Résumé de l'arrière-plan
os recombinant protéine morphogénétique deux (rhBMP2) a été utilisé pour une variété d'applications cliniques en chirurgie orthopédique et une intervention dentaire. Malgré son utilisation répandue, des préoccupations ont été soulevées au sujet de sa demi-vie courte et bioactivité transitoire in vivo. Des recherches récentes visant à développer rhBMP2 synthétisé à partir d'une chaîne plus courte de polypeptide (108 acides aminés) a été entrepris.
Méthodes
Les propriétés osteopromotive de BMP2 ont été étudiés sur le comportement cellulaire. Cinq concentrations de rhBMP2_108 y compris 10, 50, 100, 200 et 500 ng /ml ont été comparés à un rhBMP2 disponible dans le commerce (100 ng /ml de). Chacune des concentrations de travail de rhBMP2_108 ont été étudiés sur les ostéoblastes MC3T3-E1 pour leur capacité à induire le recrutement des ostéoblastes, de la prolifération et de la différenciation telle qu'évaluée par la phosphatase (ALP), la coloration alcaline, coloration au rouge d'alizarine et de PCR en temps réel pour les gènes codant pour l'ALP, l'ostéocalcine (OCN), le collagène-1 résultats de (COL-1) et Runx2.
Les résultats démontrent que toutes les concentrations de rhBMP2_108 améliorées de manière significative le recrutement et la prolifération cellulaire des ostéoblastes à 5 jours après l'ensemencement. En outre, rhBMP2_108 a eu les effets les plus prononcés sur la différenciation des ostéoblastes. Il a été constaté que rhBMP2_108 avait plus de quatre augmentation significative fois de l'activité de l'ALP à sept et 14 jours après l'ensemencement et les concentrations allant de 50 à 200 ng /ml a montré les effets les plus prononcés. Analyse de la PCR en temps réel pour les gènes codant pour ALP, OCN, COL-1 et Runx2 augmentation dose-dépendante en outre confirmé à 14 jours après l'ensemencement. En outre, la coloration rouge alizarine a démontré une augmentation dépendante de la concentration dans la coloration à 14 jours.
Conclusion
Les résultats de la présente étude montrent que cette chaîne polypeptidique plus courte de rhBMP2_108 est tout aussi bioactif que disponible dans le commerce rhBMP2 pour le recrutement des progéniteurs cellules en facilitant leur différenciation vers la lignée ostéoblastique. Future étude in vivo sont nécessaires pour enquêter sur sa bioactivité.
Mots-clés
BMP2 ostéoinductif ostéoinduction ostéoblastes différenciation régénération osseuse guidée Contexte
L'utilisation de facteurs de croissance et des biomatériaux ayant des propriétés induisant des os a joué un rôle central dans les options de traitement pour les patients souffrant d'une variété d'anomalies osseuses dues soit par la rupture ou de la maladie [1-3]. L'ostéoporose, une maladie caractérisée par une faible densité minérale et la fragilité ultérieure [4] a maintenant atteint environ 200 millions de personnes dans le monde avec 80% étant des femmes post-ménopausées [5-7]. L'augmentation significative des maladies métaboliques des os en combinaison avec des lésions traumatiques causées par des accidents de sport, les accidents de véhicules à moteur et d'autres fractures connexes nécessite des agents d'os induisant capables d'accélérer la régénération osseuse souvent dans des scénarios compromis tels que ostéoporotiques fractures liées à [8-11].
