔΔCT, avec les niveaux de test 2 d'expression (POL /NHA) échantillons normalisés vers essai 1 (POL) values.Table 1 amorces humaines utilisées dans RT- PCR pour la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH), la phosphatase alcaline (ALP), A2 pro-collagène de type 1 chaîne (COLL-1A2), morphogénétique osseuse de la protéine-2, -5, -7 (BMP-2, -5, -7)
cible gène
Primer sequences
GADPH
5′-GGAGTCAACGGATTTGGTCGTA-3′
5′-GGCAACAATATCCACTTTACCAGAGT-3′
ALP
5′-TGCGGAAGAACCCCAAAG-3′
5′-ATGGTGCCCGTGGTCAAT-3′
Coll-1A2
5′-CCCAGCCAAGAACTGGTATAGG-3′
5′-GGCTGCCAGCATTGATAGTTTC-3′
Osteocalcin
5′-AGCAAAGGTGCAGCCTTTGT-3′
5′-GCGCCTGGGTCTCTTCACT-3′
Osteonectin
5′-CCACACGTTTCTTTGAGACC-3′
5′-GATGTCCTGCTCCTTGATGC-3′
BMP-2
FW5′-CCAGCTGTAAGAGACACCCTTTG-3′
RV5′-ACCCACAATCCAGTCATTCCA-3′
BMP-5
FW5′-CGTCCTCTGCACCTCTCTTTATG-3′
RV5′-CTCCGACTCTTCAGGATTTTCTTC-3′
BMP-7
FW5′-TCTTCCACCCACGTACCA-3′
RV5'-GCTTCCCCTTCTGGGATCTT-3 '
Analyse statistique des données
Le Statistical Package for Social Sciences (SPPS v15.0, SPSS Inc. Chicago, IL) a été utilisé pour l'analyse statistique . Les analyses ont été effectuées à l'aide de t
-test de l'étudiant. La signification a été fixé à p & lt; L'extraction des ostéoblastes humains primaires et de culture
ostéoblastes de 0,05. Les résultats
fixés avec succès aux surfaces des substrats et ont été observées pour subir une prolifération du jour 4 au jour 14, comme déterminer par une inspection visuelle au microscope (figure 1A-C ). Figure 1 ostéoblastes primaires humaines. (A) Après 4 (B) Après 5 jours (C) après 14 jours (grossissement d'origine, 20 ×).
POL et POL-nha propriétés de rugosité de surface
La rugosité des deux surfaces de substrat a été évaluée par SEM et AFM. La rugosité de surface nanométrique évaluée par l'AFM était de 49,7 rms /nm pour POL-NHA et 6.3 rms /nm pour POL. Ainsi, des plaques recouvertes de POL-NHA ont montré une 7,89 fois la rugosité superficielle nanométrique plus élevé par rapport aux plaques de POL (Figure 2A-D). En outre, les observations MEB a révélé la morphologie des particules NHA pour avoir une forme de tige de 70-90 nm de diamètre. Figure 2 microscopie à balayage. (A) en microscopie électronique image des polylysine (POL) substrats. (B) Microscopie à force atomique de POL /nanohydroxyapatite. (C) microscopie électronique à balayage. (D) de la microscopie à force atomique de POL /nanohydroxyapatite (POL /NHA) de. Effet de nano-hydroxyapatite sur l'adhésion des ostéoblastes et la prolifération
Les modifications morphologiques potentiels à HOBS ont été évalués après que les cellules ont été ensemencées sur des plaques revêtues de POL et POL-NHA. Après 24 h, les cellules en croissance sur les plaques de POL revêtues maintenues une forme sphérique (figure 3A), tandis que les cellules sur le substrat POL-nha semblaient être attachée fermement, comme en témoigne la présence de nombreuses extensions de filopodes (figure 3B), suggérant que les particules Nhà une meilleure adhérence des ostéoblastes et la diffusion. De plus, les images obtenues par AFM ont montré que HOBS cultivées sur POL /nha respectées plus fortes que celles sur POL seul, comme le montre l'augmentation de la rugosité superficielle nanométrique (figure 3C-D). La microscopie Figure 3 électronique à balayage (MEB) et microscopie à force atomique (AFM). (A) Les cellules cultivées sur POL apparus sphérique avec des fibres rétractées. (B) Les cellules cultivées sur POL /nha apparus allongé et avec de nombreux filopodes. (C) Les cellules cultivées sur POL apparus sphérique avec des fibres rétractées. (D) Les cellules cultivées sur POL /nha apparu allongé et avec de nombreux filopodes.
