Résumé
Contexte
régénération des tissus parodontaux est un objectif majeur de la thérapie parodontale. Les cellules souches de la pulpe dentaire (DPSC) présentent des propriétés de cellules mésenchymateuses avec le potentiel pour l'ingénierie des tissus dentaires. Dérivé matrice d'émail (EMD) et du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF) sont des exemples de matériaux qui agissent comme des molécules de signalisation pour favoriser la régénération du parodonte. trioxyde minérale globale (MTA) a été prouvée pour être biocompatible et semble avoir des propriétés ostéoconducteur. L'objectif de cette étude était d'évaluer les effets de l'EMD, MTA et PDGF sur DPSC différenciation ostéogénique
. DPSC humaines méthodes ont été cultivées dans un milieu contenant EMD, MTA, ou PDGF. Les groupes témoins ont également été établis. Résultats de l'évaluation de l'ostéogenèse obtenu a été réalisée par analyse informatique de la phosphatase alcaline (ALP) -stained chambres, et l'analyse spectrophotométrique de rouge nodules minéralisés alizarine S-tachés.
EMD ont augmenté de façon significative les quantités d'expression de l'ALP et de la minéralisation par rapport à tous les autres groupes (P
& lt; 0,05). Pendant ce temps, MTA a donné des résultats variables avec une légère augmentation de certains paramètres de différenciation, et PDGF n'a montré aucune augmentation significative de la différenciation atteint.
Conclusions
EMD a montré une très forte capacité ostéogénique par rapport à PDGF et MTA, et les résultats actuels fournissent support pour son utilisation dans la régénération parodontale.
Mots-clés
cellules souches de la pulpe dentaire ostéogenèse MTA EMD GDP Contexte
Le principal objectif de la thérapie parodontale est de régénérer des structures de soutien de la dent détruites par la maladie parodontale [1]. l'ingénierie tissulaire parodontale implique des interactions complexes entre les différentes cellules et des molécules de signalisation, ainsi que des échafaudages biologiques [2].
Dans une tentative pour imiter les événements de développement d'origine, l'utilisation intégrée des populations de cellules précurseur avec des stimulants biologiques spécifiques est sous enquête [ ,,,0],3, 4]. Les cellules souches représentent des cellules non spécialisées primitives présentant de grandes capacités de différenciation et de la régénération tissulaire. À ce jour, les cellules souches mésenchymateuses ont été isolés avec succès à partir de plusieurs organes du corps [5], y compris de multiples tissus d'origines dentaires [6-9]. De telles cellules souches dérivées du tissu dentaire ont été trouvés pour conserver une capacité efficace pour la différenciation spécifique dans des cellules de tissus dentaires formant [6, 10, 11]. Gronthos et ses collègues réussi à isoler des cellules souches de la pulpe dentaire humaines (DPSC), et ont prouvé à la fois leur multipotence et auto-renouvellement capacité [11, 12]. D'autres études ont confirmé leurs résultats [13, 14]. Ce multipotence, en plus de leur accessibilité relative, a fait DPSC une source intéressante de cellules pour une application dans la médecine régénératrice [15-18]. En fait, plusieurs études ont prouvé leur supériorité dans divers aspects, y compris la différenciation ostéogénique [19, 20], qui a soutenu leur utilisation pour la régénération des défauts craniofaciaux [21, 22], ainsi que des défauts d'os alvéolaire [23, 24]. En outre, les origines embryonnaires similaires de cellules de la pulpe dentaire et des cellules parodontales [25] et leur présence dans les couches de protection de la structure de la dent ont favorisé leur utilisation pour la régénération du parodonte [26, 27] de. Des études sur l'ingénierie tissulaire ont utilisé des médiateurs biologiques pour améliorer sélectivement le recrutement des populations cellulaires dans les plaies parodontales [28]. Émail matrice dérivée (EMD) est une protéine récolté dans le développement des dents de porc qui a été rapporté pour induire la formation de cément et la régénération parodontale [29]. Au niveau cellulaire, EMD a été prouvé qu'ils ont des effets régulateurs sur de multiples types cellulaires parodontales [28, 30]. Le plus du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF) est un facteur de régulation très puissant qui déclenche des événements de guérison presque totalité de la plaie. La fonction principale du PDGF est de stimuler la replication de la cellule (mitogénèse) des cellules souches thérapeutiques aptes et les cellules ostéoprogénitrices partiellement différenciées, qui font partie du tissu conjonctif os guérison cellulaire maquillage [31]. Des augmentations significatives dans la formation des os et du cément ont été rapportés histologiquement [32]. Au niveau cellulaire, le PDGF a augmenté le nombre de cellules de collagène synthétisant [33] et la sialoprotéine osseuse stimulée transcription [34].
