Résumé de l'arrière-plan
Considérant que le tissu gingival greffé peut être adaptée à la zone réceptrice et que les fibroblastes ont la capacité de répondre à des stimuli bactériens par la libération de diverses cytokines, cette étude a examiné si les fibroblastes de la muqueuse palatine se comportent différemment lorsqu'ils sont greffés sur le rebord gingival concernant la sécrétion de cytokines
. Méthodes de biopsies de la muqueuse palatine ont été recueillies au moment de la la chirurgie sans greffe gingivale, et après quatre mois re-collecte a été réalisée lors d'une chirurgie pour la couverture des racines. Les fibroblastes ont été isolés par la technique de l'expiant, cultivées et stimulées avec (Pg de
) Porphyromonas gingivalis et de Escherichia coli
(Ec
) LPS pendant 24 ou 48 heures pour une évaluation comparative de la sécrétion de cytokines et chimiokines comme l'IL-6, IL-8 /CXCL8, MIP-1α /CCL3, le TGF-β, le VEGF et CXCL16. les cellules non stimulées ont été utilisés comme groupe témoin. Les Fibroblastes: Résultats de cellules ont été testées pour leur viabilité par un test MTT et la sécrétion de cytokines et de chimiokines a été évaluée dans les surnageants cellulaires par Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). de la muqueuse palatine ont maintenu le même motif de sécrétion d'IL -6 lorsqu'ils sont greffés sur le rebord gingival. Au contraire, les fibroblastes du greffon gingival marginal ont montré une augmentation de la sécrétion d'IL-8 /CXCL8, même en l'absence de stimulation. Fait intéressant, MIP-1α /CCL3 la sécrétion par les fibroblastes de la greffe gingivale marginale a été augmenté de façon significative après 48 heures de stimulation par Pg de LPS et après 24 h avec Ec de LPS. Seuls les fibroblastes de la greffe gingivale marginale ont montré la sécrétion de TGF-β. VEGF et CXCL16 sécrétion ne sont pas détectés par les deux sous-ensembles de fibroblastes.
Conclusion
Fibroblastes de la muqueuse palatine semblent être adaptées aux conditions locales du site microenvironnement lorsqu'ils sont greffés sur la zone marginale gingival. Ces données confirment la participation effective des fibroblastes dans l'homéostasie du parodonte marginal par la sécrétion de la modulation des médiateurs inflammatoires importants.
Mots-clés
fibroblastes gingivaux parodontite Cytokines chimiokine Inflammation électronique matériel supplémentaire
La version en ligne de cet article (doi :. 10 1186 /1472-6831-14-21) contient du matériel supplémentaire, qui est disponible pour les utilisateurs autorisés
Contexte
gingivale exposition des tissus à la plaque bactérienne peut entraîner une inflammation des tissus avec des signes cliniques de changement de couleur. , la taille, la forme, la consistance et la saignée avec possibilité de perte d'os alvéolaire due à la progression de la maladie périodontique [1]. L'effet cumulatif et événements pathologiques répétitifs au tissu gingival peut conduire à l'apparition et la progression de la récession gingivale, en particulier dans les cas avec la bande ou de l'absence de gencive attachée [2-4] étroite.
Selon l'Académie américaine de parodontologie, parodontale la chirurgie plastique peut être indiquée pour augmenter la largeur gingivale, la création d'un vestibule plus profond dans des sites d'attachement de frenum anormale et gencive attachée inadéquate [5]. Même si la largeur de la kératinisation et la muqueuse gingivale sont génétiquement déterminées, elles peuvent être affectées par la présence de plaque bactérienne associée à une inflammation ou par des interventions mécaniques
Il a été démontré [6]. Que les fibroblastes, en plus d'être des cellules les plus importantes le maintien et le remodelage de la matrice extracellulaire du tissu conjonctif, sont impliqués dans la réponse immunitaire de l'hôte et inflammatoire de la maladie périodontique, car ils sont les cellules structurelles prédominantes trouvées dans les infections parodontales par des bactéries anaérobies telles que Porphyromonas gingivalis (Pg)
et peuvent être stimulés pour libérer des cytokines inflammatoires sur Pg
et son défi des sous-produits [7-11]. En plus d'être sensibles à leurs propres cytokines et de facteurs de croissance, ils peuvent interagir directement avec des bactéries et de leurs facteurs de virulence, y compris un lipopolysaccharide (LPS) dans des lésions parodontales [12].
