Résumé de l'arrière-plan
plaque dentaire formée sur la surface des dents est un écosystème complexe composé de diverses bactéries orales et des composants salivaires. L'accumulation de la plaque dentaire est un facteur de risque de caries dentaires et les parodontopathies. La L-arginine a été rapporté pour diminuer le risque de carie dentaire par élévation de pH de la plaque grâce à l'activité de l'arginine déiminase chez les bactéries orales. Ici, nous avons évalué le potentiel de la L-arginine pour éliminer les biofilms buccaux établies.
Méthodes
biofilms ont été formées en utilisant la salive humaine mélangés avec un bouillon cœur-cervelle additionné de 1% de saccharose dans des plaques multi-puits ou sur un disque en plastique. Après lavage des biofilms avec une solution saline, du citrate (10 mM, pH 3,5) ou de la L-arginine (0,5 M, pH 3,5), les biofilms retenues ont été analysées par coloration au cristal violet, la microscopie électronique à balayage, et à base d'ADNr 16S Illumina le lavage: Résultats de séquençage. avec acide L-arginine biofilms buccaux détachés plus efficacement que la solution saline et la masse de biofilm significativement réduite conservées dans des plaques multi-puits ou sur un disque en plastique. Analyse de la microflore à base d'Illumina a montré que le citrate (pH 3,5), de préférence lavée Streptococcus
de biofilm par voie orale mature, tandis acide L-arginine préparée avec tampon citrate 10 mM (pH 3,5) de façon non spécifique élimine les composants microbiens voie orale Conclusions du biofilm.
acide L-arginine préparé avec un tampon citrate (pH 3,5) efficacement déstabilisés et enlevés biofilms oraux matures. La solution acide L-arginine décrite ici pourrait être utilisé comme un additif qui améliore l'efficacité de la bouche rinçages utilisé dans l'hygiène buccale.
L-arginine biofilm Mouth Mot rinçage microbiome oral Saliva électronique matériel supplémentaire
en ligne version de cet article (doi:. 10 1186 /s12903-016-0194-z). contient du matériel supplémentaire, qui est disponible pour les utilisateurs autorisés
Contexte
Il existe des preuves que l'accumulation de la détérioration de l'hygiène buccale est associée avec la maladie parodontale [1] ainsi que le risque accru de maladies cardiovasculaires [2, 3], le syndrome métabolique [4, 5], et la naissance avant terme [6]. soins d'hygiène bucco-dentaire est également reconnue comme une mesure essentielle qui réduit les risques pour la pneumonie associée aux soins (HCAP). biofilms oraux peuvent servir de réservoirs pour les bactéries liées à la pneumonie, comme le suggère la similitude entre microbiote orale et des échantillons de HCAP cliniques [7-9]. De nombreux essais cliniques qui a enquêté sur l'efficacité des soins d'hygiène bucco-dentaire sur la prophylaxie pour HCAP, y compris la pneumonie résultant de la ventilation mécanique, ont été rapportés. Ces essais ont trouvé: (i) les mesures mécaniques et chimiques hygiène bucco-dentaire ont réduit le taux de respiration pathogène colonisation microbiote orale [10, 11]; (Ii) les soins d'hygiène bucco-dentaire soit avec un bain de bouche de chlorhexidine ou de gel a été associé à une réduction de 40% dans la pneumonie associée à la ventilation chez les adultes gravement malades [12]; et (iii) le nettoyage mécanique par voie orale a réduit significativement le risque de pneumonie fatale [13].
cavités orales contiennent microbiote diverses que le nombre de près de 700 espèces [14]. Cet écosystème comprend des bactéries du biofilm formation tels que Streptococcus mutans
, Fusobacterium nucleatum
, Porphyromonas gingivalis
et Actinobacillus actinomycetemcomitans
. Bien que le microbiote varie selon les individus, au sein d'un individu donné le microbiome oral est relativement stable [15]. Cependant, la composition microbienne buccale peut changer rapidement dans des conditions de compromis qui peuvent se produire pendant les hospitalisations [16]. Par conséquent, par voie orale des soins d'hygiène pour les patients gravement malades est particulièrement important de prévenir la colonisation de bactéries ou de prolifération de pathogènes respiratoires multirésistantes. hygiène buccale inadéquate peut entraîner la formation de la plaque dentaire matures sur les surfaces dentaires ou des cellules épithéliales orales, et cette plaque peut être résistante au nettoyage par un rinçage à l'eau ou même avec le manuel brossage des dents, ce qui met en évidence la nécessité de stratégies efficaces qui suppriment biofilm orale formation. Divers essais pour tester la capacité des extraits de plantes [17], les désinfectants [18, 19], les inhibiteurs de la production de polysaccharide [20, 21], et les sucres rares [22] pour réduire la formation de biofilms buccaux ont été menées.
