Résumé
Contexte
En raison de l'augmentation des taux de cancer de l'oropharynx, l'infection à HPV par voie orale est une préoccupation importante. Méthodes de détection HPVs orales ne sont pas normalisées car il existe différentes techniques disponibles. Nous proposons que l'utilisation d'échantillons de rinçage oral pour détecter des HPVs est une technique appropriée dans un cadre clinique. Ainsi, notre principal objectif est d'étudier la détection du VPH dans des échantillons de rinçage oral.
Méthodes
Dans notre étude, nous avons utilisé la collecte d'échantillons de rinçage oral couplée à la PCR en temps réel pour détecter des types HPV 16 et 18, et préférentiellement amplifié échantillons FAP PCR pour détecter une large gamme de HPVs, dans le carcinome oropharyngé épidermoïde cellulaire (OPSCC), non-OPSCC, et les patients en bonne santé. les résultats de
Trente-trois pour cent des 100 patients atteints de cancer ont été positifs pour tout type de VPH ; de ceux 23 étaient positifs pour HPV16. Seulement 1 110 témoins en bonne santé a été positive (ce sujet a été positif pour HPV18).
Conclusion
Nos résultats indiquent que la détection du VPH dans des échantillons de rinçage oral peut être utile comme outil de dépistage pour détecter les cancers oraux associés au VPH.
Contexte
Tissues infectés par le virus du papillome humain (VPH) ont la capacité d'évoluer dans un cancer associés au HPV. Cela est probablement dû à un effet de champ où le VPH peut modifier les fonctions cellulaires régulières résultant dans une tumeur maligne. Bien que nous savons comment tester pour les cancers liés au VPH, il n'y a actuellement aucune norme pour la détection de l'infection par le VPH [1], et le dépistage du VPH pourrait identifier les personnes à risque pour la tête et le cou carcinome épidermoïde (CETC). En parlant de cela, les cas de HNSCC associés au VPH ont été un défi pour dépister, carcinome cavité épidermoïde en particulier par voie orale (CCCO) et le carcinome épidermoïde oropharyngé (OPSCC) cas, qui sont des sous-ensembles de CETC. La zone oropharyngée inclut la base de la langue, le palais mou, les amygdales, et la région des amygdales, avec la cavité buccale qui englobe le reste des tissus intérieurs de la bouche. Les méthodes les plus courantes pour la détection de VPH dans la bouche et de l'oropharynx commence par la collecte de cellules avec un coton-tige, cytobrosse ou un rince-bouche [2], suivie par l'utilisation d'analyses ou de l'ADN basées sur la PCR l'hybridation in situ [3]. Cependant, il y a des défis actuels pour certaines techniques. Par exemple, l'utilisation d'un coton-tige /brosse limite la quantité de la muqueuse qui est échantillonné, et l'obtention d'un échantillon provenant d'une lésion non visible à l'intérieur de la crypte amygdalienne peut ne pas être réalisable [4]. La base de la langue est pas entièrement accessible soit car il est à la fois muqueuse plane et tissu amygdalien, augmentant ainsi le risque de faux négatifs [5]. Nous avons choisi d'utiliser une technique de bain de bouche pour la collecte de l'échantillon car il est non-invasive, rapide et simple pour le patient. Expression
Analyse de p16 a été utilisé comme un biomarqueur pour le HPV associé CCCO /OPSCC, mais des études ont rapporté que p16 surexpression est pas présente toujours dans les cas impliquant des VPH oncogènes [6-9]. Une étude récente a conclu que p16 ne doit pas être utilisé comme un marqueur de substitution pour l'infection à HPV dans les cancers oraux dus à une mauvaise concordance entre les deux [10]. Avant cela, Pannone et al. a également déclaré que p16 immunohistochimie (IHC) seul ne prouve pas être une méthode fiable dans la détection du VPH pour les cas CCCO /de OPSCC [11]. Dans notre étude, nous avons obtenu des informations sur les tests de p16 pour voir si oui ou non les données de notre HPV était en concordance. Incidence
de OPSCC dans les pays développés a augmenté de manière significative et infection par le VPH est proposé d'être le principal facteur [12]. Les facteurs de risque pour l'infection à HPV par voie orale comprennent certaines pratiques sexuelles [13-16]; nombre de partenaires de vie et le nombre de partenaires sexuels récents, l'âge avancé, le sexe masculin, et le tabagisme actuel [17, 18]. Le type le plus courant de HPV associés à l'infection par voie orale est de type 16 [17, 19], qui a été démontré pour être tumorigène dans HNSCCs [20]. Une revue systématique dans le monde entier des biopsies HNSCC démontré HPV16 dans 31% des cas de OPSCC; 16% des cas CCCO; et 17% des cas SCC laryngés [21]. type de HPV 18 semble également jouer un rôle important dans la carcinogenèse, en particulier dans l'oropharynx [22, 23].