Effets de a été extrait à partir de cellules cultivées pendant 14 jours sur les deux substrats nano-hydroxyapatite sur l'expression des gènes de l'ARN de ostéoblastes humains (POL contre POL /NHA) et soumis à temps réel RT-PCR pour évaluer les changements dans l'expression de gènes spécifiques de différenciation ostéoblastique (tableau 1): BMP-2, -5 et -7, ALP, COLL-1A2, OC et ON, bien connue des marqueurs de différenciation. Comme le montre la figure 4, BMP-2, BMP-5 et BMP-7 ont été augmentés d'environ 1,7, 4,5 et 4,3 fois, respectivement, en HOBS cultivées sur POL /substrats Nhà par rapport à celles cultivées sur POL seul (p & lt; 0,05). Fait intéressant, COLL-1A2, OC et ON expression était de 1,6, 1,9 et 2,1 fois plus élevé, respectivement, en HOBS cultivés sur POL /nha par rapport à celles qui sont cultivées sur POL (p & lt; 0,01). ALP a également augmenté de 2,5 fois en HOBS cultivés sur POL /NHA (p & lt; 0,01), ce qui suggère une augmentation de la différenciation de ces cellules dans les conditions de culture actuelles. Figure 4 Gene expression de HOBS mis en culture dans POL et POL /NHA.
Dans l'ensemble, nos résultats montrent que, dans un laps de temps de 14 jours, le substrat POL /NHA peut améliorer l'expression des gènes ostéoblastiques spécifiques, ce qui indique fortement un effet positif de Nhà sur la différenciation des ostéoblastes (figure 4).
Discussion
hydroxyapatite, entre les différents substituts de greffe osseuse, a été largement étudié dans la régénération parodontale au cours des trois dernières décennies [4, 20]. HA greffes alloplastique, en dépit de leur composition chimique similaire à l'os, sont connus principalement pour leurs propriétés ostéoconductifs [5]. Notre étude a confirmé les propriétés ostéoconducteur d'une version de taille nanométrique de ce matériau, montrant que nha peut stimuler les ostéoblastes pour produire sélectionné biomarqueurs représentatifs de la formation osseuse et le recrutement de cellules mésenchymateuses.
La justification du choix des ostéoblastes alvéolaire humaine est basée sur le fait que ces cellules sont situées sur la surface de l'os du défaut, ce qui signifie que le matériau greffé sera en contact direct avec ces ostéoblastes lors de la cicatrisation. La méthode de collecte des cellules a été réalisée à l'aide d'un scalpel osseux dans le cadre d'une technique bien documentée utilisée pendant une chirurgie périodontique résective [21, 22]. La culture cellulaire et la formation des substrats ont été effectués suivis des modèles utilisés précédemment (dispersion de particules de Nhà en poli-éthylène-glicol-diméthacrylate ou nha associés à un polycarbonate, un polyamide, un polysaccharide) [23-27]. ostéoblastes alvéolaires humains sont les cellules primaires responsables de la formation de l'os alvéolaire, même si elles ne semblent pas être en mesure de migrer et proliférer dans des sites éloignés où la régénération osseuse est nécessaire. Albrektsson & amp; Johansson a suggéré que les cellules pré-existantes ostéoblastiques contribuent seulement une partie mineure du nouvel os nécessaire dans une situation de guérison de fracture et que le recrutement de cellules immatures et leur différenciation en ostéoblastes sont probablement la guérison osseuse mécanisme de base et pivot de régulation [6]. En effet, les ostéoblastes ont été montrés pour contribuer à la production de facteurs de croissance qui favorisent la migration cellulaire, ainsi que la osteogene et la différenciation chondrocytaire des cellules souches mésenchymateuses [28]. Notre étude démontre que nha stimule les ostéoblastes alvéolaires locales pour produire pertinente PGB osseuse spécifique, qui sont connus pour initier et réguler la formation d'os à partir des cellules progénitrices.