Récemment , des agents alcalins tels que les générateurs de l-arginine et de l'urée ont été prédits pour inhiber la croissance des bactéries acidogènes ou aciduriques en augmentant le pH de l'environnement oral [23]. Le métabolisme de la L-arginine et l'arginine désiminase de l'urée par l'uréase et, respectivement, produit de l'ammoniac. De nombreuses bactéries orales possèdent un système d'arginine déiminase, qui metabolise la L-arginine pour produire de l'ornithine et de l'ammoniac qui augmente le pH de biofilms par voie orale. Des essais cliniques sur L-arginine contenant ou dentifrices bains de bouche ont montré un effet protecteur contre le développement de la carie dentaire chez les sujets jeunes [24, 25]. En outre, la L-arginine et de fluorure synergétique supprimé la croissance et la formation de biofilm de S. mutans [26].
L-arginine est un acide aminé basique contenant un groupement guanidique. Comme le chlorhydrate de guanidine, L-arginine peut augmenter la solubilité des protéines et de supprimer l'agrégation des protéines [27]. Bien que le mécanisme précis pour l'inhibition de la L-arginine à médiation par des interactions protéine-protéine reste peu claire, la L-arginine peut modifier les tensions de surface des protéines par interaction avec des protéines ou de l'eau qui les entoure, sans la fixation étanche observés avec d'autres agents tels que le chlorhydrate de guanidine [28]. Étant donné que cette interaction légère préserve les fonctions des protéines, la L-arginine a été utilisée pour la solubilisation des protéines ou des anticorps exprimés de manière exogène pour une utilisation pharmaceutique. En outre, la L-arginine a été récemment rapportée à diminuer l'infectivité des virus enveloppés tels que le virus herpès simplex et le virus de la grippe, probablement due à une fonction compromise de protéines dans l'enveloppe [29]. Le plus biofilm par voie orale est un écosystème complexe qui est composé de diverses bactéries, des glucanes insolubles et les glycoprotéines salivaires. La suppression de cette plaque biologique solide à partir de la surface des dents par rinçage à l'eau simple, ou même avec un brossage mécanique peut être difficile. plaque résiduelle sert également de base pour une formation de biofilm. Étant donné que la L-arginine est prévu pour inhiber la formation de biofilm par voie orale, et également déstabiliser les agrégats complexes dans la plaque dentaire, l'inclusion de cet acide aminé dans un bain de bouche peut faciliter l'élimination du biofilm par voie orale. Méthodes de Dans cette étude, nous avons évalué le potentiel de L-arginine comme un nettoyant pour éliminer les biofilms buccaux déjà établies.
Tuer essai pour Streptococcus mutans
Glycérine stocks de S. mutans
GS5 ont été striés sur le cerveau Heart Infusion (BHI) des plaques d'agar qui ont ensuite été incubées en anaérobiose à 37 ° C pendant 48 h. la culture anaérobie a été effectuée à l'aide d'un système de AnaeroPack (Mitsubishi Gas Co., Ltd.). Plusieurs colonies de S. mutans
GS5 ont été inoculées dans un bouillon BHI et cultivées à 37 ° C pendant 48 h. Les cultures ont été centrifugés à 15.000 tpm pendant 5 minutes et remises en suspension dans du sérum physiologique. Les suspensions bactériennes (0,1 ml) ont été ajoutés à 0,9 ml de solution saline, 10 mM de citrate (pH 3,5) ou 0,5 M de L-arginine dans 10 mM de citrate (pH 3,5 de). Après incubation pendant 5 min à 37 ° C, de dilutions en série de 10 fois avec du tampon phosphate salin (PBS, pH 7,4) ont été préparées et 0,1 ml de la dilution appropriée a été étalée sur des plaques de gélose BHI. Après une incubation de 72 h en anaérobiose à 37 ° C, le nombre de colonies a été compté et comparé au nombre dans le traitement de la solution saline. Le plus biofilm essai d'inhibition
Afin d'évaluer l'effet inhibiteur sur S. mutans
GS5 biofilm la formation, 0,1 ml de sérum physiologique, le citrate 10 mM (pH 3,5) ou 0,5 M de l-arginine pH3.5-7.0 (ajustée à 10 mM de tampon citrate) ont été mélangés avec un volume égal de la suspension bactérienne (1% v /v de 48 h culture) dans 2 x BHI contenant 2% de saccharose. Les mélanges ont été ajoutés aux plaques à 96 puits et mises en incubation en anaérobiose à 37 ° C. Après une culture de 24 h, les biofilms formés sur le fond des puits ont été quantifiées par coloration au cristal violet comme décrit ci-dessous.