Avec la montée de OPSCCs il est impératif d'avoir une technique de l'étalon-or en place pour la détection du VPH par voie orale. Prélèvement d'échantillons de la cavité buccale et de l'oropharynx pour la détection des HPV oraux doit être rapide, non invasive, peu coûteuse, et suffisante en matière de collecte d'ADN du VPH. Dans notre étude, nous avons étudié des échantillons de rinçage oral couplés avec en temps réel TaqMan PCR pour détecter des types de VPH 16 et 18, ce qui est sensible et spécifique. Population de l'étude de
Pour détecter une large gamme de HPVs, nous préférentiellement amplifié les échantillons de rinçage oral de cas de cancer, et fluorescent utilisé arbitrairement apprêtées (FAP) PCR, une méthode générale PCR utilisant des amorces de HPV dégénérés. Entre 2011 et 2013, nous avons recruté 76 OPSCC et 24 patients non-OPSCC de la Seattle Cancer Care Alliance (Seattle, WA), et 110 sujets sains de l'Université de la Clinique dentaire de Washington (Seattle, WA). Les cas de non-OPSCC inclus les patients atteints de cancers CCCO, laryngées, sinus et supraglottique. Nous avons examiné les horaires des cinq oncologues afin d'identifier les patients atteints de cancer admissibles, et discuté de notre étude à leur rendez-vous. Un patient a diminué en raison de plaies dans la bouche et de la sensibilité. 21/100 patients atteints de cancer avaient déjà commencé le traitement et de ces 21 patients: 18 patients ont eu un traitement moins de 21 jours avant le prélèvement, deux avaient plus de 30 jours de traitement, et un patient avait un traitement pendant 7 mois. sujets sains ont été choisis au hasard dans l'étudiant clinique dentaire, un patient a refusé de prendre part à l'étude. exigences d'inclusion pour la population en bonne santé inclus être: sans cancer, pas enceinte, sans VIH, et plus de 16 ans Chaque patient a signé des formulaires de consentement écrit pour participer à l'étude (IRB # 7490 approuvé 9 Avril, 2014), et répondu à un questionnaire de santé simple. Sexe, âge, race, le tabagisme, l'alcool, et l'histoire de la marijuana ont été enregistrées pour tous les sujets. Graphiques pour un sous-ensemble de nos patients ont été examinés pour p16 immunohistochimie (IHC) et du test HPV
Méthodes
Collection & amp. méthodes de purification d'ADN
Pour la collecte de l'échantillon, tous les patients rincés et gargarisme pendant 30 s avec origine Mint Scope® rince-bouche (Procter & Gamble). Quatre individus sains normaux ont demandé à utiliser CrestMD rince-bouche sans alcool en raison d'une histoire de l'alcoolisme. Des échantillons de rinçage oral ont été centrifugés pendant 15 min. à 4 ° C pour former un culot, le surnageant a été jeté et le culot a été placé dans -80 ° C jusqu'à traitement ultérieur. Le Kit Puregene® de purification d'ADN a été utilisé pour isoler l'ADN génomique à partir de la pastille buccale cellulaire dans les échantillons de bain de bouche (Qiagen item # 158467, le protocole du fabricant a été suivi).
