Résumé
Contexte
La carie dentaire est la maladie microbienne la plus commune affectant l'humanité. Caries méthodes d'évaluation des risques, l'identification des biomarqueurs et des stratégies de développement de vaccins sont souligné pour contrôler l'incidence de la maladie en grande partie évitable. récepteurs de reconnaissance de motifs tels que le péage comme récepteurs (TLR) ont été impliqués en tant que modulateurs des interactions hôte-microbien. Soluble dans le TLR-2 et son co-récepteur, CD14 identifiés dans la salive peuvent se lier les composants de la paroi cellulaire des bactéries cariogènes et de moduler le processus de la maladie. L'objectif de cette étude est de déterminer le potentiel de salivaire STLR-2 et sCD14 comme biomarqueurs de l'activité des caries et des mesures indirectes de la charge bactérienne cariogène.
Méthodes
toute la salive non stimulé ont été recueillis à partir de vingt caries libres et vingt caries les enfants actifs âgés entre 5 et 13 ans. Résultats de la concentration de sCD14 et STLR-2 ainsi que celle de la cytokine IL-8 rapporté que l'augmentation de la carie dentaire a été évaluée par le dosage immunoenzymatique.
Bien que le niveau de sCD14 et celle de IL- Conclusions de 8 était équivoque entre les deux groupes, la concentration STLR-2 dans la carie salive actif était significativement plus élevée que celle de la carie de la salive libre.
le STLR-2 dans la salive pourraient servir de biomarqueur potentiel d'activité des caries. Saliva Soluble le péage de
Mots-clés like receptor 2 caries dentaires Biomarker électronique matériel supplémentaire
La version en ligne de cet article (doi:. 10 1186 /1472-6831-14-108) contient du matériel supplémentaire, qui est disponible aux utilisateurs autorisés.
Contexte
la carie dentaire est une maladie infectieuse multifactorielle causée par des interactions complexes entre les bactéries productrices d'acide, des glucides fermentescibles et facteurs de l'hôte. En dépit d'être en grande partie évitable, il reste que la maladie chronique la plus répandue dans le monde [1]. analyses systématiques récentes suggèrent que l'incidence de la carie présente une tendance croissante chez les enfants âgés de 2-4 ans aux États-Unis [2]. Il existe des preuves de la prévalence accrue chez les adultes dans le statut socio-économique plus faible dans les pays européens. Dans les pays en développement la prévalence est en augmentation chez les enfants et les adultes [3].
Détection précoce des lésions blanc-tache, arrêter la déminéralisation et la promotion de la reminéralisation sont quelques-unes des méthodes cliniques préventives actuellement utilisées en chirurgie dentaire gestion des caries [4]. De plus l'accent est mis sur l'élaboration de stratégies d'évaluation des risques de caries efficaces pour déterminer la probabilité d'un individu le développement de nouvelles lésion carieuse et /ou pour déterminer l'état du processus de la carie sur dent surfaces individuelles [4, 5]. Les maladies des tissus minéralisés des dents, de la pathogenèse de la carie implique déminéralisation de l'émail par les bactéries productrices d'acide et la destruction de la substance organique résultant en une cavitation [1, 4].
Salivaire est reconnue comme une source importante de facteurs hôtes capables de moduler le processus de la carie [6, 7]. Les progrès technologiques ont contribué à la caractérisation de la protéomique salivaire et peptidomique avec l'identification de 1444 protéines et peptides 11893 respectivement [8]. Ces protéines /peptides appartiennent à différentes classes fonctionnelles telles que celles impliquées dans la réponse à un stimulus /stress, fonctions antioxydantes, fonctions catalytiques et les régulateurs de l'enzyme [8, 9]. Plusieurs composants salivaires ont été évalués pour une association avec la carie dentaire. Alors que certains présentent faible association, d'autres étaient équivoques entre normal et caries salive actif [9-12]. Évaluation des glycoprotéines salivaires avec oligosaccharides spécifiques a montré que des niveaux élevés de sélectionner un oligosaccharide qui facilitent la colonisation bactérienne à la surface des dents en corrélation avec l'incidence des caries chez les jeunes adultes [13]. niveaux salivaire d'agents antimicrobiens tels que les défensines alpha, statherin et cystatine S ont été suggérés comme facteurs de risque potentiels pour le développement des caries [10, 14].