En ce qui concerne les fibroblastes gingivaux rôle dans la réponse à la Pg de LPS par cytokines de presse, il a déjà été démontré que ces cellules présentent un comportement différentiel du desmodonte à partir des mêmes donneurs, ce qui confirme la spécificité de la région anatomique dans la détermination de la réponse cellulaire [9]. Plus précisément, pour l'IL-6 et IL-8 /CXCL8, une chimiokine bien connue nécessaire pour neutrophiles recrutement, il a été signalé que ces cellules sont capables de sécréter des quantités énormes lorsqu'il est stimulé par Pg de LPS [8, 13-15] . En outre, les fibroblastes gingivaux sécrètent également la chimiokine MIP-1α /CCL3 ce qui implique des monocytes sur la chimio-attraction dans la parodontopathie [16], ainsi que le TGF-β qui induit l'expression de la pro-collagène de type I [17]. Le VEGF est une cytokine liée à l'étiologie de la maladie parodontale en raison de la capacité à augmenter la perméabilité vasculaire, qui contribue à la diffusion de l'inflammation, ce qui permet inflammatoire libération de médiateurs par les cellules dans le tissu enflammé et à permettre la formation de nouveaux vaisseaux sanguins [18]. En outre, le CXCL16 chimiokine est induite par d'autres cytokines favorisant les fibroblastes gingivaux prolifération et la migration des leucocytes dans les tissus enflammés aidant les tissus parodontaux remaniement [19, 20]. Au meilleur de notre connaissance, aucun travail précédent a abordé le profil de sécrétion des cytokines précitées comparant les fibroblastes de muqueuse palatine (généralement utilisé comme un site donneur autogène pour les procédures de greffe gingivale) avec des cellules originaires de la zone gingivale marginale.
Entée tissu gingival pourrait devoir être adaptée à la zone du récepteur et il y a un grand nombre de preuves que les fibroblastes gingivaux sont capables de réagir à plusieurs stimuli par des cytokines et des chimiokines de presse, qui à son tour jouent un rôle important dans la réponse inflammatoire. Par conséquent, cette étude visait à examiner si la sécrétion de cytokines et de chimiokines, y compris la réparation des médiateurs par les fibroblastes gingivaux humains serait modulée lorsqu'ils sont greffés de la muqueuse palatine à la zone marginale gingival dans une procédure sans greffe gingivale.
Méthodes
collecte et fibroblastes échantillon culture primaire
Après approbation par la Commission de révision institutionnelle de l'école Bauru de dentisterie, Université de São Paulo, # 055/2011, trois systémique et parodonte individus en bonne santé (28, 38 et 50 ans, 3 femelles) ont été sélectionnés en parodontie Cliniques, qui ont tous besoin de couverture des racines dans les zones de la muqueuse kératinisée rare. Ils avaient aucun signe d'inflammation gingivale, pas de saignement au sondage ou critique profondeur de sondage. Tous les individus ont été soumis à l'anamnèse, l'examen clinique et les examens radiographiques parodontale. Les critères d'inclusion étaient les individus avec la muqueuse kératinisée déficiente, en quantité et en qualité, sans complications systémiques qui pourraient contre-indication des procédures chirurgicales, et que donné leur consentement éclairé par écrit à participer à l'étude.