Tous les sujets humains protocoles et règlements de la CISR ont été suivis dans le cadre du Fred Hutchinson Cancer . directives Research Center (IRB # 7490 approuvé 9 Avril, 2014)
HPV & amp; Taqman Les essais de PCR en temps réel des méthodes analytiques ont été utilisées pour la détection sur le système de détection de séquence ABI Prism 7900 avec 40 cycles dans une réaction (dénaturation à 95 ° C, annelage et extension à 60 ° C). quantification absolue a été utilisée pour déterminer HPV16 et 18 la charge virale, et l'ADN génomique humain total dans l'échantillon a été déterminée sur des séquences Alu. Des dilutions en série de l'ADN génomique humain et pleine longueur HPV16 et 18 plasmides, des concentrations connues, ont été utilisés comme courbes standard
HPV16 E7 Amorces
Forward:. CGGACAGAGCCCATTACAATATT
Reverse: CGCACAACCGAAGCGTAGA
HPV16 E7 Probe: TAACCTT (T /C) TGTTGCAAGTGT
HPV18 E7 Amorces:
Forward: CCGACGAGCCGAACCA
Inverser: TGGCTTCACACTTACAACACATACA
HPV18 E7 Probe: AACGTCACACAATGTT
afin d'augmenter l'efficacité de la détection du VPH, nous avons utilisé la multiplication amorcée laminage circulaire technique d'amplification (MP-RCA) pour amplifier préférentiellement l'ADN du VPH inconnu, circulaire. MP-RCA a été démontré pour amplifier les matrices d'ADN circulaires jusqu'à 107 fois [24]. Le protocole TempliPhi 100 Kit Amplification (Amersham Biosciences) a été suivie.
Le PCR FAP publié protocole a été suivi pour détecter une large gamme de types de HPV où amorces ont été développées à partir des régions L1 conservées [25]. Nous n'effectué cette technique sur les cas de cancer des échantillons (Fig. 1). Figue. Résultats 1 FAP PCR sur un gel d'électrophorèse. Une bande attendue de ~ 480 pb indique un échantillon positif de HPV
Nous avons classé les antécédents de tabagisme comme suit: non-fumeur (0 packs); fumeur lumière (& lt; 1pack /semaine); fumeur modéré (≥1pack /semaine ≤1 paquet /jour); gros fumeur (≥1pack /jour). Pour ceux qui fumait des cigares ou chiquait nous avons calculé à l'équivalent de paquets de cigarettes fumées. l'histoire de l'alcool a été classé comme suit: aucun (ne boit jamais); rarement /occasionnellement (1 boisson tous les 1-2 mois); la lumière (1-6 verres /semaine pour les femmes, 1-13 verres /semaine pour les hommes); modérée (7 verres /semaine pour les femmes, 14 verres /semaine pour les hommes); Le cancer buccal de résultats de
Toutes les données analyse a été effectuée en utilisant Stata MP 13.1 (StataCorp LP, Texas, États-Unis) lourds (14 verres /semaine pour les hommes & gt;; 7drinks /semaine pour les femmes, & gt).. sujets avec OPSCC et non OPSCC étaient plus susceptibles d'être de sexe masculin que chez les sujets témoins sans cancer, au moins 83% des sujets de chaque type de cancer étaient des hommes, comparativement à seulement 46% des témoins (tableau 1; p
& lt; 0,001). Les cas de cancer étaient également plus âgés que les témoins, comme & gt; 80% des cas, indépendamment du type de cancer, avaient 50 ans ou plus, contre seulement 63% des contrôles (p