Collection d'échantillons salivaires humaines
Après consentement éclairé a été obtenu à partir de neuf volontaires sains (vieux 21-27 ans , mâle), ils ont été invités à recueillir la salive excrétée lors de la mastication de la gomme de cire pendant 5 min. Les critères d'exclusion étaient plus jeunes que 20 ans ou ayant reçu un traitement antibiotique dans les 4 semaines précédentes.
effet Cleansing de L-arginine sur biofilm orale formée sur des disques en plastique
biofilms buccaux humains ont été formés sur 13,5 mm des disques en plastique stériles (Sensi-Disc, Sumitomo Bakelite, Co., Ltd., Tokyo), situé dans des boîtes de culture de 24 puits. Les disques ont été incubés dans 0,5 ml de BHI contenant 1% de saccharose et 20% de la salive humaine recueillies auprès de trois volontaires sains (N ° 1 à n ° 3). Après une culture de 72 h anaérobie, les disques ont été retirés et lavés une fois avec une solution saline. Les biofilms sur les disques ont été encore lavés avec 0,5 ml de 10 mM de citrate (pH 3,5), 0,5 M chacun de L-arginine, la L-alanine, la L-glycine ou la L-lysine (tous ajusté le pH à 3,5 par 10 mM citrate) en agitant pendant 30 min à 37 ° C. Les disques ont ensuite été lavées à nouveau avec 0,5 ml de PBS (pH 7,4), colorées avec 0,5 ml de 0,01% de cristal violet pendant 20 min à température ambiante. Les disques ont ensuite été lavées quatre fois avec 1,0 ml de solution saline et séché à l'air. Après la prise de photographie, le colorant restant a été élue avec de l'acide acétique 0,5 ml à 33% en agitant pendant 30 minutes à la température ambiante. L'absorbance de l'éluant à 550 nm a ensuite été mesurée.
Dosage salivaire humaine nettoyant sur le biofilm en utilisant la salive humaine du micropuits recueilli à partir de quatre volontaires en bonne santé (n ° 4 n ° 7) ont été ajoutés BHI contenant 1% de saccharose à 20 % (v /v). biofilms buccaux humains modifiés ont également été préparés en ajoutant GS5 les cultures de 48 h S. mutans (1% du volume final) pour simuler biofilm cariogène. Chaque mélange (0,1 ml) a ensuite été ajouté à des plaques à 96 puits et mis en incubation en anaérobiose à 37 ° C. Au bout de 72 h, les cultures ont été retirées, et le biofilm formé sur le fond des plaques a été lavée une fois avec 0,2 ml de sérum physiologique. Chaque puits a ensuite été lavé avec 0,1 ml de sérum physiologique (témoin), 10 mM de citrate (pH 3,5, un solvant de la L-arginine dans cette étude), soit 0,5 M de L-arginine (pH 3,5) en agitant pendant 30 min à 37 ° C C. Les réactifs ont été décantés et chaque puits a été lavé trois fois avec 0,2 ml de sérum physiologique. Le biofilm restant a été coloré avec 0,1 ml de 0,01% de cristal violet pendant 20 min à température ambiante. Après coloration, les puits ont été lavés quatre fois avec 0,2 ml de sérum physiologique, et le colorant restant a été élue avec de l'acide acétique 0,2 ml à 33% en agitant pendant 30 minutes à la température ambiante. L'absorbance de l'éluant à 550 nm a ensuite été mesurée. Six puits ont été utilisés pour chaque échantillon dans un seul dosage. Les analyses ont été répétées trois fois de façon indépendante. La microscopie électronique à balayage
biofilms buccaux humains ont été formés sur 13,5 mm des disques en plastique stériles en utilisant les échantillons de # 4 à # 7. Les disques ont été incubées dans 0,5 ml de BHI contenant 1% de saccharose et 20% de la salive humaine. Après une culture de 72 h anaérobie, les disques ont été retirés et lavés une fois avec une solution saline. Les biofilms sur les disques ont ensuite été lavées avec 0,5 ml de sérum physiologique, le citrate 10 mM (pH 3,5) ou 0,5 M de L-arginine (pH 3,5) en agitant pendant 30 min à 37 ° C. Les disques ont ensuite été lavées à nouveau avec 0,5 ml de PBS (pH 7,4), et les biofilms sur les disques ont été fixées avec 2% de glutaraldéhyde dans 0,1 M de tampon cacodylate (pH 7,2). Après fixation, les biofilms ont été déshydratées dans une série d'éthanol classés et séchés dans un PCP-2 point critique appareil de séchage Hitachi. Les disques ont été revêtus de platine /palladium dans un Hitachi F-102 par pulvérisation cathodique coucheuse et examinées avec un microscope électronique à balayage JEOL JCM-6000. La zone de biofilm retenue après lavage avec chaque réactif d'essai a été mesurée à l'aide de l'outil d'auto-sélection de couleur dans Photoshop CS6. Les ratios de la zone de biofilm à la zone d'observation totale de valeur de pixel ont été calculées à partir de cinq champs sélectionnés au hasard à 100x de grossissement.