Les spécimens de la muqueuse palatine, de taille 3x3 mm, ont été obtenus immédiatement lors d'une greffe de tissu conjonctif, l'épithélium a été retiré du site donneur palatine sur la zone prémolaires lors d'une chirurgie de greffe gingivale libre [21]. Au bout de quatre mois, les échantillons de greffe gingivale ont été obtenus à partir de la zone marginale, au cours d'une deuxième intervention chirurgicale pour la couverture des racines. Les fibroblastes ont été isolés par la technique d'explants, comme décrit précédemment [8-11]. En bref, les échantillons ont été traités immédiatement dans un milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM; Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) additionné de 20% de sérum fœtal bovin (FBS; Gibco, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). La couche de l'épithélium a été retiré et les échantillons ont été émincées aussi faible que possible. fragments de tissus de la muqueuse palatine ou greffe gingivale ont été étalées séparément dans des boîtes de Pétri et recouverts de DMEM supplémenté avec 20% de FBS et des antibiotiques (600 pl /ml de pénicilline, 300 pl /ml de sulfate de gentamicine et 100 ul /ml d'amphotéricine B). Les explants ont été placés dans 25 cm
2 flacons et mises en incubation à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO 2. Le milieu (DMEM 10% FBS) a été changé tous les 2-3 jours et les cultures ont été maintenues jusqu'à ce que les fibroblastes ont atteint la confluence. Après confluence, les fibroblastes ont été récoltées et utilisées entre les quatrième et huitième passages [8-11] Fibroblastes stimulation.
Les cellules ont été ensemencées dans des plaques à 24 puits à une densité de 2 x 10 4 cellules /puits et incubées à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO 2 pendant 18 heures dans du DMEM 1% de FBS. Après l'adhésion du jour au lendemain, DMEM contenant 1 pg /ml de Pg
LPS (Invivogen, San Diego, CA, USA) ou Ec de LPS (InvivoGen) a été ajouté aux puits pendant 24 ou 48 h. Les cellules non stimulées ont été utilisées comme témoins. Les deux Pg
LPS et Ec de LPS étaient ultrapure et achetés auprès de Invivogen.
Caractérisation phénotypique des fibroblastes de les cellules cultivées à partir de la muqueuse palatine et greffe gingivale ont été caractérisées comme des fibroblastes par leur morphologie et la coloration avec une surface de fibroblaste protéines (FSP; ab 11333, Abcam, Cambridge, Royaume-Uni) au moyen d'immunocoloration [11]. Les cellules ont été ensemencées dans une plaque 8 puits avec 1 x 10 4 cellules par puits et incubées à 37 ° C avec 5% de CO 2 pendant 18 heures à adhérer à la sous-confluence. Par la suite, les puits ont été divisés en groupes (contrôle, Pg
LPS, Ec de LPS et témoin négatif, qui a été effectuée sans l'anticorps primaire) en double exemplaire, à la cellule de stimulation. Les cellules ont été fixées avec du paraformaldehyde à 4% (15 min) et ont été lavées 3 fois avec PBS 1x et incubées avec du PBS BSA à 3% (30 min à température ambiante) suivie d'une première incubation de l'anticorps monoclonal anti-fibroblaste marqueur de surface dilué à 1: 100 (2 ug /ml de concentration finale), et enfin avec un anticorps secondaire conjugué à la fluorescéine (1: 400) (Abcam) à 37 ° C dans l'obscurité pendant 1 heure. Lamelles ont été montées avec Moyen milieu de montage Vectashield Hard-Set Montage contenant 49,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI; H-1500, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) et analysé par balayage laser microscope confocal (modèle TCS, SPE Leica Mannheim, Allemagne). la viabilité des cellules
la viabilité cellulaire a été analysé à l'activité enzymatique avec un test colorimétrique MTT [bromure de 3- (4,5-diméthylthiazol-2-yl) -2,5-diphényltétrazolium]. En bref, les cellules ont été lavées avec 1 x PBS pour éliminer le milieu de culture et de MTT (5 mg /ml) a été ajouté aux groupes (contrôle, Pg
LPS et Ec
LPS) ou des puits sans cellules (blanc). La plaque a été incubée pendant 4 heures à 37 ° C avec 5% de CO 2. Après incubation, la plaque a été centrifugée (200 g
pendant 7 minutes à 21 ° C) et une solution de MTT a été éliminé pour ajouter le diméthylsulfoxyde (DMSO, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). La densité optique des puits a été déterminée en utilisant un lecteur de plaque (Fluostar Optima, BMG Labtech, Ortenberg, Allemagne) dans la longueur d'onde de 570 nm.