Toll like receptors (TLR) sont la lignée germinale des récepteurs qui reconnaissent des motifs microbiens conservés généralement codé partagée par les grands groupes de micro-organismes. Actuellement 13 TLR mammifères et beaucoup de leurs ligands sont connus [15]. Fonctionnement seul ou de concert avec des co-récepteurs spécifiques dans la reconnaissance de formes microbiennes l'acte TLR comme gardiens d'échantillonnage en permanence l'environnement et obtenir des réponses pour prévenir l'infection /de contrôle [15, 16]. TLR-2 et de TLR-4 se sont avérés reconnaître le peptidoglycane de bactéries Gram positif et le lipopolysaccharide des bactéries à Gram négatif, respectivement, soit seuls, soit en liaison avec le co-récepteur commun CD14 [17, 18]. Il a été démontré odontoblastes localisées à la surface de dentine-pulpaire des dents saines pour exprimer TLR-2 et TLR-4. En fonction de la nature de la odontoblastique progression de la carie de réponse est soit supprimée avec la formation de la dentine réactionnaire ou accélérée conduisant à une inflammation pulpaire [19, 20]. invasion microbienne de la dentine a été montré pour réguler à la hausse le TLR-4 dans les odontoblastes et la médiation du TGF-β sécrétion facilitant la synthèse du collagène. En outre TLR-4 dans la signalisation odontoblastes régulent positivement aussi métalloprotéinase-2 matricielle favorisant le clivage de la sialophosphoprotéine dentinaire (DSPP) pour sialoprotéine dentaire (DSP) qui forme un site de nucléation pour la formation de cristaux dans hydroxyapeptite le collagène nouvellement formé [19]. La stimulation de cellules avec odontoblaste comme composants de la paroi cellulaire des bactéries Gram-positives et des cytokines provoquée chimiokines les sécrétions d'une manière dépendante de TLR-2 [20]. Des niveaux élevés de cytokines IL-6, TNF-α et d'IL-8 ont été observées dans la salive carie actif [21].
Bien qu'il soit principalement associée à une membrane, récemment des formes solubles de certains TLR ont été identifiés dans les fluides corporels. Il a été suggéré que les TLR solubles agissent pour séquestrer les agents pathogènes [22-25]. Récemment, nous et d'autres ont signalé la présence de sCD14 soluble et STLR-2 dans la salive [24, 26]. TLR-2 a été démontré que pour reconnaître le peptidoglycane et l'acide lipotéichoïque de Streptococcus mutans Le plus, les bactéries cariogènes les plus courants [27]. Des preuves considérables suggèrent une forte corrélation entre la présence accrue de bactéries cariogènes dans le biofilm de la plaque et un nombre élevé de bactéries dans les mêmes salive [6, 10]. Par conséquent, nous émettons l'hypothèse que le niveau de STLR-2 et sCD14 dans la salive des caries personnes actives donnera une mesure indirecte de la charge bactérienne et d'agir en tant que biomarqueur de l'activité de la carie. Nos données suggèrent que le STLR-2 est plus élevé dans la salive entière non stimulées (UWS) des enfants atteints de lésions carieuses actives.
Population d'étude de
Méthodes Dans cette étude prospective non randomisée étude clinique quarante enfants entre 6 et 12 ans de rapports aux cliniques pédiatriques de l'école de médecine dentaire de l'Université d'Indiana ont été recrutés après avoir obtenu le consentement éclairé des patients et le tuteur. L'étude a été approuvée par le Conseil de l'Université de Purdue Indiana University à Indianapolis Institutional Review. Les échantillons ont été collectées que des enfants sans maladie connue par voie orale ou systémique autre que la carie dentaire et pas de dents extraites. Les examens oraux des enfants ont été effectués et l'activité des caries enregistrées. Vingt enfants (13 garçons et 7 filles) étaient caries libres et vingt enfants (12 garçons et 8 filles) étaient caries actifs présentant quatre à huit lésions carieuses nécessitant la restauration de. La collecte et le traitement