Microbial analyse de la composition par séquençage de l'ADNr 16S
Le microbiome salivaire des six volontaires sains (N ° 4- # 9 ) a été caractérisée par Illumina Miseq ADNr 16S analyse de séquençage de l'ADN extrait de 3 ml de salive. Afin d'identifier les groupes microbiens qui sont sensibles au citrate ou de la L-arginine rinçage, les biofilms de salive humaines dérivées formées sur des disques en matière plastique de 13,5 mm ont été lavés avec les réactifs d'essai décrits ci-dessus. Les réactifs ont ensuite été récupérées et les bactéries provenant des lavages ont été recueillies par centrifugation (fraction délavée). Les disques ont été lavés trois fois avec 0,5 ml de sérum physiologique, coupé en morceaux avec des ciseaux stériles, puis transférées dans 0,5 ml de sérum physiologique pour la sonication avec une Bioruptor (Cosmobio, 3 x 1 min avec un intervalle de 1 minute, réglage de la sortie H). Les biofilms individuelles ont été collectées par centrifugation (fraction prolongée). L'ADN à partir des deux fractions est également purifié et la composition microbienne déterminée par analyse de l'ADNr 16S de séquençage.
L'extraction d'ADN a été effectuée selon la méthode décrite par Morita et al. [30]. bibliothèques de séquençage ont été préparés par amplification de la région V3-V4 de l'ADNr 16S en utilisant les amorces décrites par Klindworth et al. [31]. Après amplification initiale, une deuxième PCR a été réalisée pour fixer les adaptateurs Illumina, ainsi que des codes à barres qui ont permis pour le multiplexage. Les amplifications ont été effectuées dans 25 réactions ul contenant 2,5 ul modèle dilué, 12,5 pi 2x KAPA HiFi HotStart Ready Mix et 2,5 pi de chaque amorce. cyclage thermique consistait en une étape de dénaturation initiale (3 min à 95 ° C), suivie de 25 cycles de dénaturation (30 s à 95 ° C), de recuit (30 s à 55 ° C) et 30 de l'extension à 72 ° C. L'étape finale d'extension est composée de 5 min à 72 ° C. Amplicons ont été purifiés en utilisant des billes AMPure XP (Beckman Coulter). Le séquençage a été réalisé sur la plate-forme Illumina MiSeq (Kit de réactif MiSeq v. 3, 600 cycles) selon les spécifications du fabricant pour générer des paires de gamme lit de 300 bases dans chaque direction. Un total de 10381210 2 x 300 paires de bases se lit avec une moyenne de 432.550 lectures par échantillon a été obtenu. Les séquences des amorces ont été coupées, et la fin appariés lectures fusionnées en utilisant Fastq-join [32] avec les paramètres par défaut et traités avec le pipeline QIIME 1.8.0 [33]. Après un contrôle de chimère par Usearch, 20,000 Illumina lit par échantillon (score de qualité moyenne 20) ont été choisis au hasard pour une analyse plus approfondie. Utilisation de la UCLUST [34] algorithme intégré dans le pipeline de QIIME, les séquences ont été regroupées à & gt; 97% d'identité contre la base de données de référence Greengenes, produisant 635 unités taxonomiques opérationnelles (UTO). Utilisation du pipeline QIIME, les distances de UniFrac non pondérées ont été produites et utilisées pour étudier la diversité beta en traçant PCA coordonne les données de séquence de nucléotides de seqeunce de ont été déposés dans la base de données DDBJ (numéro d'accession: DRA004109, PRJDB4298, SAMD00042426-SAMD00042441).. l'analyse statistique de la statistique
des données a été réalisée avec StatFlex ver. 6.0 (Artech Co., Ltd., Tokyo) en utilisant une analyse de variance (ANOVA) pour comparer les moyens de tous les groupes et suivis par le test de Tukey pour comparer les moyennes de chacun des deux groupes. Les données ont été considérées comme significativement différentes si la valeur p
2-queue a été inférieur à 0,05 consentement éthique
. Et de la salive humaine des autorisations ont été recueillies à partir de neuf volontaires sains après consentement éclairé a été obtenu. L'approbation éthique a été obtenue auprès du comité d'éthique de la Faculté de médecine, Université de Kagawa (numéro de référence, 27-074).