Immuno-enzymatique (ELISA)
ELISA a été réalisée en suivant le fabricant de des instructions pour déterminer les niveaux d'IL-6 protéines (R & amp; D système, Minneapolis, MN, EUA), IL-8 /CXCL8 (R & amp; D système, Minneapolis, MN, EUA), MIP-1α /CCL3 (R & amp; D système, Minneapolis, MN, EUA), le TGF-β (eBioscience, San Diego, CA, USA), VEGF (PeproTech, Londres, Royaume-Uni) et CXCL16 (PeproTech, Londres, Royaume-Uni). En bref, des plaques de 96 puits ont été incubées avec un anticorps de capture anti-IL-6, IL-8 /CXCL8, MIP-1α /CCL3, le TGF-β, le VEGF ou CXCL16 dilué dans du tampon PBS 1x. Après le blocage pendant 1 heure pour éviter une liaison non spécifique, 100 ul d'étalon d'IL-6, IL-8 /CXCL8, MIP-1α /CCL3, le TGF-β, le VEGF et CXCL16 et les surnageants de culture ont été placés. Les cytokines ont été détectées par raifort anticorps monoclonal marqué à la peroxydase à chaque cible après l'addition de 100 ul de l'anti-IL-6, des anticorps biotinylés IL-8 /CXCL8, MIP-1α /CCL3, le TGF-ß, le VEGF et CXCL16 ont été placées dans chaque puits et mis en incubation pendant 2 heures à la température ambiante. La microplaque a été lavée pour éliminer les anticorps marqués par une enzyme non liée. La quantité de peroxydase de raifort liée à chaque puits a été déterminée par l'addition de 100 ul de solution de substrat. La réaction a été arrêtée par l'addition de 100 pi de 1 M d'acide sulfurique, et les plaques ont été lues à 450 nm (Synergy ™ MX Monochromator Based Multi-Lecteur de microplaques, BioTek Instruments, Inc, Winooski, VT, USA). Les concentrations d'IL-6, IL-8 /CXCL8, MIP-1α /CCL3, le TGF-β, le VEGF et CXCL16 ont été déterminées par interpolation à partir d'une courbe standard et présentés en pg /ml pour les essais en double des échantillons en double de chacun des testé conditions. les comparaisons
analyse statistique pour la viabilité à travers MTT échantillons parmi ont été effectuées à l'aide d'une seule façon test ANOVA suivi du test de Tukey. ELISA données normalité a été vérifiée par la méthode de Kolmogorov-Smirnov. Les différences statistiques ont été déterminées par trois voies ANOVA suivie par le test de Tukey. Les analyses statistiques ont été réalisées avec STATISTICA (version 11.0; StatSoft Inc). P valeurs & lt; 0,05 ont été considérées comme significatives. Les résultats des résultats ont été exprimés en moyenne et un écart-type de la moyenne.
caractérisation phénotypique des fibroblastes
coloration cellulaire avec un marqueur de surface des fibroblastes (FSP) a été effectuée pour confirmer le phénotype fibroblastique. Fibroblastes ont été analysées par immunofluorescence dans tous les groupes (contrôle, Pg
LPS, Ec de LPS et contrôle négatif). coloration positive a été observée pour tous les groupes (figure 1), avec Pg
LPS (Figure 1C) et LPS (figure 1B) des groupes de Ec étant légèrement plus élevé. Pour le groupe témoin négatif (figure 1D), qui n'a pas reçu l'anticorps primaire, aucun signal n'a été détecté. Ce résultat confirme la caractérisation des cellules en culture les fibroblastes. La figure 1 des cellules caractérisation par la protéine de surface de coloration fibroblaste. Les cellules cultivées ont été immunocolorées pour la protéine de surface des fibroblastes (FSP) et analysées par un microscope confocal à une augmentation de 63x. (A) le contrôle; (B) stimulée par Ec de LPS; (C) stimulée par Pg
LPS et (D) contrôle négatif, les noyaux marqués en bleu (DAPI).