Autre matériau ayant la capacité d'induire la régénération est agrégat de trioxyde minéral (MTA). MTA est un mélange de silicate dicalcique, du silicate tricalcique, d'aluminate tricalcique, le gypse et aluminoferrite tétracalcique [35]. Torabinejad et al. [36] ont rapporté une performance biologique favorable du MTA lorsqu'il est en contact direct avec l'os, par le dépôt et la formation d'hydroxyapatite sur sa surface. Le matériau a également été trouvé pour augmenter la production cellulaire de collagène de type I, l'ostéocalcine, la phosphatase alcaline (ALP), la sialoprotéine osseuse et l'ostéopontine [37]. Une revue systématique sur les réponses histologiques du parodonte à la matière a conclu que MTA promu la guérison vers la régénération [38].
Les résultats ci-dessus suggèrent des performances cliniques similaires pour les trois matériaux sans tentatives précédentes pour des comparaisons directes. Résultats de conséquence, le but de la présente étude était d'examiner et de comparer les effets de EMD, PDGF et MTA sur la différenciation ostéogénique des DPSC.
isolement cellulaire et la caractérisation
cellules souches de la pulpe dentaire dans le primaire les cultures ont commencé à apparaître dans les 5-14 jours et est devenu attaché aux surfaces de la plaque (fig. 1a). Les cellules du second passage formé avec succès plusieurs colonies, avec environ 50 cellules par colonie (Fig. 1b). Débit des expressions positives analyses cytométrie confirmés de marqueurs associés aux cellules-stromales, avec des expressions négatives de hématopoïétiques et endothéliales marqueurs (Fig. 1g). Les cellules qui ont subi l'induction ostéogénique ont montré une augmentation ALP coloration par rapport aux cellules témoins négatives (Fig. 1c, d), tandis que les cellules cultivées dans le milieu adipogénique présentent plusieurs huile rouge granules lipidiques O-positif (Fig. 1E, F). Figue. 1 Inverted images au microscope optique montrant un dentaires cellules souches mésenchymateuses à la pâte de culture primaire, Grossissement 5 ×. b unité formant colonie de fibroblaste (CFU-F) grossissement 5 x, c, d coloration de la phosphatase alcaline pour DPSC 14 jours après ostéoinduction (c) par rapport au contrôle négatif (d), un grossissement de 10 ×, et l'huile rouge coloration O pour DPSC 14 jours après induction adipocytaire (e) par rapport au contrôle négatif (f), un grossissement de 40 ×. g FACS résultats de l'analyse d'une lignée de cellules de la pulpe dentaire représentant
demande Matériau
ALP coloration
Les échantillons ont montré des degrés différents de ALP coloration (Fig. 2). One-way ANOVA ont révélé des différences significatives entre les groupes comparés (P & lt; 0,0001) (tableau 1). Figue. 2 images Scanoscope pour ALP colorées différents groupes expérimentaux de DPSC. L'image interne représente le champ évalué, ce qui rend l'ordre de 1/4 de l'image. grossissement d'origine 1.4 ×. Barre d'échelle 1 mm. un contrôle négatif, le contrôle b de référence (OT), c EMD, d MTA, e PDGF
Tableau 1 Représente les résultats d'analyse de la phosphatase alcaline pour tous les groupes
Matériel /Groupe
Moyenne
Déviation standard (SD)
post hoc test de Tukey pour la signification des groupes
Pourcentage positif
contrôle négatif total
16,29
4,95
OT *
EMD *
MTA *
PDGF *
OT
72,92
9.24
Negative control*
EMD*
MTA*
PDGF*
EMD
95.59
4.69
Negative control*
OT*
MTA*
PDGF*
MTA
64.19
9.95
-ve control*
OT*
EMD*
PDGF*
PDGF
48.80
12.62
Negative contrôle *
OT *
EMD *
MTA *
moyenne densité optique
négatif control
0.18
0.01
OT*
EMD*
MTA*
PDGF*
OT
0.26
0.02
Negative control*
EMD*
MTA
PDGF*
EMD
0.35
0.03
Negative control*
OT*
MTA*
PDGF*
MTA
0.26
0.02
Negative control*
OT
EMD*
PDGF
PDGF
0.24
0.03
Negative contrôle *
OT *
EMD *
MTA
Score histologiques
Negative control
20.633
7.034
OT*
EMD*
MTA*
PDGF*
OT
132.974
22.944
Negative control*
EMD*
MTA
PDGF*
EMD
221.992
23.818
Negative control*
OT*
MTA*
PDGF*
MTA
114.340
20.914
Negative control*
OT
EMD*
PDGF*
PDGF