Plusieurs types de PGB, qui appartiennent au facteur de croissance transformant (TGF ) -β familiale, ont été étudiés et caractérisés pour leur rôle modulateur dans l'homéostasie du tissu osseux. BMP-2 et BMP-7 sont d'un intérêt particulier, car elles sont naturellement libérées en réponse à un traumatisme ou pendant le remodelage osseux et sont, à ce jour, les seuls agents d'induction connues [6]. La stimulation de la BMP-2, -7 -5 et constitue un aspect important de l'ostéogenèse, étant donné que ces protéines sont les trois facteurs de croissance les plus puissants renforçant la formation osseuse. Les résultats présentés ici montrent que nha favorise l'expression BMP par les ostéoblastes alvéolaires in vitro
. Cette observation suggère que NHA pourrait agir en tant que promoteur de la régénération osseuse au niveau du site du défaut osseux de deux façons: en induisant une différenciation ostéogénique comme observé par Lock et al. [11] et /ou en induisant la sécrétion de facteurs spécifiques tels que PGB ou d'autres facteurs de croissance non testés dans cette expérience. En outre, le nha influencé une augmentation significative de l'expression de plusieurs marqueurs importants de l'ostéogenèse ALP, OC, ON et COLL-1A2.
Dynamiser la formation osseuse, les cellules ont besoin d'adhérer et de proliférer. La rugosité de surface est une considération importante lors du choix d'un substrat osseux induisant. Selon les principes physiques et mécaniques, un substrat ayant une rugosité superficielle présente une plus grande capacité à l'adhérence par rapport à une surface lisse [29-32]. Dans cette étude, ostéoblastes adhérence a été évaluée en fonction des modifications apportées à la forme des cellules et sur la présence de filopodes. SEM et AFM images ont montré que nha avait une surface plus rugueuse que le substrat de contrôle et a favorisé l'adhésion et la prolifération des ostéoblastes humains. Ces résultats sont en accord avec ceux rapportés par Thian et al., Montrant que nha amélioré l'adhérence et la propagation des cellules humaines ostéoblastes [33] et Liu et al., Ce qui démontre l'induction de l'adhérence et la prolifération des MG- ostéoblastique comme humain 63 cellules sur Nhà [14]
. Conclusions
Dans les limites de cette étude, nous avons constaté que nha peut augmenter de manière significative sur le site humain adhérence des ostéoblastes alvéolaire et la différenciation, et donc spéculer que nha pourrait encourager la formation osseuse par les ostéoblastes locales sur les sites de reconstruction de l'os alvéolaire. En outre, l'expression accrue des PGB sur la surface Nhà pourrait indiquer une augmentation du recrutement des cellules progénitrices au cours de guérison avec échafauds NHA. Ces in vitro
résultats pourraient expliquer, au moins en partie, la formation d'os nouveau témoin dans les défauts osseux remplis de Nhà matière de greffage [34, 35] et de proposer le rôle supplémentaire de NHA dans les processus refixation parodontales, y compris la formation de nouveaux cément et le nouveau ligament parodontal. D'autres études histologiques et cliniques sont nécessaires pour donner un sens aux résultats in vitro
ainsi qu'une explication biologique des résultats cliniques observés par d'autres.
Déclarations
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sont les liens vers des fichiers soumis originaux des auteurs pour les images. de fichier d'origine pour la figure 1 12903_2013_367_MOESM2_ESM.tiff Auteurs »Auteurs 12903_2013_367_MOESM1_ESM.tiff fichier d'origine pour la figure 2 12903_2013_367_MOESM3_ESM.tiff de fichier d'origine pour la figure 3 12903_2013_367_MOESM4_ESM.tiff Auteurs Auteurs fichier d'origine pour le fichier d'origine de la figure 4 Auteurs 12903_2013_367_MOESM5_ESM.png pour la figure 5 intérêts concurrents
les auteurs déclarent qu'ils ont aucun conflit d'intérêts. l'AP et SM de contributions des auteurs
étaient les chercheurs principaux de cette étude. Ils ont apporté une contribution substantielle à la conception et la conception, ainsi que l'acquisition, l'analyse et l'interprétation des données; GP, MS, GDC et BZ ont participé à la rédaction du manuscrit ou de la révision critique de son contenu intellectuel important, et a donné l'approbation finale de la version à publier. LR, MB et FW ont apporté des contributions importantes dans l'acquisition de données et ont participé à la rédaction du manuscrit et ont aidé à la révision du manuscrit. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.