Viabilité cellulaire
viabilité cellulaire a été évaluée après 24 et 48 h, dans le contrôle (non-stimulés ) et les groupes d'essai (stimulées par Pg de LPS et Ec
LPS). Il n'y avait pas de différence dans la viabilité des cellules aux stimuli utilisés après 24 et 48 h (figure 2). La figure 2 la viabilité des cellules. Fibroblastes viabilité contestée avec Pg de LPS et Ec de LPS évalués à 24 et 48 heures dans le contrôle (non stimulées) et des groupes de test par test MTT (stimulées par Pg LPS et Ec
LPS
) cytokines la sécrétion. comparant les fibroblastes de la muqueuse palatine avec les cellules gingival marginal greffées
Lorsque les cibles de cette étude ont été comparés entre les deux sous-populations de fibroblastes, IL-6 sécrétion était statistiquement significative après 24 et 48 h de Pg
stimulation par le LPS (figure 3A et B) par les deux sous-types de fibroblastes (à partir de la muqueuse palatine et d'une greffe gingival dans la zone marginale) et la différence est supérieure à 48 h (figure 3B). D'autre part, la sécrétion après LPS la stimulation de Ec était seulement statistiquement significative après 48 h, par les deux sous-types de fibroblastes (Figure 3D). En outre, la sécrétion d'IL-6 par les fibroblastes était plus élevée non stimulées du greffon gingival marginal (figure 3). Figure 3 IL-6 de la sécrétion par les fibroblastes humains en culture à partir de muqueuse palatine et greffe gingivale marginale. A-D: les cultures de cellules primaires ont été obtenues à partir de tissus parodontaux, à partir de trois sujets sains et, après le quatrième passage, ont été stimulées avec du LPS de P. gingivalis hôtels et de E. coli
à une concentration de 1 ug /ml. Le milieu de culture sans stimulus a été utilisé comme témoin. ELISA a été réalisée pour la quantification des cytokines sur les surnageants de culture cellulaire. chiffre représentatif de la moyenne de trois expériences indépendantes, n = 3. * P & lt; 0,05 a été considérée comme significativement différentes. PMF = fibroblastes muqueuses palatines. FMV = fibroblastes gingivaux marginaux. De les fibroblastes de la muqueuse palatine sécrétée plus IL-8 /CXCL8 que les fibroblastes de la greffe gingivale marginale lorsqu'ils sont stimulés par Pg
LPS avec une différence statistiquement significative à 48 h (figure 4A et B) . En outre, au sujet de cette chimiokine, les fibroblastes de la muqueuse palatine ont montré une augmentation à la fois 24 h et 48 h quand il est stimulé par Ec de LPS (Figure 4C et D), qui n'a pas été observé par les cellules du greffon gingival marginal. Figure 4 IL-8 /CXCL8 sécrétion par les fibroblastes humains en culture à partir de muqueuse palatine et greffe gingivale marginale. A-D: les cultures de cellules primaires ont été obtenues à partir de tissus parodontaux, à partir de trois sujets sains et, après le quatrième passage, ont été stimulées avec du LPS de P. gingivalis hôtels et de E. coli
à une concentration de 1 ug /ml. Le milieu de culture sans stimulus a été utilisé comme témoin. ELISA a été réalisée pour la quantification des cytokines sur les surnageants de culture cellulaire. chiffre représentatif de la moyenne de trois expériences indépendantes, n = 3. * P & lt; 0,05 a été considérée comme significativement différentes. PMF = fibroblastes muqueuses palatines. FMV = fibroblastes gingivaux marginaux.