Tous les enfants ont été invités à éviter l'échantillon manger et boire pendant au moins 2 heures avant le prélèvement de la salive comme décrit [24, 28]. Après rinçage de la bouche brièvement à l'eau, non stimulé toute la salive (UWS) a été recueilli à partir de chaque enfant par la méthode de bave passive pendant cinq minutes dans des tubes pré-réfrigérés. Les échantillons ont été transportés sur la glace au laboratoire immédiatement pour le traitement. La concentration totale en protéines
chaque échantillon a été clarifié par centrifugation à 4000xg à 4 ° C pendant 10 minutes et stocké dans trois aliquotes à -80 ° C dans CompleteTM Protease Inhibitor Cocktail (Roche, Mannheim, Allemagne) jusqu'à une analyse ultérieure. la teneur totale en protéines des échantillons a été mesurée préalablement par la méthode de Bradford qui implique la liaison du colorant bleu de Coomassie pour les protéines [24, 25]. La forme de protéine-colorant bleu a été détectée à 595 nm en utilisant un spectrophotomètre (Gensys5 spectrophotomètre, corp thermoélectronique, CA). La concentration de la protéine dans chaque échantillon a été déterminée sur une courbe standard d'enzyme d'développée en utilisant concentration connue de sérum-albumine bovine linked immunosorbent assay (ELISA)
Pour la détermination de sCD14 dans la salive d'un kit ELISA en sandwich (R & amp;. D Systems , Minneapolis, MN) a été utilisé selon les recommandations du fabricant. un anticorps polyclonal anti-humain TLR-2 (clone: Imgenex Corporation, San Diego, CA) a été utilisé pour la détection de TLR-2. Tous les échantillons UWS ont été épuisées de l'amylase et des immunoglobulines par incubation en série avec l'anticorps anti-humain amylase monoclonal (mAb) (1: 2500, catalogue # ab8944; Abcam, Cambridge, MA, USA) et de protéines G perles (Miltenyi Biotec Inc Auburn, CA ) à 4 ° C [24]. La teneur en protéines des échantillons préalablement nettoyé a été déterminé comme ci-dessus et préalablement nettoyées HWL à 1 pg /ml de concentration a été utilisée pour la mesure de sCD14 et STLR-2 niveaux [25]. Préincubation de l'UWS soit anti-TLR2 mAb (clone: 1030A5.138, Imgenex Corp, San Diego, CA, USA) (0,5 pg /ml) ou avec TLR-2 peptides (1 pg /ml) a été réalisée pour évaluer la spécificité de liaison. CD14 lié et TLR-2 a été détectée avec la peroxydase de raifort (HRP) d'IgG anti-souris conjugué suivie substrat TMB (Pharmingen, San Diego, CA). L'absorbance à 450 nm a été lue dans un lecteur de microplaques (modèle 680: Biorad Laboratories, CA). La concentration de STLR-2 ou sCD14 en pg /ml de protéines de la salive a été déterminée en utilisant une courbe standard de CD14Fc humaine recombinante purifiée et TLR-2k (R & amp; D Systems) de concentration connue. IL-8 concentration dans les échantillons de salive clarifiées ont été mesurées en utilisant le kit BD OptEIA3 ™ ELISA.
Différences d'analyse statistique de la concentration de l'IL-8, CD14 et TLR-2 entre les caries et la carie libres ont été déterminées groupes actifs par le test t des élèves. valeur de p inférieure à 0,05 a été considérée comme significative.
Résultats et discussion
Malgré les progrès dans les méthodes de détection précoce et des mesures de prévention efficaces de caries dentaires reste une maladie chronique très répandue dans le monde entier. L'incidence croissante chez les enfants dans les pays développés constitue un problème de santé inquiétant [2, 3]. Les détails démographiques de la population de l'étude sont donnés dans le tableau 1. La concentration totale en protéines de la salive humaine a été démontré que de grandes variations allant de 0,4 mg /ml à 7,1 mg /ml [29, 30]. Dans notre cohorte d'étude, la concentration totale en protéines mesurée 6,24 +/- 1,98 mg /ml dans la carie salive libre et 5,92 +/- 2,37 mg /ml dans la carie actif salive (figure 1A) .Table 1 Les données démographiques de la population de l'étude
données cliniques
Nombre recruté
Âge (ans)
Homme
Femme
caries dentaires
12
8
8,76 +/- 3,42
contrôle
santé
13
7
7,77 +/- 2,7
Figure 1 concentration totale de protéines dans la salive: Clarification toute la salive a été évalué pour (A) teneur totale en protéines par spectrophotométrie et (B ) la concentration d'IL-8 par ELISA. Aucune différence significative n'a été observée entre les caries libres et les caries des groupes de salive actifs.