Un facteur de croissance qui a été largement utilisé avec l'approbation de la FDA est que des protéines morphogénétiques osseuses (PGB) [12-14]. PGB ont d'abord été extraite de la matrice osseuse déminéralisée et il a été révélé que ces protéines de faible poids moléculaire ont montré l'aptitude à former des os ectopique dans les sites extra-squelettique chez les animaux [15, 16]. Depuis lors, les PGB ont été capables de régénérer une multitude de défauts osseux et ont été montré pour améliorer le recrutement cellulaire, la prolifération et la différenciation des cellules mésenchymateuses, et en accélérant leur différenciation vers la formation osseuse ostéoblastes [17]. Malgré les avantages cliniques des protéines recombinantes, des préoccupations ont été soulevées concernant leur bioactivité transitoire, instabilité de la protéine, les taux de dissolution rapides et courtes demi-vies [18]. Pour ces raisons, l'utilisation de rhBMPs sont généralement administrés à des doses supra-physiologiques élevées qui portent le risque d'effets secondaires potentiels associés à leur utilisation [19]. En outre, d'autres facteurs qui pourraient conduire à une réduction de bioactivité vivo comprennent le rôle des antagonistes et leur spécificité pour différentes PGB (caboche, chordin, dan), le rôle de l'organisme hôte pour l'expression (E.coli vs CHO) et le différences associées à des motifs de glycosylation qui pourraient conduire à des différences de biodisponibilité et de la stabilité [20-22].
récemment le développement d'une protéine recombinante nouvelle fabriquée à partir d'une chaîne polypeptidique plus courte de BMP2 a été entrepris dans le but d'améliorer la stabilité des protéines dans vivo. Cette chaîne protéique plus courte est supposée faciliter le pliage des protéines, ce qui devrait permettre d'augmenter la bioactivité de rhBMP2 en augmentant la demi-vie de la protéine [23]. Cependant, avant l'expérimentation animale, une caractérisation complète de cette séquence d'acides aminés plus courte a été étudiée sur le comportement des cellules in vitro. MC3T3-E1 pré-ostéoblastes ont été étudiés pour leur réponse à cinq concentrations différentes de rhBMP2_108 y compris 10, 50, 100, 200 et 500 ng /ml et par rapport au témoin disponible dans le commerce rhBMP2 à une concentration de 100 ng /ml (R & amp; D Systems ). rhBMP2_108 a été testé pour sa capacité à induire le recrutement de cellules, la prolifération cellulaire, l'activité de la phosphatase alcaline, l'alizarine coloration au rouge ainsi que les taux d'ARNm pour les gènes codant pour la phosphatase alcaline, l'ostéocalcine, le collagène une et Runx2 évaluée par PCR en temps réel.
Méthodes séquence d'acides aminés
rhBMP2_108
rhBMP2_108 a été aimablement fourni par Jiuyuan société de biotechnologie (Hangzhou, Chine). La séquence d'acides aminés raccourcie a été fabriquée comme suit: MKKLKSSCKRHPLYVDFSDVGWNDWIVAPPGYHAFYCHGECPFPLADHLNSTNHAIVQTLVNSVNSKIPKACCVPTELSAISMLYLDENEKVVLKNYQDMVVEGCGCR pour une chaîne de protéine de 108 acides aminés. BMP2 disponible dans le commerce a été acquis auprès de R & amp;. D Systems (Minneapolis, USA): Préparation de la BMP2
Selon la séquence d'acides aminés, l'expression intracellulaire de rhBMP2_108 dans E. coli a été construit pour la production de masse comme précédemment rhBMP2_108 décrit [24]. En bref, la séquence de BMP2 a été conçu en fonction de sa séquence d'acides aminés, puis a été une transcription inverse avec la transcriptase inverse (Gibco BRL, NY, USA) comme décrit précédemment [24]. la réaction en chaîne par polymérase (PCR) a été utilisée pour amplifier l'ADNc codant pour la séquence d'acides aminés de la protéine raccourcie rhBMP2_108. Cette rhBMP2_108 ADNc a été ensuite sous-cloné en utilisant un vecteur pRSET (A) (Invitrogen, R.-U.) pour donner le pRSET (A) /vecteur d'expression rhBMP2_108. Ensuite, pRSET (A) /rhBMP2_108 a également été utilisé pour transformer la souche de E. coli BL21 (DE3). Un bioréacteur a été ensuite utilisé pour produire la culture à haute densité cellulaire de E. coli. En bref, E. coli transformé a été cultivé dans un 5 fermenteur, avec 3 litres de milieu défini (culture en discontinu; extrait de levure 1 g /l, peptone 2 g /l) inoculé avec la pré-culture (10% du lot volume de culture). La culture a été réalisée sous agitation à 250 tours par minute pendant 48 heures à 30 ° C, y compris l'addition d'un milieu nutritif (Glucose 33,3 g /l, peptone 10 g /L, extrait de levure 5 g /L, MgSO
41 g /L, FeSO 48,0 g /L, CaCl 20,048 g /L, ZnSO 40,0176 g /L, CuSO 40,008 g /L).