Dans cette étude, MIP-1α /CCL3 a été observée pour être constitutivement sécrétée par les deux sous-types de fibroblastes (figure 5). De plus, il n'y avait pas de différence statistiquement significative dans le MIP-1α /CCL3 sécrétion entre les fibroblastes non stimulées (groupe de contrôle) et les fibroblastes stimulés par Pg
ou Ec de LPS de la muqueuse palatine (Figure 5). Cependant, une différence statistiquement significative n'a été observée dans le MIP-1α /CCL3 sécrétion après 48 h lorsque les fibroblastes de la greffe gingivale marginale ont été stimulées avec Pg
LPS (figure 5B) et après 24 h en cas de contestation par Ec de LPS (Figure 5C). Figure 5 MIP-1α /CCL3 sécrétion par les fibroblastes humains en culture à partir de muqueuse palatine et greffe gingivale marginale. A-D: les cultures de cellules primaires ont été obtenues à partir de tissus parodontaux, à partir de trois sujets sains et, après le quatrième passage, ont été stimulées avec du LPS de P. gingivalis hôtels et de E. coli
à une concentration de 1 ug /ml. Le milieu de culture sans stimulus a été utilisé comme témoin. ELISA a été réalisée pour la quantification des cytokines sur les surnageants de culture cellulaire. chiffre représentatif de la moyenne de trois expériences indépendantes, n = 3. * P & lt; 0,05 a été considérée comme significativement différentes. PMF = fibroblastes muqueuses palatines. FMV = fibroblastes gingivaux marginaux.
Lorsque la sécrétion de TGF-β a été évaluée, les fibroblastes de la muqueuse palatine n'a pas montré des niveaux détectables, même en présence de Pg de LPS (figure 6A et B) ou Ec de LPS (Figure 6C et D). Au contraire, les fibroblastes de la greffe gingivale marginale ont montré une sécrétion de TGF-β constitutive et il n'y avait pas de différence statistiquement significative entre les cellules stimulées et non stimulées, à la fois à 24 h et 48 h (figure 6). VEGF et CXCL16 sécrétion n'a pas été détectée soit sur des fibroblastes surnageant de culture de la muqueuse palatine ni du tissu gingival marginal, quelle que soit la stimulation par Pg
ou Ec de LPS. Figure 6 TGF-β la sécrétion par les fibroblastes humains en culture à partir de muqueuse palatine et greffe gingivale marginale. A-D: les cultures de cellules primaires ont été obtenues à partir de tissus parodontaux, à partir de trois sujets sains et, après le quatrième passage, ont été stimulées avec du LPS de P. gingivalis hôtels et de E. coli
à une concentration de 1 ug /ml. Le milieu de culture sans stimulus a été utilisé comme témoin. ELISA a été réalisée pour la quantification des cytokines sur les surnageants de culture cellulaire. chiffre représentatif de la moyenne de trois expériences indépendantes, n = 3. * P & lt; 0,05 a été considérée comme significativement différentes. PMF = fibroblastes muqueuses palatines. FMV = fibroblastes gingivaux marginaux. De la discussion
Fibroblastes ne sont pas un groupe de cellules uniques à travers les différentes régions anatomiques [9, 22-24]. Ce sont les cellules qui prédominent dans le tissu conjonctif parodontal [12] et sont impliqués dans la réponse immunitaire de l'hôte en libérant des cytokines pro-inflammatoires [7] et les médiateurs de réparation [25, 26]. Au meilleur de la connaissance de l'auteur, cette étude est la première à étudier et comparer le profil des médiateurs de la sécrétion par les fibroblastes humains en culture de non marginale muqueuse palatine avec le gingival marginal greffé du tissu, ce qui indique les différences ou les similitudes entre ces cellules dans la contribution pour cytokines lors de la stimulation de la sécrétion de LPS bactérienne.