82.330
28.254
Negative contrôle *
OT *
EMD *
MTA *
comparaison NBIntergroup était statistiquement significative en utilisant le test ANOVA, P
& lt; 0,0001
* Indique la signification statistique avec P
& lt; 0,05
Pour tous les paramètres examinés, EMD était significativement plus élevé que tous les autres groupes (p & lt; 0,05). EMD a révélé pour cent significativement plus élevée surface totale de coloration positive, la densité optique moyenne, et les scores histologiques (95,6 ± 4,7%, 0,35 ± 0,03, 221,99 ± 23,8) que MTA (64,19%, 0,26 ± 0,02, 114,34 ± 20,90; P & lt; 0,05) PDGF (48,8% ± 12,62, 0,24 ± 0,02, 82,33 ± 28,3; P & lt; 0,05). et le contrôle de référence
en revanche, MTA ont donné des résultats contradictoires, même si elle a augmenté l'activité de l'ALP de manière similaire à la commande de référence lors de évaluée par la densité optique moyenne du matériau entraîné des réductions des autres paramètres par rapport à la commande de référence, bien que ces réductions ne sont pas toujours significative (P
& gt; 0,05)
en ce qui concerne le PDGF, l'expression de l'ALP en général. révélé des résultats inférieurs par rapport à la commande de référence pour les trois paramètres respectivement, et ces réductions étaient toujours significative (P & lt; 0,05; tableau 1)
Alizarine rouge S coloration
Il y avait des différences évidentes dans les quantités de minéralisation entre. les groupes (Fig. 3). One-way ANOVA révèle que ces différences sont significatives (P
& lt; 0,0001) (tableau 2). Figue. 3 Inverted image microscopique lumière présentant Alizarine rouge S coloration pour différents DPSC groupes expérimentaux. grossissement 10 ×. Barre d'échelle de 200 um. un contrôle négatif, le contrôle b de référence (OT), c EMD, d MTA, e PDGF
Tableau 2 Représente le taux d'absorbance moyenne pour Alizarine rouge S chambres colorées de tous les groupes
Matériel /Groupe
moyen de déviation standard (SD) de test
post hoc Tukey pour la signification des groupes
négatifs control
0.079
0.007
OT
EMD*
MTA*
PDGF
OT
0.107
0.016
Negative control
EMD*
MTA
PDGF
EMD
1.197
0.132
Negative control*
OT*
MTA*
PDGF*
MTA
0.163
0.117
Negative control*
OT
EMD*
PDGF*
PDGF
0.097
0.010
Negative contrôle
OT
EMD *
MTA *
OT
contrôle de référence pour ostéoinduction , EMD de Emdogain, trioxyde minéral le total de MTA, PDGF
comparaison NBIntergroup de croissance dérivé des plaquettes facteur BB était statistiquement significative en utilisant le test ANOVA, P
& lt; 0,0001
* Indique la signification statistique avec P
& lt; 0,05
Le groupe EMD avait une quantité significativement accru de formation de nodules minéralisés par rapport à tous les autres groupes, donnant une absorbance moyenne de 1,2 ± 0,13 (P
& lt; 0,05).
Le groupe MTA a augmenté de manière significative quantité de minéralisation (absorbance: 0,16 ± 0,12)., par rapport au groupe témoin négatif (0,08 ± 0,01), et le groupe de PDGF (0,09 ± 0,01)
Bien que l'absorbance du groupe PDGF signifie (0,09 ± 0,01) semble être légèrement différente de celle des autres groupes, ces différences étaient statistiquement non significative (P
& gt; 0,05; tableau 2). Discussion de
Dans cette étude, l'isolement réussie de cellules de la pulpe dentaire a été obtenue par l'application de enzymatique digestion avec certaines modifications au protocole de Gronthos et al. [11]. Les cellules obtenues ont subi plusieurs enquêtes pour évaluer leurs propriétés. Selon la Société internationale pour la thérapie cellulaire [39], les critères minimaux pour la définition des cellules multipotentes mésenchymateuses stromales comprennent: (1) l'adhésion à des plats en plastique; (2) le potentiel de différenciation multipotentes; et (3) expression de marqueurs spécifiques de la surface stromale (CD73, CD90, CD105) avec absence d'expression de marqueurs hématopoïétiques (CD45, CD34, CD14 et /ou CD11b, CD19, CD79α) et le marqueur HLA-DR. Les cellules isolées de cette étude ont présenté toutes les caractéristiques ci-dessus.