Consentement à publier
Les auteurs obtenu le consentement de tous les participants à publier les données d'analyse sous effet inhibiteur: Résultats de anonymisation liable. de la l-arginine sur S. mutans
formation de biofilm GS5
tests de biofilms ont été effectués pour déterminer l'effet de la l-arginine sur S. mutans
GS5 biofilm la formation dans des conditions de pH allant de neutre à acide (pH3.5-7.0). En premier lieu, la culture de S. mutans
GS5 ont été ajoutés à 2 x BHI contenant 2% de saccharose à 2% (v /v). La suspension bactérienne (0,1 ml) a ensuite été mélangé avec une solution saline, du citrate 10 mM (pH 3,5) ou 0,5 M de chacune des solutions de L-arginine a ajusté son pH (3,5 à 7,0) et appliqué sur les micropuits. Après 24 h de culture anaérobie, le biofilm de S. mutans a été quantifiée par coloration au cristal violet. Comme on le voit sur la Fig. 1, la L-arginine solutions (concentration finale 0,25 M) qui ont été ajustés à pH 3,5 ont inhibé de manière significative S.mutans
biofilm après 24 h de culture par comparaison avec une solution saline ou un tampon témoin (citrate 5 mM, pH 3,5) . L'effet de la L-arginine était dépendante du pH, caractérisé en ce que des solutions de L-arginine ajusté à pH 3,5 la formation de biofilm significativement inhibée. En outre, cette inhibition est peu susceptible d'être due à un effet bactéricide, car tampon citrate 10 mM (pH 3,5) et L-arginine, ajustée à pH 3,5 réduit S.mutans
nombre GS5 de seulement 0,61 ± 0,30 et 0,49 ± 0,22 log
10 UFC /ml lors d'un contact de 5 minutes, respectivement, et la densité optique de la culture de S. mutans
après 24 heures d'incubation ne différait pas entre les échantillons avec et sans solution de l-arginine 0,25 M (pH 3,5). Ces résultats suggèrent que les acides L-arginine déstabilise la structure du biofilm et /ou réduit la production de glucane insoluble de S. mutans ce membre. Sur la base de ces résultats, les solutions acides L-arginine ajustée à pH 3,5 ont été utilisés pour des analyses ultérieures. Figue. 1 dépendant du pH inhibition de S. mutans
GS5 formation d'un biofilm par la L-arginine. Dilué S. mutans
cultures GS5 et réactifs de test ont été mélangés à 1: 1. Après que les mélanges ont été mis en culture en anaérobiose à 37 ° C pendant 24 h, les biofilms de S. mutans qui se sont formés au fond des micropuits ont été quantifiées par coloration au cristal violet. Une solution saline (S), 10 mM de citrate pH 3,5 (à CA3.5) ou de solution de L-arginine 0,5 M ajusté avec tampon citrate 10 mM à un pH compris entre 3,5 et 7,0 (comme indiqué LA3.5-LA7.0) ont été utilisés comme des réactifs d'essai. Les données sont exprimées en moyenne ± écart-type. * Significativement différent de solution saline (p
& lt; 0,05) ** Significativement différent de citrate 10 mM (pH 3,5) (p
& lt; 0,05)
effet Cleansing de solution d'acide L-amino sur oral biofilm
biofilm Saliva dérivé a été préparé sur des disques en plastique en utilisant les échantillons de salive des adultes en bonne santé (n ° 1, n ° 2 et n ° 3). Après que le biofilm a été lavé avec du citrate 10 mM (pH 3,5), 0,5 M chacun de L-arginine, la L-glycine, la L-lysine ou de solutions de L-alanine, qui a été ajusté le pH à 3,5. Comme on le voit sur la Fig. 2a, les taches de cristal violet sur les disques lavés avec de la L-arginine étaient inférieures à celles lavées avec du tampon citrate ou trois autres acides L-aminés testés. Les colorants violets cristallins ont été élues avec de l'acide acétique, et l'absorbance à 550 nm de l'éluant a été mesurée pour quantifier les biofilms de retenue sur les disques. Comme on le voit sur la Fig. 2b, la L-arginine réduit biofilm salivaire humaine plus efficacement que d'autres acides aminés L, bien que la différence significative n'a été observée. Figue. 2 effet de nettoyage de L-arginine sur le biofilm formé sur salivaire disques en plastique. une coloration au violet de cristal du biofilm de retenue sur les disques après le lavage. Le biofilm formé sur le disque en matière plastique a été lavé pendant 30 min avec 10 mM de tampon citrate (pH 3,5 à; Cit), 0,5M chacun de L-arginine (Arg), L-glycine (Gly), la L-lysine (Lys), ou l-alanine (Ala), qui ont été ajusté le pH à 3,5 avec 10 mM de tampon citrate. b Quantification de retenue salivaire de biofilm sur les disques. Le cristal violet a été élue à partir des disques présentés dans le panneau A avec de l'acide acétique et leur absorbance à 550 nm a été mesurée. Les valeurs relatives à l'échantillon de citrate sont présentés