& lt; 0,001). Sujets avec OPSCC et non OPSCC étaient semblables à des sujets sans cancer par rapport à la race (p
= 0,30) et l'origine ethnique (p = 0,62
) et étaient majoritairement caucasiens non-hispaniques. Ceux qui ont eu le cancer (39% OPSCC, 54% non-OPSCC; p
& lt; 0,001) étaient plus susceptibles d'être des fumeurs lourds par rapport à ceux sans cancer (32%). l'histoire de l'alcool lourd était répandue dans 33% des OPSCC et dans 33% des patients CCCO (p = 0,015
) comparativement à seulement 12% des sujets non cancéreux. La consommation de marijuana a été principalement observée dans les cas de cancer (11% OPSCC, 4% CCCO; p = 0,010
) et rarement dans les contrôles (0,91%). Les cas des deux types de cancer (33% OPSCC, 33% non-OPSCC; p
& lt; 0,001) étaient plus susceptibles d'avoir le VPH détectable que les témoins en bonne santé (0,9%), et plus précisément de type 16 (25% OPSCC, 17% non OPSCC, p
& lt; 0,001) détectée dans les échantillons de rinçage buccal par rapport aux témoins. détection de HPV18 n'a pas varié selon le groupe d'étude et a été détecté dans un seul échantillon provenant d'un sujet témoin (p = 0,63
), et aucun dans les cas de cancer. Notre méthode de détection du VPH avait une sensibilité de 33% et une spécificité de 99% (p
& lt; 0,001) .able 1 Démographie parmi tous les sujets dans les cas de non-cancer et
Aucun cancer
OPSCC
non-OPSCC
p
-value
n
= 110
n
= 76
n
= 24
Sexe
51 (46,36% de) Masculin
63 (82,89%)
20 (83,33%)
& lt; 0,001
Femme
59 (53,64%)
13 (17,11%)
4 (16,67%)
âge Regroupées
20-39
27 ( 24,55%)
1 (1,32%)
1 (4.17%)
40-49
13 (11,82% )
10 (13,16%)
2 (8,33%)
50-59
21 (19,09%)
29 (38.16%)
11 (45,83%)
& lt; 0,001
60-69
29 (26,36%)
30 (39,47%)
8 (33,33%)
70+
20 (18,18%)
6 (7,89%)
2 (8,3%)
Race
Asie
5 (5,55%)
2 (2,63%)
1 (4.17)
Black
6 (5,45%)
1 ( 1,32%)
0
92 (83,64% de
Blanc
)
65 (85.53% de)
21 ( 87,50%)
0,30
Autre
7 (6,36%)
4 (5,26%)
1 ( 4.17%)
Inconnu
0
4 (5,26%)
1 (4.17%)
Origine ethnique (hispanique /Latino)
Oui
4 (3,64%)
2 (2,63%)
0
0,62
No
106 (96,36%)
74 (97,37%)
24 (100%)
Les antécédents de tabagisme
non-fumeur
51 (46,36%)
21 (27,63%)
5 (20,83 %)
fumeur Lumière
1 (0,91%)
14 (18,42% de)
2 (8,33%)
& lt; 0,001
fumeur modéré
23 (20,91%)
11 (14,47%)
4 (16,67 %)
fumeur lourd
35 (31,82%)
30 (39,47%)
13 (54,17%)
histoire de l'alcool
Aucun
24 (21,82%)
7 (9,21%)
3 (12,50%)
Rarement /
occasionnellement
16 (14,55%)
14 (18,42%)
4 (16,67%)
lumière
54 (49,09%)
27 (35,53%)
9 (37,50%)
0,015
Modéré
3 (2,73%)
3 (3,95%)
0
lourd
13 (11,82%)
25 (32,89%)
8 (33,33%)
Toute marijuana utiliser
Oui
1 (0,91%)
8 (10,53%)
1 (4.17%)
0,010
Non
109 (99,09%)
68 (89,47%)
23 (95,83%)
Tout VPH
1 (0,91%)
25 (32,89%)
8 (33,33%)
& lt; 0,001
HPV 16 positifs
0
19 (25,00%)
4 (16,67%)
& lt; 0,001
HPV 18 positifs
1 (0,91%)
0
0
0,63
aData pour "No Cancer" est associé à publié des données de prévalence des types de VPH 16 et 18 au sein de la création d'une clinique d'étudiant en médecine dentaire
(J Dang et al.)