Concentrations de matières différentes ont été évaluées, et les concentrations avec la meilleure différenciation ont été sélectionnés. Ces concentrations étaient de 200 ug /ml pour EMD, 5 ng /ml pour le PDGF et 0,05 mg /ml pour MTA. Les mêmes concentrations ont été utilisées auparavant dans d'autres études [34, 40, 41]. Dans cette étude, l'analyse de l'ordinateur pour l'activité de l'ALP et une technique d'évaluation semi-quantitative pour alizarine S coloration rouge ont été sélectionnés, ces deux techniques ont été signalés pour donner des résultats avec une sensibilité relative, et ont été appliquées dans les études précédentes [42, 43].
Pour EMD, les résultats ont révélé une augmentation significative de l'expression ALP et l'amélioration de la minéralisation abondante après son application. Ces résultats sont conformes à plusieurs autres études évaluant les effets de ce produit sur des lignées cellulaires multiples [40, 44-48]. Duan et al. [44] ont constaté que EMD amélioré la différenciation ostéogénique induite par les cellules souches pluripotentes, comme en témoigne l'augmentation de l'expression de l'ARNm RUNX2. KEMOUN et al. [45, 46] ont évalué les effets de EMD sur les cellules folliculaires [45] et les cellules souches du ligament parodontal [46]. Dans les deux études, EMD a été trouvé pour améliorer la libération d'ALP et le dépôt de calcium, en plus de l'élévation de plusieurs marqueurs de minéralisation. Une autre étude réalisée par Guven et al. [47] a révélé que Emdogain était le matériau le plus efficace pour améliorer à la fois la prolifération et la différenciation odontogène des cellules souches de germes de dents humaines par le biais de l'évaluation de l'activité de l'ALP, de coloration de Von Kossa, et RT-PCR des analyses pour dentinaire sialophosphoprotéine (DSPP) et immunocoloration pour collagène de type I et DSPP. Une étude réalisée par Wang et al. [48] ont constaté que Emdogain amélioré la minéralisation des DPSC ainsi que leur ostéogénique /odontogène expression du marqueur. Cependant, des études avec des résultats contradictoires sont également disponibles [49, 50]. Il a été rapporté que EMD pourrait ne pas avoir des effets notables sur la différenciation ostéoblastique des cellules parodontales ligamentaires [49] ou des cellules d'os de rat de moelle [50]. Bien que le mécanisme de contrôle exact reste incertain, ces effets ont été expliquées par des différences dans les degrés d'immaturité cellulaire, à savoir le matériel a été pensé pour améliorer la prolifération cellulaire des cellules plus immatures, mais la différenciation des cellules aux stades ultérieurs de la maturité [51].
Dans la présente étude, MTA a donné des résultats contradictoires. Le matériau a révélé une minéralisation amélioration par rapport à la commande de référence, des réductions de certains paramètres ALP (total pour cent de la zone de coloration positive et pointage histologique), et l'entretien des autres paramètres (densité optique moyenne). Bien que Yasuda et al. [52], et Lee et al. [53] ont rapporté que MTA a augmenté la production ALP et /ou la formation de nodules minéralisés par rapport aux cellules de contrôle, à la fois Koh et al. [54] et Nakayama et al. [55] ont rapporté l'expression ALP similaire entre les cellules MTA-traitées et des cellules de contrôle négatif. Ces incohérences suggèrent que la poursuite de l'évaluation des différents paramètres de guidage et qui affectent la performance de ce matériau est justifiée.