La biomasse cultivée a ensuite été récolté par écraser deux fois les cellules dans une presse française et ensuite centrifugé. Le culot a été remis en suspension à 25 mg en poids humide /ml dans un tampon de suspension (20 mMTris-HCl [pH 8,5], 0,5 mMEDTA, 2% [v /v] Triton X-100). Les corps d'inclusion (granules) ont été remises en suspension dans un tampon de solubilisation (6Mguanidine-HCl, 0,1 M de Tris-HCl [pH 8,5], 0,1 M de DTT, 1 mM EDTA) et ensuite mis en incubation avec agitation constante à température ambiante pendant une nuit. Les particules insolubles sont ensuite éliminés de la suspension par centrifugation.
Une colonne 6 Fast Flow Heparin Sepharose a ensuite été utilisée pour purifier le rhBMP2_108 actif (en dimère). Un gradient de NaCl en continu (0,1 à 1,5 M) a été utilisé pour éluer la protéine liée. Par la suite, un gradient de NaCl étagé (0,15 M, 0,3 M et 0,5 M) a été utilisé pour éluer et séparer la protéine rhBMP2_108 actif. Par la suite, la poudre rhBMP2_108 a été gelé 20 au-° C. Lorsqu'il est utilisé, l'acide acétique à 0,1% a été utilisé pour dissoudre la poudre BMP2. Contrôle rhBMP2 a été acheté auprès de R & amp; systèmes D (Minneapolis, USA) dérivés de cellules CHO.
essai de migration en deux dimensions
MC3T3-E1 lignée cellulaire pré-ostéoblastes a été utilisé pour cette étude. Aucun des échantillons humains ou animaux ont été utilisés, et donc pas de consentement éthique était nécessaire. Le dosage de la migration des cellules a été effectuée avec une chambre Transwell en utilisant une plaque à 24 puits et polycarbonate Transwell filtres (Costar, Corning, Acton, MA) avec une taille de pores de 8 pm comme décrit précédemment [25]. 10 4 cellules MC3T3-E1 dans 50 ul de DMEM ont été ensemencés dans le compartiment supérieur. rhBMP2_108 à des concentrations de 0, 10, 50, 100, 200 et 500 ml rhBMP2 et de contrôle /ng à 100 ng /ml ont été ensemencés dans le compartiment inférieur. Les cellules ont été laissées migrer pendant 24 heures à 37 ° C dans un humidifiée à 5% de CO 2 atmosphère. Le filtre a ensuite été enlevé, les cellules ont été fixées dans 4% de formaldehyde pendant 20 minutes et lavées dans du PBS, après plusieurs lavages, les filtres sont mis en incubation pendant 15 min à température ambiante avec Methylrosanilnium solution de chlorure de (Wuhan Google Biotechnology Limited société G1014), puis les filtres ont été lavées avec du PBS pendant 10 min. Les échantillons ont été examinés par microscopie. Les cellules non migrées sur la face supérieure ont été éliminées par rinçage du filtre avec du PBS froid et le grattage avec une raclette en caoutchouc. Les cellules restantes ont migré sur le côté inférieur du filtre ont été comptées dans neuf champs aléatoires par filtre (100 × grossissement). Tous les échantillons ont été réalisées en triple avec 3 expériences indépendantes réalisées. Dosage
de prolifération
Pour étudier l'effet de rhBMP2_108 sur la prolifération des MC3T3-E1, CCK-8 essai pour chaque groupe a été réalisée comme décrit précédemment [26]. En bref, les cellules ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits à une densité de 5 x 10 3 cellules /puits. Aux points de temps 1, 3 et 5 jours, le dosage CCK-8 a été réalisée par addition de 10 ul de la solution de CCK-8 (Dojindo Technologies moléculaires, Inc. Japon) à chaque puits et l'incubation pendant 1,5 h selon le protocole du fabricant. L'absorbance a été mesurée à λ = 450 nm sur un lecteur de plaque. Les résultats ont été démontré que l'absorbance de chaque puits expérimental, moins la valeur de la densité optique des puits blancs. Tous les échantillons ont été répétées en triple avec trois expériences indépendantes.