Pour le nombre croissant de protéines salivaires sont ajoutés les formes solubles de récepteurs de reconnaissance des formes, l'STLR-2, sCD14 et STLR-4 [25, 26 31]. La concentration de STLR-2 dans la salive parotide a été rapportée comme étant de plusieurs plis supérieur à celui de la salive entière [31]. La source de STLR-2 peut être soit une sécrétion active de la glande et /ou un résultat d'un clivage extracellulaire du récepteur liée à la membrane. Nous avons observé que la concentration de STLR-2 dans la salive carie active (29.5 +/- 3 pg /ml) était significativement plus élevée que celle de la carie salive libre (24.8 +/- 0,6 pg /ml) (figure 2B). Une signalisation via les TLR dans les cellules hôtes induit la sécrétion de cytokines [15]. Gornowicz précédemment et al., Ont rapporté des taux élevés d'IL-8 salivaire dans les caries dentaires [21]. Nous avons observé que la concentration d'IL-8 salivaire ne différait pas significativement entre les caries et la carie libres salive active (figure 1B). L'observation variable entre les deux études pourrait être attribuée aux différences de l'âge et de la nature de l'échantillon (amylase et Ig appauvri vs. non appauvri). La concentration de sCD14 dans la salive était équivoque dans les deux groupes; comprise entre 509 pg /ml et 1443 pg /ml dans la carie groupe libre et entre 609 pg /ml et 1829 pg /ml dans la carie groupe actif (figure 2A). Bergandi précédemment et al., Rapporté l'absence complète de sCD14 dans la salive chez les enfants de deux à huit lésions carieuses [28]. L'utilisation de la salive pré-nettoyée et la méthode utilisée pour mesurer sCD14 (de Western blot contre ELISA sandwich) pourrait attribuer les différences observées entre le rapport Bergandi et notre étude. La figure 2 sCD14 et la concentration STLR-2 dans la salive: la salive clarifiée a été appauvries en protéines abondantes de haut poids moléculaire, l'amylase et les immunoglobulines, telles que décrites dans la section des méthodes pour augmenter la sensibilité de la détection de moins abondante sCD14 et STLR-2. Le niveau de (A) sCD14 et (B) STLR-2 a été déterminée par ELISA. * Représente p & lt; 0,05.
Basé sur sa forte association avec l'incidence des caries multiples études ont évalué les niveaux salivaires de S. mutans
pour la prédiction du risque carieux avec des résultats variables [1, 32]. L'étiologie polymicrobienne des caries dentaires, ainsi que l'interaction entre les protéines salivaires et S. mutans
pourraient contribuer à la variabilité [30, 33]. Quatre principaux types de salivaire interaction protéine-microbienne ont été observés in vitro. Ceux-ci comprennent l'agrégation, l'adhésion, l'inhibition /tue les cellules, et de la nutrition [33]. On suppose que l'augmentation observée STLR-2 dans la salive carie actif peut représenter une mesure hôte pour lutter contre les bactéries Gram + ve accrue des bactéries cariogènes. Ceci suggère que le niveau salivaire STLR-2 peut représenter un biomarqueur efficace pour l'activité des caries. La grande variation dans la concentration STLR-2 dans la salive carie active pourrait être due à l'étendue de la carie.
Conclusions
La carie dentaire est une maladie complexe, la sévérité clinique dépend de l'interaction entre les micro-organismes par voie orale, la disponibilité des glucides fermentescibles et facteurs de l'hôte dans la salive. Cela rend l'identification des facteurs de risque prédictifs pour le processus carieux très difficile [5, 6]. Dans ce rapport, nous avons observé que deux protéines solubles, sCD14 et STLR-2, qui agissent à l'interface hôte microbienne sont modifiés dans la carie salive active avec un représentant plus tard, un biomarqueur potentiel pour l'activité des caries. Les études futures corréler les STLR-2 niveaux avec les numérations bactériennes cariogènes dans la salive
abréviations
UWS:.
toute la salive non stimulé
TLR:
Toll like receptor.
Déclarations de reconnaissance
les auteurs reconnaissent le soutien apporté à Alyssa Zhao par Indiana CTSI pour compléter le programme de recherche d'été.
'original présenté auteurs fichiers pour les images
Voici les liens vers les fichiers soumis originaux des auteurs pour les images. de fichier d'origine pour la figure 1 12903_2014_443_MOESM2_ESM.tif Auteurs '12903_2014_443_MOESM1_ESM.tif Auteurs fichier d'origine pour la figure 2 Intérêts concurrents
Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt en concurrence les contributions des auteurs
AZ:. Alyssa est une haute sophomore scolaire qui a effectué les expériences ELISA dans le cadre du programme de bourses de recherche d'été, la graine de projet, co-parrainé par l'American Chemical Society et l'Institut clinique Traductions Sciences Indiana. Elle a également écrit la première ébauche de la section «Contexte». CB: Corinne est un assistant de recherche de premier cycle qui a aidé à Alyssa dans la conduite des expériences, plus dans l'analyse des données ELISA. Elle a participé activement à la transformation de l'échantillon. Elle a également participé à l'écriture manuscrite. JC: Dr Chin est le dentiste pédiatrique et assisté dans le recrutement de la population de l'étude et la collecte d'échantillons. MS: est l'enquêteur principal qui supervise le projet, y compris l'obtention des approbations éthiques, la conception expérimentale et l'analyse des données et la préparation du manuscrit. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.