effet déstabilisateur de acide L-arginine sur les biofilms oraux
Pour mieux évaluer l'effet de déstabilisation de acide L-arginine (pH 3,5) sur biofilm orale humaine, les échantillons de salive ont été prélevés quatre volontaires sains (n ° 4, n ° 5, n ° 6, et n ° 7). Illumina à base d'ADNr 16S analyse de séquençage a montré que ces échantillons contenaient microbiome conforme à plusieurs rapports précédents sur la salive humaine [35, 36]: Streptococcus
(, taux le plus prédominant abondance de 23,2 à 44,5% dans cette étude), Prevotella
, Neisseria
, Veillonella
, Rothia
, Fusobacterium
, Gemella
, Porphyromonas
, Haemophilus
, Granulicatella,
et Actinomyces
ont été couramment détectée comme des genres abondants (voir fichiers supplémentaires 1, 2 et 3 pour un résumé détaillé des taux d'abondance).
Les échantillons de salive ont été ajoutés aux micropuits contenant BHI et 1% de saccharose (20% v /v), et biofilms ont été formés suivant incubation anaérobie pendant 72 h. Fait intéressant, les caractéristiques du biofilm différaient entre les échantillons, dans lequel les biofilms salivaires de deux individus (n ° 5 et n ° 6) étroitement attachés aux puits (définis comme biofilms solides), tandis que les deux autres (n ° 4 et n ° 7) ont été facilement détachés par le lavage avec une solution saline (définie comme étant fragiles biofilms) (Fig. 3a). Laver les puits avec acide L-arginine détachés plus biofilms de n ° 5 et n ° 6 de la solution saline a fait (p
& lt; 0,05), tandis que le citrate 10 mM (de pH 3,5) seul était similaire à celle d'une solution saline. Figue. 3 Déstabilisation des biofilms buccaux par acide L-arginine. Nettoyage effet d'une solution saline, 10 mM de citrate (pH 3,5) ou de la L-arginine dans le citrate 10 mM (pH 3,5) sur les biofilms établis en utilisant la salive humaine seule (a) ou de la salive humaine mélangée avec S. mutans
GS5 (1 % v /v) (b) a été examinée. Les biofilms de salive humaines dérivées ont été préparés micropuits. Après un lavage avec des réactifs d'essai, les biofilms soutenus ont été colorées avec du cristal violet. Les chiffres indiquent les ID des bénévoles. Saline, 10 mM de citrate (pH 3,5) et acide L-arginine (pH 3,5) sont indiquées par des colonnes bleues, rouges et verts, respectivement. Les données sont exprimées en tant que moyenne ± écart-type, et l'analyse statistique a été réalisée par ANOVA suivie d'un test de Tukey. Le p
-values moins de 0,05 ont été considérés comme
significatif Pour simuler le biofilm cariogène, S. mutans
GS5 a été ajouté à 1% du volume de puits final. L'addition de S. mutans
GS5 a modifié la structure du biofilm et l'augmentation de la fixation dans les puits, en particulier dans des échantillons de salive qui se sont formés biofilms fragiles (3 Fig. 4 et complémentaires fichier). Similaire à l'essai de nettoyage sans biofilm de S. mutans
GS5, acide significativement plus détaché biofilm L-arginine, dérivé de la salive # 5 et # 6 (Fig. 3a). En revanche, la souche contenant un biofilm GS5 devient sensible à un lavage avec du citrate 10 mM (pH 3,5) (Fig. 3b). Pendant ce temps, acide L-arginine (pH 3,5) et de citrate 10 mM (pH 3,5) ont également tendance à réduire les biofilms formés par des échantillons de salive fragiles biofilm formation (# 4 et # 6) et S. mutans
GS5, mais aucune différence significative n'a été observée la structure du biofilm de. après lavage à l'acide l-arginine