L'activité phosphatase alcaline
L'activité phosphatase alcaline a été analysé en utilisant la trousse colorimétrique de dosage de la phosphatase alcaline (Nanjing Jiancheng Bioengineering Insitute) en utilisant une densité d'ensemencement de départ de 50'000 cellules par 24 puits plat comme précédemment décrit [27, 28]. Au point de sept et 14 jours de temps, les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS et solubilisées dans 0,1% de Triton X-100 (tampon dans 0,1 mol /L de PBS, pH 7,3) à 4 ° C pendant 1 h. Après sonication et centrifugation, l'activité de l'ALP dans le surnageant a été déterminée par colorimétrie en utilisant les lectures OD405 /OD562. La protéine totale a été quantifiée par Protein Assay Kit BCA (Thermo Fisher Scientific Inc.). L'activité de l'ALP a été étalonnée par rapport à la protéine totale. En temps réel des échantillons ont été analysés en triple avec trois expériences indépendantes réalisées. PCR
cellules MC3T3-E1 ont été ensemencées à une densité de 2 x 10 5 et cultivées pendant 14 jours comme décrit précédemment [26, 28 29]. Les effets de la rhBMP2_108 à diverses concentrations ont été étudiées sur quatre expression du gène lié à ostéogénique, y compris la phosphatase alcaline (ALP), le collagène I (COL I), par rapport runt-facteur de transcription de deux (2 Runx) et l'ostéocalcine (OCN). L'ARN total a été extrait à partir de cellules MC3T3-E1 par réactif Trizol (TriPure Isolation réactif, Roche Applied Science, Allemagne) selon les instructions du fabricant. La concentration et la qualité des échantillons d'ARN totaux ont été analysés par Nanodrop (Thermo Fisher Scientific Inc.). L'ADN complémentaire a été synthétisé à partir de 2 pg d'ARN total en utilisant le kit RevertAidTm First Strand cDNA Synthesis (Fermentas) selon le protocole du fabricant. RT-PCR quantitative a été effectuée dans 20 des réactions pi contenant 10 pi de SYBR Green Master Mix (Roche Applied Science, Allemagne), 0,6 ul (10 uM) de chaque marche avant et arrière d'amorce pour chaque gène d'intérêt, 2 ul de matrice d'ADNc et 6,8 ul eau. Les séquences d'amorces (indiquées dans le tableau 1) ont conçu spécifiquement en fonction de la référence. Glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH), d'un gène de référence, a été utilisé comme témoin. La réaction a été analysée à l'aide d'un système ABI Prism 7000 Sequence Detection (Applied Biosystems), et l'amplification PCR terme pour 40 cycles. Pour valider l'amplification spécifique d'amplicon, sans contamination de l'ADN génomique, l'analyse de la courbe de fusion a été réalisée et le sommet unique est apparu autour de la température de recuit. les niveaux d'expression relatifs de chaque gène désiré ont été normalisés par rapport à la valeur Ct de GAPDH et déterminé en utilisant le delta méthode Ct. Tous les échantillons ont été déterminées en triple pour trois indépendants studies.Table 1 séquences d'amorces pour les marqueurs de différenciation des ostéoblastes
GAPDH F
GTGAAGGTCGGTGTGAACGG
GAPDH R
TCCTGGAAGATGGTGATGGG
OPN F
GAGGAAACCAGCCAAGGTAAG
OPN R
AAAGCAAATCACTGCCAATCTC
OCN F
GAGGACCATCTTTCTGCTCACT
OCN R
CGGAGTCTGTTCACTACCTTATTG
ALP F
TGTGGAATACGAACTGGATGAG
ALP R
ATAGTGGGAATGCTTGTGTCTG
RUNX2 F
GTGTTCCCTACTCAGCCGTC
RUNX2 R
GAGGCCTCGGTCCACATTAG
Alizarine quantification rouge alizarine rouge coloration a été réalisée pour déterminer la présence d'une minéralisation de la matrice extracellulaire après 14 jours. les cellules MC3T3-E1 ont été ensemencées à une densité de 50.000 cellules par boîte de culture de 24 puits contenant les différentes concentrations de rhBMP2_108. Au bout de 14 jours, les cellules ont été fixées dans 96% d'éthanol pendant 15 minutes et colorées avec une solution à 2% de rouge d'alizarine dans de l'eau (pH 4,2) à température ambiante pendant 1 h et visualisés sous microscopie optique. Par la suite, la quantification alizarine rouge a été dissous en utilisant 200 ul de 1% de chlorure de cétylpyridinium (dissous avec de l'eau bidistillée) à la température ambiante pendant 4 h. Ensuite, 100 solution pi a été transférée à la plaque de 96 puits au texte OD 560.