Vingt-deux échantillons positifs de HPV ont été testés pour p16 avant l'échantillonnage, et un seul testés négatifs pour p16 . Cependant, 26 échantillons qui étaient négatifs pour le HPV étaient positifs pour p16 (tableau 2). Il convient de noter que trois des 26 patients (p = 0,085
) a subi un traitement (ie. La chimiothérapie, la radiothérapie, l'excision) avant l'échantillonnage, ce qui pourrait influer sur la présence d'une infection par le VPH avant. HPV a été légèrement associée à la détection de p16 (p = 0,076
); des patients qui étaient positifs pour le VPH, 96% ont eu un test de p16 positif; un seul échantillon qui a été positif pour HPV testé négatif pour p16. Parmi les patients HPV négatifs, 79% étaient p16 positive. Seuls deux cas les patients avaient le dépistage du VPH terminé avant l'échantillonnage et les deux étaient négatifs pour le HPV dans nos tests et screening.Table 2 p16 et tout HPV
p de toute HPV
p16 test
-value
positive
négatif
0,076
n
= 48
n = 8
Oui
22 (95,65%)
1 (4,35%)
Non
26 (78.79%)
7 (21,21%) le prélèvement d'échantillons des patients de
discussion peut être une tâche difficile et prend du temps surtout quand le chercheur est interrompre un rendez-vous. En outre, de nombreuses personnes ont des réflexes gag sensibles, donc si une technique de brosse ou un tampon est utilisé pour gratter le fond de la gorge, l'obtention d'un échantillon peut être assez difficile sans l'aide d'un anesthésique topique. Voilà pourquoi il est impératif d'avoir une technique d'échantillonnage en place qui est non-invasive et rapide, mais suffisante pour la détection du VPH. Notre étude a démontré que le prélèvement d'échantillons de rinçage buccal est une méthode discrète à utiliser pour la détection de HPV par voie orale. Ceci est en accord avec une étude comparant le rinçage oral et une brosse cytologique échantillonnage, qui a conclu que les rinçages oraux étaient le meilleur choix pour l'échantillonnage de la cavité buccale afin de détecter le VPH [26].
Nous avons utilisé Scope® parce qu'il était observé pour avoir une excellente conservation de haut poids moléculaire, la qualité de l'ADN, et il est plus acceptable que la plupart des autres milieux de rinçage [27]. Quatre patients témoins priés de rincer à Crest rince-bouche non-alcoolisée Pro-Health®. Nous ne voyons pas les différences de quantité d'ADN (données non présentées), mais plus de recherche est nécessaire pour voir s'il y a une différence avec la quantité ainsi que la qualité.
Quantifier la charge virale peut être crucial pour déterminer si OPSCC HPV-positif /OSCCs sont sans aucun doute le résultat d'une infection par le VPH [28]. L'étalon-or pour le VPH évaluation de la charge virale est-PCR en temps réel [29, 30]. Une étude a démontré OPSCC d'avoir une charge virale de ~ 80.000 fois plus élevé que CCCO et d'autres HNSCCs [29]. Nos résultats ont montré aucune différence significative entre les deux groupes de cancer (Fig. 2). En outre, les différences dans les résultats pourraient être dus à des auteurs utilisant des biopsies fraîches congelées où seule une petite partie de la cavité buccale ou de l'oropharynx est échantillonné. Des échantillons de rinçage oraux peuvent permettre une collecte plus efficace des cellules par voie orale pour la détection du VPH. Variation des conclusions justifie une enquête plus approfondie de la charge virale en association avec des sous-ensembles de CETC. Figue. 2 Comparaison de la charge virale HPV16 (copies /ng d'ADN) entre les deux groupes de cancer. Aucune différence statistiquement significative n'a été observée (p
= 0,40). Les cases grises montrent plage de bas à quartiles supérieurs. La médiane est représentée par une ligne horizontale. Les valeurs maximales et minimales sont indiquées par des lignes verticales. la variation de la charge virale entre chaque groupe a été démontrée. La charge virale médiane OPSCC était légèrement plus élevé que les cas de non-OPSCC
Le seul patient avec OPSCC, qui avait subi un traitement pendant 7 mois avant l'échantillonnage, a été positif pour HPV, en particulier de type 16. Ce cas est unique en subissant plusieurs mois de traitement doivent éradiquer le virus, sauf si l'infection est récente. Il convient de noter que le patient avait un fumer et de boire l'histoire lourde. D'autres recherches sur la prévalence de l'infection par le VPH après la radiothérapie /chimiothérapie est justifiée.