Dans la présente étude, on a observé que les deux fibroblastes provenant de muqueuse palatine et greffe gingivale marginale sécrétées iL-6 cytokine similaire lorsqu'il est stimulé par Pg
ou Ec de LPS. Nous reconnaissons que cela aurait été intéressant d'étudier l'expression de l'ARNm afin de mieux comprendre si les niveaux de transcription seraient différents entre eux. Cela pourrait nous donner quelques informations sur d'éventuelles modifications post transcriptionnelles qui peuvent altérer la production de cytokines. Des études antérieures [8, 14, 15, 27, 28] ont montré que les fibroblastes exposés à des stimuli bactériens tels que le LPS a montré significative d'IL-6 d'expression, ce qui indique l'importance de cette cytokine dans l'hôte d'une réponse immunitaire et inflammatoire dans la parodontite, mais la présente enquête a également révélé une augmentation de la sécrétion d'IL-6 à 48 h pour les deux sous-types de fibroblastes. Ici, il y avait une sécrétion d'IL-6 par des cellules non stimulées constitutif de la muqueuse palatine et aussi du greffon gingival marginal étant statistiquement significative pour ce dernier. Scheres et al. [14] ont montré que les fibroblastes gingivaux non stimulées expriment et sécrètent de l'IL-6 plus que les fibroblastes du ligament parodontal. Cela suggère que les fibroblastes gingivaux ont un état d'activité plus élevé, car ils sont plus susceptibles d'avoir des contacts avec des agents pathogènes parodontaux et ici nous mettre en évidence ce rôle important pour les deux sous-types de cellules gingivales.
Il est montré ici que les fibroblastes de la muqueuse palatine seulement sécrétée IL-8 /CXCL8 chimiokine lorsqu'elles sont stimulées par le LPS bactérien. Lorsque ces cellules ont été greffées sur la zone de bordure gingivale, au bout de 4 mois d'IL-8 /CXCL8 chimiokine sécrétion a été observée même en l'absence de LPS stimuli. Ce changement dans le profil d'expression peut être liée au contact plus étroit des cellules avec des facteurs de virulence de bactéries, telles que pg de LPS, sur le parodonte marginal. Des études antérieures [9, 13-15, 29] ont montré que les fibroblastes stimulés par Pg de LPS sont capables de produire de l'IL-8, et les fibroblastes provenant de différentes régions anatomiques montrent l'hétérogénéité sur le profil de chimiokine sécrétion [14]. Par conséquent, il souligne en outre que la sécrétion hétérogène d'IL-8 /CXCL8 dans la présente étude peut s'être produite par l'influence de l'environnement sur la sécrétion de médiateurs de fibroblaste greffés sur une nouvelle région anatomique, dans lequel il y a adaptation et la prolifération de ces cellules.
lorsque la chimiokine MIP-1α /CCL3 a été étudiée, il a été observé que, lorsque des fibroblastes à partir de la muqueuse palatine ont été greffées sur la zone marginale gingival, ils ont maintenu la sécrétion de cytokines similaire constitutive en l'absence de stimulation bactérienne. Cependant, les fibroblastes de la gencive marginale par greffage a montré une sécrétion plus élevée par rapport à des fibroblastes de la muqueuse palatine seulement après 48 h lorsqu'ils sont stimulés par LPS de Pg, montrant une expression dépendante du temps. Là encore, la sécrétion de chimiokines accrue, dans ce cas, MIP-1α /CCL3, par les fibroblastes du greffon gingival marginal aurait pu se produire en raison d'une stimulation préalable dans la zone marginale de la plaque dentaire dans le sillon, ce qui suggère que ces cellules présentent un comportement adaptatif lorsque greffé sur le rebord gingival. Un travail antérieur par notre groupe [9] a montré que gingivales et parodontales fibroblastes ligamentaires se comportaient différemment sur MIP-1α /CCL3 sécrétion lorsqu'ils sont stimulés par Pg de LPS, et ont également montré une augmentation de la MIP-1α /CCL3 sécrétion lorsque les cellules ont été contestées par
pg de LPS dans des concentrations faibles telles que 0,1 pg /ml, ce qui a augmenté au fil du temps.