Analyse statistique
Toute analyse des données a été réalisée en utilisant le logiciel GraphPad Prism6.0. La distribution normale des données de l'échantillon a été retenu pour l'étude en cours et donc le test paramétrique a été analysé à l'aide ANOVA à sens unique et statistiquement des valeurs significatives ont été adoptées comme p
& lt; 0,05. Moyenne et erreur standard (SE) ont été analysées à l'aide d'une analyse de variance avec un test post hoc avec l'analyse de Tukey.
Résultats de Effet de rhBMP2_108 sur le recrutement de cellules
Afin d'étudier les effets de rhBMP2_108 sur le recrutement de cellules une chambre transwell a été utilisé à cinq concentrations différentes de rhBMP2_108 (fig. 1). Il a été constaté que, après une période de 24 heures, toutes les concentrations de rhBMP2 rhBMP2_108 et de contrôle ont été en mesure d'augmenter de manière significative le recrutement cellulaire des cellules MC3T3-E1 par rapport aux échantillons témoins. Petite variabilité entre les échantillons a été observée démontrant un fort potentiel pour toutes les concentrations de rhBMP2_108 pour induire le recrutement de cellules (Fig. 1). Figue. 1 essai de recrutement cellulaire a démontré que toutes les concentrations de rhBMP2_108 étaient significativement plus en mesure d'améliorer le recrutement des cellules MC3T3-E1 par rapport à des échantillons témoins sans rhBMP2 (barre d'échelle = 100 um). Toutes les expériences ont été réalisées en triple avec trois expériences indépendantes (n = 9
). Les données représentent des moyens +/- SEM. ** Désigne tous les échantillons significativement plus élevés que les échantillons de contrôle, p
& lt; 0,01)
Effet de rhBMP2 sur la prolifération cellulaire L'effet de
rhBMP2_108 a été étudiée à cinq concentrations et de contrôler rhBMP2 pour leur capacité à stimuler la prolifération cellulaire in vitro (Fig. 2). Il a été constaté que les cellules MC3T3-E1 montré très similaire numéro de cellule 1 jour post-semis, indépendamment de la culture cellulaire concentration des médias de rhBMP2_108 (Fig. 2). Une légère augmentation du nombre de cellules a été observée à 3 jours, cependant, aucune différence significative n'a pu être observée entre les différentes modalités (fig. 2) de traitement. De 5 jours après le semis, une augmentation significative du nombre de cellules a été observé pour les cellules MC3T3-E1 avec toutes les concentrations de rhBMP2_108 utilisées dans cette étude (fig. 2). Chose intéressante, aucun avantage ne correspond à des concentrations plus élevées de rhBMP2_108 par rapport à leurs homologues inférieurs (fig. 2). Figue. 2 Le nombre de cellules tel que calculé par un dosage CCK-8 pour les cellules MC3T3-E1 ensemencées à diverses concentrations de rhBMP2_108 par rapport à contrôler plastique de culture tissulaire (Toutes les expériences ont été réalisées en triple avec trois expériences indépendantes (n
= 9). Données représente un moyen +/- SEM # désigne des échantillons de contrôle significativement plus bas que toutes les autres modalités de traitement, p
& lt;. 0,05)
effet de rhBMP2 sur la différenciation cellulaire