pour comparer davantage la salive humaine (# 4 à # 7) biofilm -derived après le lavage avec une solution saline, le citrate (pH 3,5), ou acide L-arginine (pH 3,5), la microscopie électronique à balayage (SEM) a été réalisée. On a préparé un biofilm sur un disque plastique à l'aide de chacun des échantillons de salive et lavé avec trois solutions d'essai (solution saline, du citrate à 10 mM pH 3,5, ou 0,5 M de L-arginine pH 3,5). La zone de biofilm de retenue après le lavage a été quantifiée à cinq champs choisis au hasard SEM par logiciel Photoshop CS6. Comme on le voit sur la Fig. 4, la masse de biofilm a été réduit au plus haut degré par acide L-arginine (pH 3,5). Pour les échantillons lavés avec une solution saline et 10 mM de citrate (pH 3,5), objets épais, tapis-like ont été retenus après le lavage, alors acide L-arginine éliminé la majorité de ces structures (fichiers supplémentaires 5). Figue. 4 Quantification de biofilm orale soutenue après le nettoyage. biofilms oraux ont été formés sur des disques en plastique par la culture anaérobie dans un bouillon BHI contenant du saccharose (1%) et de la salive humaine (10%). Après une culture de 72 h à 37 ° C, les disques ont été lavés avec 1 ml de PBS (pH 7,4). Les disques ont ensuite été lavés avec 1 ml de solution saline, le citrate 10 mM (pH 3,5) ou 0,5 M de L-arginine (pH 3,5) pendant 30 min avant de le fixer avec 2% de glutaraldéhyde dans 0,2 M de tampon cacodylate pour la microscopie électronique à balayage. zones biofilms ont été mesurés à l'aide d'un outil d'auto-sélection de couleur dans Photoshop CS6, et les ratios par rapport au champ total d'observation ont été calculées. Au moins cinq champs choisis au hasard ont été examinés. Les données sont exprimées en tant que moyenne ± écart-type, et l'analyse statistique a été réalisée par ANOVA suivie d'un test de Tukey. Le p
-values moins de 0,05 ont été considérés comme des groupes bactériens oraux
significatifs sensibles à un rinçage à l'acide L-arginine
base-Illumina ADNr 16S analyse de séquençage a été réalisée pour identifier les groupes bactériens qui étaient sensibles à la rinçage à l'acide L-arginine. Nous avons testé biofilm salivaire à partir d'échantillons # 4 et # 5 pour représenter biofilms solides et fragiles, respectivement. biofilms salivaire ont été préparées sur le disque en plastique et on les lave avec du sérum physiologique, 10 mM de citrate (pH 3,5) ou 0,5 M de L-arginine (pH 3,5) pendant 30 min. Les biofilms individuelles dans les solutions d'essai ont été collectées par centrifugation (fraction délavée). Les biofilms de retenue sur les disques ont été détachés par sonication et collectées par centrifugation (en conservant fraction). Les ADN ont été purifiés à partir des deux factions. Comme on le voit sur la Fig. 5, Streptococcus
et Lactobacillus
partagé 86,8 à 98,3% des populations de biofilm dans les deux fractions retenues et délavées. biofilm solide (# 5) contenait plus Lactobacillus
que biofilm fragile (n ° 4). Fait intéressant, la proportion du Streptococcus dans la fraction lavée avec un tampon citrate (10 mM, pH 3,5) était plus élevé que chez ceux avec une solution saline ou 0,5 M L-arginine (pH 3,5). D'autre part, Lactobacillus
tendance à retenir sur les disques après le lavage avec du citrate (pH 3,5). Ces résultats indiquent que le citrate (pH 3,5), de préférence lavée Streptococcus
des deux types de biofilm. D'un autre côté, le profil microbienne des fractions de lavage traitées par acide L-arginine était similaire à celle observée pour une solution saline, ce qui indique que les acides L-arginine (pH 3,5) de façon non spécifique détaché les bactéries de biofilm formé sur les disques en plastique. Figue. 5 Analyse comparative du microbiote des fractions continues et délavées avec acide L-arginine. Fragile (du n ° 4) et des biofilms solides (# 5) sont formés sur des disques en plastique, qui ont été ensuite lavées avec une solution saline (S), 10 mM de citrate pH 3,5 tampon (CA), ou acide L-arginine (LA). La composition microbienne de la fraction restante sur les disques et la fraction délavée ont été comparés par la société Illumina ADNr 16S analyse de séquençage