en ce qui concerne le TGF-β sécrétion, les fibroblastes cultivés à partir de la muqueuse palatine et du greffon gingival marginal a montré un comportement hétérogène. Fibroblastes de la muqueuse palatine ne montrent pas de TGF-β sécrétion même contre les stimuli bactériens appliqués. Au contraire, les fibroblastes du greffon gingival marginal sécrétées TGF-β, sans aucune différence entre des cellules stimulées et non stimulées. Une étude [30] a montré que les fibroblastes du ligament parodontal ont exprimé le TGF-β mais sa production n'a pas été affectée par le LPS bactérien, ce qui suggère que le TGF-β accumulent dans les états inflammatoires supprimant la fonction immunitaire cellulaire, mais sans conduire à une destruction des tissus par la stimulation avec des bactéries LPS. Une autre étude comparant le desmodonte et les cellules gingivales [8] a constaté que la sécrétion de TGF-β dépend de la concentration du stimulus, principalement pour les fibroblastes gingivaux, étant supérieure en cas de contestation avec 10 pg /ml de LPS, alors que la concentration de 1 pg /ml tel qu'il est utilisé dans l'étude actuelle, n'a montré aucune différence significative par rapport aux fibroblastes non stimulées. L'augmentation de la sécrétion de TGF-β trouvé ici par les cellules greffées marginales pourrait être lié à la réparation des tissus et aurait pu se produire par la nécessité de la réparation continue, puisque la présence constante de soins dentaires sulcus microbiote induit des changements marginaux.
Enfin, les résultats indiquent que ni fibroblastes de la muqueuse palatine, ni de la greffe gingivale VEGF ni CXCL16 sécrétée marginal, selon les stimuli utilisés. Des études antérieures [31, 32] ont montré que les fibroblastes gingivaux humains stimulés par le LPS, la vésicule et des protéines de Pg
et de la membrane extracellulaire de Aa étaient capables de produire VEGF lorsqu'ils sont stimulés par ces agents. Peut-être dans cette étude, le temps et la concentration de LPS utilisés ne sont pas suffisantes pour l'induction de VEGF. En ce qui concerne CXCL16, il a été rapporté que cette expression a été induite par d'autres cytokines telles que l'IFN-γ et TNF-α, et de leur sécrétion a été médiée par ADAM 10 récepteur membranaire, qui régule la fonction CXCL16 sur les tissus enflammés [33]. Un autre travail [19] a montré que l'expression de CXCL16 par les fibroblastes gingivaux a été contrôlée par plusieurs cytokines telles que l'IL-1β, TNF-α et IFN-γ. En fait, on pourrait supposer que CXCL16 la sécrétion n'a pas été détecté dans l'étude actuelle, car les fibroblastes ont été stimulées uniquement par le LPS bactérien, et l'action d'autres cytokines ou d'autres stimuli pourrait être nécessaire pour la sécrétion de CXCL16 par les fibroblastes gingivaux [19, 33].
la sécrétion hétérogène de médiateurs de l'inflammation et de réparation peut indiquer que les fibroblastes greffés sur une nouvelle région (marge gingival) anatomique peut être influencée par le microenvironnement au moment où ces cellules sont en contact avec des produits bactériens, participer plus efficacement dans le cadre de Conclusions
fibroblastes de la muqueuse palatine la réponse inflammatoire. de présenter un comportement adaptatif concernant cytokines sécrétion quand ils sont greffés sur la marge gingivale, montrant la différence dans la sécrétion de médiateurs inflammatoires importants pour le parodonte homéostasie marginal.
les abréviations
Pg:
Porphyromonas gingivalis
Ec:
Escherichia coli
ELISA :
Enzyme-Linked immunosorbent assay
LPS:
lipopolysaccharide
DMEM:
milieu d'Eagle modifié de Dulbecco
FBS: sérum bovin fœtal
FSP:
Fibroblast protéine de surface
BSA:
de sérum albumine bovine
DAPI:
49,6-diamidino-2-phénylindole
DMSO:
Dimethylsulfoxide
MTT:.
[3- (4,5-diméthylthiazol-2-yl) -2,5-diphényltétrazolium de
Déclarations de REMERCIEMENTS
Il n'y a pas de conflits d'intérêts liés à cette étude. Cette étude a été financée en partie par la Fondation de recherche de São Paulo (FAPESP; Grant # 2010 /01230-1 au CFS) et par le Conseil national pour le développement scientifique et technologique (CNPq; accorder # 480160 /2013-9 à CFS) <. br> auteurs de fichiers originaux soumis pour les images
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les auteurs déclarent qu'ils ont aucun conflit d'intérêts.
auteurs contributions
FPA, ACFM, CRS, CFS et SCORIES conçu et planifié le projet. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.