RhBMP2_108 a ensuite été évalué pour sa capacité à accélérer ostéoblastes différenciation à des concentrations variées (Fig. 3, Fig. 4, Fig. 5, fig. 6). il a été d'abord constaté que rhBMP2_108 a réussi à augmenter de manière significative l'activité ALP à sept et 14 jours après l'ensemencement pour toutes les concentrations de rhBMP2_108 (Fig. 3). Chose intéressante, on a observé au jour 7 que l'activité de l'ALP était significativement plus élevée à des concentrations rhBMP2_108 de 50, 100 et 200 ng /ml par rapport aux échantillons témoins (Fig. 3). A 14 jours, toutes les modalités de traitement recevant rhBMP2_108 à diverses concentrations ont montré une augmentation de 16 fois marqué de l'activité ALP par rapport aux échantillons de contrôle vide de rhBMP2_108 (Fig. 3). Figue. activité 3 ALP a été augmenté de façon significative à sept et 14 jours après l'ensemencement pour les échantillons ensemencés avec rhBMP2_108 par rapport à contrôler la culture de tissus en plastique seul (Toutes les expériences ont été réalisées en triple avec trois expériences indépendantes (n
= 9). Les données représentent des moyens + . /- SEM * indique différence significative entre 500 ng /ml et 10 ng /ml rhBMP2, p
& lt; 0,05; ** désigne significativement plus élevé que toutes les autres modalités, p
& lt; 0,05, # désigne des échantillons de contrôle significativement plus faible que tous les autres modalités de traitement, p
& lt; 0,05)
Fig. 4 niveaux d'ARNm de (a) l'ALP, (b), OCN, (c) COL-1 et (d) Runx2 pour les cellules MC3T3-E1 ensemencées à diverses concentrations de rhBMP2_108 (toutes les expériences ont été réalisées en triple avec trois expériences indépendantes (n < . br> = 9) les données représentent des moyens +/- SEM * désigne p
. & lt; 0,05; ** désigne significativement plus élevé que toutes les autres modalités, p
& lt; 0,05, # désigne des échantillons de contrôle significativement plus bas que tous les d'autres modalités de traitement, p
& lt; 0,05)
Fig. 5 L'analyse qualitative de la coloration rouge alizarine a démontré une minéralisation pour les cellules MC3T3-E1 a augmenté à des concentrations croissantes de rhBMP2_108 à 14 jours après l'ensemencement
Fig. 6 L'analyse quantitative de la coloration rouge alizarine. rhBMP2_108 démontrent une augmentation dépendante de la concentration dans la coloration au rouge d'alizarine (Toutes les expériences ont été réalisées en triple avec trois expériences indépendantes (n = 9
). Les données représentent les moyennes +/- SEM. * désigne différence significative entre les deux groupes, p
& lt; 0,05; ** désigne significativement plus élevé que toutes les autres modalités, p
& lt; 0,05, # désigne des échantillons de contrôle significativement plus faible que tous les autres modalités de traitement, p
& lt; 0,05)
Puis les cellules MC3T3-E1 ont été évalués pour les taux d'ARNm par PCR en temps réel pour les gènes codant pour l'ALP, OCN, COL-1 et Runx2 à diverses concentrations de rhBMP2_108 (Fig. 4). Pour le gène codant pour Runx2, jusqu'à cinq fois plus élevée a été observée à une concentration de 500 ng /ml par rapport à des échantillons témoins avec une augmentation significative de 100 et 200 ng /ml par rapport à des concentrations plus faibles (Fig. 4a). De même, a également démontré COL-1 augmentation dépendant de la concentration de l'expression génique (fig. 4b). Ici, toutefois, seulement à une augmentation de deux fois a été observée par rapport aux échantillons témoins (Fig. 4b). On a observé que les taux d'ARNm de l'ALP était plus de cinq fois supérieure à 14 jours à des concentrations de dix et 50 ng /ml rhBMP2_108 alors qu'à une concentration de 100 et 200 ng /ml de 20 facteur d'augmentation de l'activité de l'ALP (fig. 4c). La plus forte concentration de 500 ng /ml a montré une augmentation de 40 fois de l'activité de l'ALP, par rapport aux milieux de culture sans rhBMP2 (fig. 4c). Le plus grand facteur de variation a été observée dans les niveaux OCN où jusqu'à une multiplication par 300 a été observée par rapport à leur contrôle respectif sans rhBMP2 (Fig. 4d).