En ce qui concerne PDGF dans la présente étude, on a observé que l'expression ALP général a révélé des résultats plus faibles en comparaison avec le groupe témoin négatif ainsi que tous les autres groupes de matériaux ainsi que les différences étaient toujours significative. Indépendamment de l'action de la matière dans l'amélioration prolifératif, PDGF-BB a semblé avoir aucun avantage supplémentaire pour la différenciation ostéogénique, en fonction des paramètres évalués dans cette étude. Plusieurs autres auteurs ont observé des résultats similaires [33, 56]. En effet, le PDGF amélioré la dégradation du collagène osseux [33] et perturbé ou inhibé la formation de matrice osseuse [56]. Nakashima et al. [57] ont montré que le PDGF augmentation de la synthèse de l'ADN, tout en provoquant 40-65% d'inhibition de l'activité de l'ALP. Tanaka et Liang [58] ont signalé que le matériau exercé aucun effet sur l'activité de l'ALP cellulaire ou la synthèse du collagène. Yokose et al. [59] ont rapporté que le PDGF-BB a réduit de manière significative l'activité de l'ALP de DPSC.
Conclusions interactions cellule-surface
favorables avec EMD ont été démontrées, y compris l'expression de l'ALP et de la minéralisation abondante. EMD a donné des résultats supérieurs par rapport au MTA et PDGF en ce qui concerne la différenciation ostéogénique des DPSC. Les effets du MTA sur l'ostéogenèse des DPSC ne sont pas concluants et d'autres études sont nécessaires. En outre, nos données sur le PDGF ne prend pas en charge de sa capacité à induire une différenciation ostéogénique DPSC. Cependant, le PDGF a faciliter la fixation et la croissance cellulaire, suggérant un mécanisme d'action différent qui vaut plus d'enquête.
Méthodes
Isolement de cellules de souches DPSC humains ont été isolés et caractérisés par les auteurs de l'unité de cellules souches, roi Saud University, Royaume d'Arabie Saoudite (données non publiées). Les dents ont été prélevés chez des patients après leur condition consentement éclairé signé, selon un protocole approuvé par le comité d'éthique institutionnelle (College of Dentistry Research Center-CCDPH).
En bref, le contenu de la pâte de dents molaires fraîchement extraits ont été combinés et soumis à 20-40 minutes de digestion enzymatique en utilisant la collagénase de type I (1 mg /ml) et dispase (5000 unités de caséinolytiques). Ensuite, les cellules ont été laissées se développer dans des conditions de culture cellulaire normales (37 ° C, 5% CO
2), en utilisant un milieu d'Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec du sérum de 20% de fœtus bovin (FBS), 1% de pénicilline streptomycine (Pen-Strept), et 1% d'acides aminés non essentiels (tous achetés chez Gibco-Invitrogen, USA).
Caractérisation des cellules souches
unités formant des colonies-fibroblastes (CFU-F)
CFU -F ont été évaluées par culture de 2,5 x 10 3 cellules au deuxième passage dans des boîtes de culture de 6 cm. Au jour 14, les cellules ont été fixées avec 1% de paraformaldehyde, colorées avec 0,5% de cristal violet, et soumis à une évaluation microscopique en utilisant un contraste de phase lumière microscope inversé (Zeiss, Leica, Allemagne).
Cytométrie de flux
Quatrième le passage des cellules (1,5 x 10 6) ont été lavées avec du tampon FACS (1 x solution saline tamponnée au phosphate, 5% de FBS, de l'azoture de sodium à 0,1%), et on les dilue dans 1,5 ml de solution saline tamponnée au phosphate. Ensuite, la souris conjugué à PE anti-humaine de CD146, CD73, CD29 et HLA-DR, FITC-souris conjugué à CD34 anti-humain, une souris CD90, CD45, CD13 et CD31 et APC anti-humain conjugué CD105, CD14, et des anticorps CD44 ont été préparés dans l'obscurité (tous de BD Biosciences, USA, à l'exception de l'anticorps monoclonal dirigé contre CD105 humain, qui a été acheté auprès de R & D Systems, USA) et utilisés. Dans chaque tube FACS, 100 ul de cellules ont été mélangés avec 10 pi de l'anticorps correspondant, et on fait incuber pendant 30 minutes dans l'obscurité à 4 ° C. Les expressions des marqueurs cellulaires ont été évaluées en utilisant un Becton Dickinson FACSCalibur cytomètre de flux (BD Biosciences, USA), et les données obtenues ont été analysées à l'aide de cellules Quest Software Pro Version 3.3, BD biosciences, USA).