Une limitation majeure a été de ne pas avoir l'ADN de tissu tumoral pour comparer la détection du VPH. Les échantillons de tissu ne sont pas disponibles pour nous, mais auraient agi en tant que norme d'or au sein de notre étude. D'autres limites à notre étude comprennent: nos résultats démontrant une faible sensibilité pour la détection du VPH chez les patients cancéreux, mais avec une spécificité très élevée; nous ne pouvions pas contrôler la façon dont un patient gargariser et remuez le rince-bouche, ce qui aura un effet sur la quantité et la qualité de l'ADN recueilli; Scope® a un goût de menthe forte, qui peut ne pas convenir à ceux qui ont des bouches sensibles; taille de l'échantillon petit; pas de détection pour HPV ARN pour montrer une infection active; et FAP PCR est suffisamment sensible pour détecter une large gamme de HPVs, mais certains HPVs ne peut être détectée en raison de la généralité des amorces conçues [25]. test
p16 est habituellement effectuée uniquement dans les cas où ils ne correspondent pas les facteurs de risque traditionnels (ie. le tabac important et historique de la consommation d'alcool), et le test HPV est rarement fait. Ceci est quelque chose qui doit être changé pendant le diagnostic en raison de l'augmentation des OPSCCs associées au VPH.
Conclusions
De nos résultats, nous avons démontré que préférentiellement amplifié échantillons de rinçage oral avec la détection du VPH à partir en temps réel TaqMan PCR et FAP PCR, est une méthode utilisable dans l'ensemble, qui pourrait être utilisé dans un cadre clinique. Des études plus spécifiques devront être effectuées pour déterminer si la bouche rinçages ne reflètent effectivement, dans les cas, le type de HPV associé à la lésion cancéreuse
abréviations
CCCO:.
carcinome épidermoïde oral
OPSCC: carcinome
épidermoïde oropharyngé
CETC:
Tête et cou épidermoïde carcinome
RT-PCR:
temps réel la réaction en chaîne par polymérase
FAP PCR:
fluorescent arbitrairement apprêté réaction en chaîne par polymérase
MP-RCA:
Multipliez-apprêté amplification de roulement circulaire
Déclarations
Remerciements Source de financement de l'Université du Fonds de recherche Libre de Washington
Ouvrir. AccessThis article est distribué sous les termes de la Creative Commons attribution 4.0 License internationale (http:. //creativecommons org /licences /par /4. 0 /), qui permet sans restriction l'utilisation, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que vous donniez le crédit approprié à l'auteur (s) original et la source, fournir un lien vers la licence Creative Commons, et d'indiquer si des modifications ont été apportées. Dédicace renonciation Creative Commons Public Domain (http:. //Creativecommons org /publicdomain /zéro /1. 0 /) applique aux données mises à disposition dans cet article, à moins d'indication contraire
concurrence. intérêts
les auteurs déclarent qu'ils ont aucun conflit d'intérêts. les contributions des auteurs
JD complété toutes les expériences, a analysé toutes les données, et a écrit le manuscrit. NBK et QF conçu /conçu l'étude, et examiné /édité le manuscrit. KDE est l'oncologue de collaboration pour l'étude qui a contribué à la collecte de l'échantillon, et après examen /édition du papier. HJ a aidé à la collecte d'échantillons. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.