Enfin, la coloration rouge alizarine a été utilisé pour visualiser la minéralisation in vitro (Fig. 5). On a observé que, sans rhBMP2, MC3T3-E1 pré-ostéoblastes ont été incapables de produire de minéralisation visuelle observée par coloration au rouge alizarine (fig. 5). Les effets de rhBMP2_108 ont démontré une augmentation significative dépendante de la concentration dans la coloration rouge alizarine à 14 jours après l'ensemencement Rapport de (Fig. 6).
Le but de la présente étude était d'étudier la bioactivité d'un BMP2 recombinant plus court (rhBMP2_108 ) séquence sur le comportement des ostéoblastes. L'utilisation de rhBMP2 pour les traitements orthopédiques et dentaires a été utilisé pour un certain nombre de procédures, y compris des fractures ouvertes, les chirurgies de la hanche reconstructive ainsi que guidées procédures de régénération osseuse en dentisterie [30-33]. Malgré la démonstration prometteuse résultats in vivo, l'utilisation du facteur de croissance a eu un mélange de succès lorsqu'il est utilisé pour une utilisation clinique. Certaines des principales préoccupations soulevées au sujet de l'utilisation du facteur de croissance est leur bioactivité transitoire qui a été suggérée pourrait être de l'ordre de minutes à quelques heures [18].
Il existe trois principaux domaines de la recherche visant à améliorer la bioactivité facteurs de croissance; 1) l'utilisation de la thérapie génique, 2) l'amélioration de la stabilité de la protéine ou 3) l'amélioration du système d'administration de facteur de croissance. Une méthode qui a révélé prometteur pour la délivrance du facteur de croissance est celui de la thérapie génique où l'utilisation de vecteurs viraux tels que les adenovirus peuvent contourner la plupart des limitations de la délivrance de protéines en présentant un niveau élevé d'efficacité de la transduction in vivo avec une période d'expression relativement courte [34 -38]. Leur principal avantage est la protéine surexprimée est construit au sein de la cellule principale des organismes et a donc accès à une multitude de pliage des protéines capables de conditionnement et de distribution des facteurs de croissance à leurs tissus environnants [25, 39, 40] avec précision. Malgré les progrès réalisés dans ce domaine de recherche, l'utilisation de la thérapie génique est encore interdit par la FDA qui rend son utilisation clinique future au moment d'une approche optimiste avenir avec aucun calendrier connu pour son utilisation éventuelle. En outre, on a montré les récentes stratégies en utilisant de courtes peptides BMP2 imitant synthétiques pour faciliter la régénération osseuse [41-44], mais un manque de rapports cliniques utilisant de telles stratégies est toujours manquant.
Ainsi, il devient essentiel de trouver des méthodes alternatives qui peuvent être considéré comme approprié pour l'amélioration de facteur de croissance bioactivité. Dans la présente étude, une version recombinante roman de BMP2 (rhBMP2_108) avec une séquence d'acides aminés plus courte. Avant l'expérimentation animale cependant, les tests in vitro a été réalisée sur l'activité des cellules. Il a été constaté dans la présente étude que r rhBMP2_108 était tout d'abord en mesure de cibler le recrutement de cellules progénitrices en favorisant le recrutement précoce et rapide des cellules dans les 24 h (Fig. 1). Le homing des cellules progénitrices et des cellules souches est l'une des principales étapes initiales dans l'apparition précoce de la réparation des fractures et est une composante nécessaire de la cicatrisation des osseuses-défauts. En tant que tel, la capacité de rhBMP2_108 à accélérer le rythme et le nombre de cellules progénitrices à défauts des sites est crucial pour la réparation osseuse.