Ostéogénique et la différenciation adipocytaire
cellules au quatrième passage ont été cultivées sur des plaques à 6 puits. À 60 à 70% de confluence, la différenciation ostéogénique a été induite en utilisant un milieu d'induction osseuse préparée selon le protocole de Vishnubalaji et al. [60] et composé de DMEM supplémenté avec 10% de FBS, 1% de Pen-Strept, 50 pg /ml d'acide L-ascorbique (Wako Chemicals GmbH, Allemagne), 10 mM de phosphate de glycérol, sel disodique (β-glycérophosphate), 10 nM dexaméthasone et 10 nM de calcitriol (1α, 25-dihydroxyvitamine D3) (Sigma, Royaume-Uni). Les cellules maintenues dans le milieu de culture ordinaire ont servi de témoins. L'ostéogénèse résultante a été évaluée au bout de 14 jours par le biais de la coloration cytochimique pour l'ALP.
Différenciation Adipogenic a également été induite en utilisant un milieu adipogénique standard [60], composé de DMEM supplémenté avec 10% de FBS, du sérum de cheval à 10%, 1% de Pen-Strept, 100 nM de dexaméthasone, 0,45 mM de méthyl isobutyl xanthine, 3 pg d'insuline /ml (tous achetés auprès de Sigma, Royaume-Uni), et 1 uM rosiglitazone (BRL49653, Novo Nordisk, Danemark). La différenciation résultante a été évaluée à 14 jours à travers l'utilisation de l'huile rouge O coloration.
Demande Matériau
Initialement, une étude pilote a été réalisée pour évaluer trois concentrations différentes pour chaque matière, et les concentrations produisant la plus grande quantité de la différenciation ont été sélectionnés pour la comparaison (Fig. 4). Ensuite, les cellules au quatrième passage ont été cultivées et divisés en cinq groupes comme indiqué ci-dessous. Figue. 4 images Scanoscope pour ALP colorées différents groupes expérimentaux de DPSC. grossissement d'origine 1.4 ×. Barre d'échelle 1 mm. a, b, c EMD à des concentrations de 50, 100, 200 ug ml respectivement /. d, e, f PDGF à des concentrations de 5, 10, 20 ng /ml, respectivement. g, h, i MTA à des concentrations de 0,02, 0,2, 2,0 mg /ml, respectivement. j Pourcentage total de la zone de coloration positive pour les différentes concentrations de chaque substance examinée
1. Contrôle négatif: Cellules maintenues dans le milieu de culture cellulaire régulier pour l'ensemble de l'expérience (DMEM avec 20% de FBS, 1% de Pen-Strept, 1% de non- acides aminés essentiels).
2. Contrôle de référence (OT): Les cellules cultivées dans le milieu d'induction osseuse, préparé selon le protocole de Vishnubalaji et al. [60].
3. EMD groupe: Les cellules cultivées dans le milieu ostéoinduction additionné de 200 pg /ml EMD (Straumann, USA)
4.. PDGF groupe: Les cellules cultivées dans le milieu de ostéoinduction supplémenté avec 5 ng /ml de PDGF-BB (Osteohealth, USA)
5.. MTA Groupe:. Les cellules cultivées dans le milieu ostéoinduction additionné de 0,02 mg /ml MTA (Dentsply, USA)
La différenciation obtenue a été analysée par l'évaluation de l'expression de l'ALP par ALP coloration et le dépôt d'ions de calcium par alizarin rouge S coloration. les cellules
activité ALP ont été étalées sur des lames à 8 puits à la densité de 0,02 x 10 6 cellules /chambre et laissées se fixer et croître jusqu'à 50% de confluence. Par la suite, les lames ont été divisés en cinq groupes différents mentionnés ci-dessus et le milieu ordinaire ou ostéogénique a été appliqué en conséquence. Au jour 5, les cellules ont été fixées et colorées pour l'ALP avec une solution de naphtol-AS-TR-phosphate (Sigma, Royaume-Uni). Ensuite, les chambres ont été évaluées sous un microscope numérique à haute résolution où l'ensemble des chambres colorées ont été numérisées avec un scanner ScanScope coulissant (Aperio Technologies Inc., USA) à 40 × grossissement de l'objectif. Les images numériques de six chambres différentes de chaque essai ont été consultés et analysés en utilisant les visualisation et d'analyse d'image des outils de Aperio logiciel Image Scope (version 10.2.2.2352; Aperio Technologies Inc.). L'ensemble de l'expérience a été répétée trois fois de façon indépendante, ce qui donne un total de 18 chambres /groupe pour l'analyse. Les résultats de sortie d'analyse ont été exportées vers des feuilles Excel, en se concentrant principalement sur la surface totale de pour cent de coloration positive, la densité optique moyenne, et le score histologique que les paramètres de l'analyse statistique et la comparaison.