Discussion
Arginine désiminase dans des bactéries orales métabolise L-arginine qui à son tour augmente le pH de la environnement buccal, ce qui peut supprimer la formation de caries dentaires. Ainsi, la L-arginine a été explorée comme un supplément potentiel pour les soins d'hygiène buccale [37]. En outre, des concentrations élevées de L-arginine (5,0-10,0%) ont été signalés pour inhiber la formation de biofilm de S. mutans cariogènes
[26]. Dans cette étude, nous avons exploré l'effet de nettoyage de la L-arginine sur les biofilms par voie orale pour démontrer les avantages de cet acide aminé de base pour les soins d'hygiène bucco-dentaire. l'inhibition de la L-arginine de S. mutans
formation de biofilm est en effet dépendante du pH (Fig. 1), car dans la gamme des valeurs de pH testées (3,5 à 7,0), la réduction significative de la formation de biofilm ont été observés seulement à pH 3,5 . Par conséquent, nous avons testé des concentrations relativement élevées (0,5 M) de acide L-arginine (pH 3,5) dans cette étude, et a montré l'efficacité de cette solution pour éliminer les biofilms oraux déjà établis. Étant donné que la L-arginine augmente la solubilité des protéines en affectant les interactions protéine-protéine et cet effet se manifeste à des conditions acides [38, 39], l'effet nettoyant sur les biofilms oraux acide L-arginine qui a été observée ici est probablement dérivée d'une déstabilisation des bactéries agrégation.
au cours de cette étude, Kolderman et al. a rapporté l'effet déstabilisateur de la L-arginine sur les biofilms formés par la salive mise en commun de six volontaires en bonne santé [40]. Cette étude a indiqué que le pH neutre L-arginine (0,1-0,5 M) efficacement déstabilisé biofilm orale. Ici, nous avons montré que le pH acide de la L-arginine non seulement déstabilisée biofilm orale chez l'homme, mais aussi la formation de biofilm inhibée par S. mutans Le plus, bien qu'il soit difficile de comparer les résultats des deux études en raison de différences dans le système de dosage de biofilm utilisé: l'al Kolderman et. étude a utilisé filtré, la salive acellulaire comme élément nutritif, alors qu'ici nous avons utilisé BHI contenant 1% de saccharose comme moyen de support pour la formation de biofilm. Le saccharose est un sucre cariogène qui améliore le volume et la solidité de biofilm orale. L'effet du saccharose sur la formation de biofilm orale in vitro a été clairement observé dans cette étude, dans laquelle le saccharose ajouté apparemment modifié la masse de biofilm et sa composition avec une augmentation marquée du nombre de bactéries en forme de tige (fichier complémentaire 4). Considérant que Streptococcus et Lactobacillus
sont les composantes prédominantes des biofilms orales testées dans cette étude (fig. 5), ces bactéries en forme de bâtonnet sont susceptibles lactobaclli. Ces solides-biofilms formés dans des milieux riches peuvent être difficiles à éliminer par neutre L-arginine, et des conditions acides peuvent faciliter la déstabilisation des agrégats par L-arginine. En fait, Ikeda et al. a révélé que l'effet antiviral de 0,7 M de L-arginine du type de virus de la grippe A était le plus évident lorsque le pH est inférieur à pH 5,0 [41].
Nous avons sélectionné un tampon de citrate pour ajuster le pH de la solution de L-arginine, car cela l'acide a une activité de chélation. L'effet inhibiteur d'agents chélateurs sur biofilm microbien est bien connu, comme en témoigne l'utilisation fréquente de l'EDTA ou citrate dans des solutions de verrouillage de cathéter. Co-agrégation de S. mutans et Lactobacillus
a été signalé comme étant dépendante du calcium [42], alors que des liens étroits au sein des bactéries de S. mutans à Streptococcus de les biofilms médiées par lectines glucane de liaison sont