Bien que les effets comme on le voit dans la présente étude ont démontré que rhBMP2_108 était significativement capable d'induire la prolifération des cellules, il on n'a pas observé d'une manière dépendante de la concentration. Cela peut être dû au fait que les cellules subissant une différenciation cellulaire ne sont pas sujettes à proliférer en même temps. Bien que les observations dépendantes pas beaucoup de concentration ont été trouvées pour le recrutement ou la prolifération cellulaire, des différences significatives ont été trouvées pour la différenciation des ostéoblastes en réponse à rhBMP2_108. Il a été observé que, sur une augmentation de quatre fois de l'activité de l'ALP ont été détectés avec rhBMP2_108 et augmente encore dépendantes de la concentration de la coloration rouge alizarine encore validé notre hypothèse selon laquelle rhBMP2_108 agit principalement en stimulant la différenciation des ostéoblastes. On a également observé qu'une augmentation significative des taux d'ARNm de PAL a été observé d'une manière dépendante de la concentration. Il est intéressant OCN, un marqueur de différenciation tardive pour ostéoblastes a été régulée à la hausse d'environ 300 fois par rapport aux échantillons témoins (Fig. 4b). Cette constatation signifie probablement que les pré-ostéoblastes MC3T3-E1 ensemencés dans les puits témoins sans rhBMP2 probable est resté cellules progénitrices et n'a pas de différence vers la lignée ostéoblastique tout au long de ces expériences. Cette situation est encore évident par le fait que les échantillons sans rhBMP2 ne présentaient aucun potentiel de minéralisation dans les expériences rouge alizarine (fig. 5).
Bien que les résultats de la présente étude confirment les effets de cette séquence de rhBMP2_108 d'acides aminés plus courte sur la cellule activité, beaucoup de recherche reste nécessaire afin de valider ces résultats dans un modèle animal avant l'essai clinique. Il reste pratiquement inconnu si l'activité de la protéine sera affectée in vivo par la séquence d'acides aminés raccourcie et beaucoup de recherche future enquête cette relation à la fois par rapport à la protéine la durée de demi-vie, ainsi que ses effets subséquents sur la formation osseuse doivent être soigneusement évalués. En outre, sa comparaison aux principaux rhBMP2 actuellement disponibles sur le marché avec l'approbation de la FDA est également nécessaire de fournir une meilleure compréhension sur les effets de la longueur de l'acide aminé de protéine de bioactivité sur des protéines recombinantes.
Conclusion
Les résultats de la présente étude démontrer qu'une séquence d'acides aminés plus courte BMP2 recombinante (rhBMP2_108) conserve ses propriétés bioactives BMP2 par rapport à rhBMP2 disponible dans le commerce in vitro. Il a été montré que rhBMP2_108 était capable de stimuler le recrutement rapide des cellules MC3T3-E1 de pré-ostéoblastes et favoriser leur différenciation vers la lignée ostéoblastique d'une manière dépendante de la concentration. Avenir dans la recherche in vivo analysant l'utilisation de cette séquence d'acides aminés de rhBMP2_108 est maintenant nécessaire dans les défauts osseux critique taille. En outre, l'enquête sur le système de livraison optimal ce facteur de croissance sont nécessaires pour potentiellement améliorer encore sa bioactivité pour une utilisation clinique
abréviations
rhBMP2:. Os recombinant
protéine morphogénétique 2
rhBMP2_108:
courte chaîne polypetitde de 108 acides aminés pour les protéines morphogénétiques osseuses recombinant deux
ALP:
phosphatase alcaline
OCN:
ostéocalcine
COL-1:
collagène 1
Runx2:
runt- liés à facteur de transcription de deux
GAPDH:
glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase
FDA:
nourriture et l'administration du médicament
CHO:
ovaire de hamster chinois
PCR:
réaction en chaîne par polymérase
PBS :
solution tamponnée de phosphate
HCl: l'acide chlorhydrique
EDTA: acide éthylènediaminetétraacétique
NaCl: chlorure de sodium
DMEM:
milieu d'eagle modifié par Dulbecco
BCA:
acide bicinchoninique
OD:
pptical densité
SE:
erreur standard
Déclarations
Remerciements
Ce projet a été soutenu par le Programme pour New Century excellents talents à l'Université (NCET-11-0414), Excellente Fondation jeunesse du Hubei et les fonds de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (81271108). article
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concurrence.