Alizarine rouge S coloration
De la même manière , les cellules ont été cultivées sur des plaques à 24 puits, et les cinq groupes différents ont été établis. Les milieux ont été remplacés deux fois par semaine avec les médias réguliers ou ostéogéniques fraîchement préparé. Au jour 12, les cellules ont été colorées avec 40 mM AR-S d'alizarine rouge (Sigma, R.-U.) et soumis à une évaluation spectrophotométrique selon le protocole de Gregory et al. [61] en utilisant un lecteur de microplaques (Gen5 ™, version 1.10; BioTek Instruments Inc., USA) pour mesurer l'absorbance à 405 nM. Le même protocole a été répété trois fois de façon indépendante, donnant neuf lectures différentes pour chaque essai
analyse statistique
Les données ont été analysées à l'aide du logiciel statistique SPSS. (Version 16.0, SPSS, États-Unis). Les statistiques descriptives (moyenne et écart-type) ont été utilisés pour décrire les variables quantitatives sur les résultats. Une analyse de variance (ANOVA) a été utilisée pour comparer les valeurs moyennes des variables de résultats dans les variables catégorielles (groupes), suivi d'un test post-hoc de Tukey pour des comparaisons par paires. Les valeurs de P & lt;
0,05 ont été considérés pour indiquer la signification statistique
abréviations
ALP:.
Phosphatase alcaline
AR-S:
Alizarine rouge S tache
BRL:
rosiglitazone
° C:
degré Celsius ou degré centigrade
CD:
Cluster de différenciation
CFU-F:
Colony forming unit-fibroblaste
DMEM:
modifiés aigles de Dulbecco (avec glucose élevé, pyrovate de sodium et L-glutamine)
ADN:
acide désoxy-ribionucleic
DPSC :
cellules souches de pulpe dentaire
EMD:
dérivés de la matrice d'émail
FACS:
cellules activé par fluorescence de tri (Flow analyse cytométrique)
FBS: sérum bovin fœtal
FITC:
fluorescence iso thioocyanide
Mg:
Milligrammes
Le ml:
Milliliter
ul: Micro litres
ARNm:
acide ribonucléique messager
MTA:
trioxyde minérale globale
< dfn> PBS: phosphate
solution saline tamponnée
Pen /Strept:
pénicilline /streptomycine
PDGF:
Platelet facteur de croissance dérivé
ARNm: acide ribonucléique
Déclarations de
Remerciements Ce travail a été soutenu par la subvention n ° 09-BIO740 -20 du plan national pour les sciences et la technologie Programme, Royaume d'Arabie Saoudite. Nous remercions tout le personnel de l'Unité de cellules souches, Département d'anatomie, Université du Roi Saoud, Riyad pour fournir leur soutien technique dans cette étude.
Article Ouvrir AccessThis est distribué sous les termes de la Creative Commons Attribution 4.0 License International (http :. //creativecommons org /licences /par /4. 0 /), qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, pourvu que vous donnent le crédit approprié à l'auteur original (s) et la source, fournir un lien vers la licence Creative Commons, et indiquer si des modifications ont été apportées. Dédicace renonciation Creative Commons Public Domain (http:. //Creativecommons org /publicdomain /zéro /1. 0 /) applique aux données mises à disposition dans cet article, à moins d'indication contraire
concurrence. intérêt
les auteurs déclarent qu'ils ont aucun conflit d'intérêts.
auteurs contributions
SA ont participé à différents aspects des études de laboratoire, y compris la caractérisation des cellules, et l'application de la matière, en plus de préparer le projet principal de cet article. NA a aidé dans le développement de l'idée de la recherche principale, préparé la conception de base de l'étude, et a fourni un examen critique pour l'écriture de papier ensemble. En outre, elle agencé pour obtenir les matériaux d'essai dentaires. AD a fourni un appui technique général en particulier dans la caractérisation des cellules et de l'analyse de la différenciation, en plus de son rôle dans l'obtention tous les matériaux de laboratoire de base. MN ont aidé à ostéogénique cellulaire et des études de différenciation adipogéniques, et supervisé la rédaction de la partie technique de l'étude (matériaux et méthodes). Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.
