Résumé de l'arrière-plan
Le rôle des glycoconjugués de surface cellulaire à l'oral maladie des muqueuses du greffon contre l'hôte (GVHD) ne sait pas encore, même si les changements moléculaires dans l'épithélium buccal sont essentiels pour la pathogenèse de ces lésions. Dans cette étude, nous avons étudié les changements dans la liaison du mannose (Man) Objectif spécifique de culinaris
lectine (LCA) dans la muqueuse buccale des rats avec GVHD.
Méthodes
cellules de rate de rats Lewis ont été injectés dans ( Lewis x Brown Norway) F
1 rats pour induire GVHD systémique, y compris les lésions de la muqueuse buccale. Résultats des échantillons Tongue et de la rate ont été évalués à l'aide de la lectine histochimie, immunohistochimie, western blot, Transwell tests de migration et de Stamper-Woodruff essais de liaison.
Reliure de Man spécifique LCA étendu aux couches épithéliales de la langue dans GVHD-rats . Une expansion de LCA liaison a été liée à l'expression accrue de mannosyltransferase dans la muqueuse buccale. CD8 +, les cellules effectrices de la muqueuse buccale GVH de exprimée mannose-binding protein (MBP) et a migré dans le milieu contenant de l'homme dans l'essai de migration Transwell. Conclusions du respect des CD8 + des cellules à l'épithélium buccal pourrait être inhibée par prétraiter CD8 + cellules avec un anticorps MBP et /ou en prétraitant sections avec Man spécifique LCA.
augmentation de l'expression de l'homme sur kératinocytes conduit à la migration et /ou l'adhésion des CD8 + cellules dans l'épithélium de surface, qui est médiée en partie par la voie MBP /homme liant pendant le développement de GVHD orale muqueuse.
Mots-clés
Graft par rapport à l'objectif de la maladie hôte culinaris
lectine protéine liant le mannose CD8 + lymphocytes matériel supplémentaire électronique
La version en ligne de cet article (doi:. 10 1186 /1472-6831-14-5) contient supplémentaire matériel, qui est disponible pour les utilisateurs autorisés.
Contexte
du greffon contre l'hôte (GVH) est une complication qui peut survenir après une greffe de moelle de cellules souches hématopoïétiques ou de l'os, que les cellules du donneur nouvellement transplantées attaquent la greffe le corps du receveur. GVHD est caractérisée par une inflammation épithéliale sélective qui affecte les organes cutanéo-muqueux, tractus gastro-intestinal et le foie [1]. Les deux études cliniques et expérimentales ont permis d'identifier la muqueuse buccale comme l'un des sites critiques touchés par GVDH [2, 3]. Des modifications histopathologiques dans GVHD cutanéo-muqueux comprennent satellitose, dans laquelle les lymphocytes forment des grappes autour de dyskératosique et /ou kératinocytes nécrotiques (KCS). Les lymphocytes, en particulier CD8 + cellules migrent de l'interstitium périvasculaire dans la couche épithéliale de recouvrement et d'induire des changements dégénératifs dans KCs, ce qui suggère que la détermination de la nature de la destruction KC peut aider à la compréhension de la pathogenèse de GVHD mucocutanée [4]. Pendant ce processus, l'expression de molécules spécifiques, telles que le CMH de classe II et la molécule d'adhésion intercellulaire-1 (ICAM-1), se produit dans l'épithélium KCs d'interagir avec des cellules effectrices [5-8]. En particulier, l'expression accrue de l'ICAM-1 sur KCs conduit à la migration des cellules effectrices dans l'épithélium de surface, qui est médiée en partie par la voie de l'ICAM-1 /fonction lymphocytaire antigène-1 associé (LFA-1) [3].
progrès récents dans glycobiology a révélé que glycoconjugués de surface cellulaire jouent un rôle essentiel dans les activités de reconnaissance. Les sondes lectines ont généralement été utilisés pour détecter les glycoconjugués de surface cellulaire, parce que les lectines sont définis comme étant des protéines de liaison d'hydrate de carbone autres que des enzymes ou des anticorps (Ab) [9]. Ils sont impliqués dans divers processus biologiques dans de nombreuses espèces, telles que la clairance de glycoprotéines du système circulatoire, l'adhérence des agents infectieux aux cellules hôtes, le recrutement de leucocytes vers les sites inflammatoires, et les interactions cellulaires dans le système immunitaire en conjonction avec les tumeurs malignes et les métastases [ ,,,0],9]. Lectine liant est modifiée au cours du processus de différenciation épithéliale et la stimulation des blessures de la peau et la muqueuse buccale [10-13]. Parmi les lectines, Lens culinaris
lectine (LCA), connu comme un mannose (Man) liant, possède des spécificités de liaison uniques, avec un noyau biantenné de 1,6-fucosylé oligosaccharides et glycanes de la transferrine sérique humaine et α-foetoprotéine [ ,,,0],14]. L'homme de surface cellulaire est également un ligand pour le mannose-binding protein (MBP), qui fonctionne à l'opsonisation des micro-organismes pour phagocytes et à médiation cellulaire activité de cytotoxicité antitumorale [14, 15]. Ces études ont conduit à l'hypothèse que des changements déterminants dans l'Homme expression KCS faciliter la compréhension de la pathogenèse de la muqueuse buccale GVH de. Notre approche de cette prémisse a été de se concentrer sur la surface cellulaire Man expression par KCs et son interaction avec la MBP chez le rat par voie orale GVHD muqueuse des rats. Notre étude avait trois objectifs: (1) pour déterminer la surface cellulaire Man expression par KCs utilisant LCA Man spécifique, (2) d'étudier si CD8 +, des cellules effectrices à l'oral GVHD de la muqueuse, la migration vers un contenant Man- moyen, et (3) pour déterminer si l'homme expression par KCs médie la liaison de MBP exprimant CD8 + cellules à KCs. Les résultats indiquent que, lors de l'élaboration des orale GVHD des muqueuses chez le rat, l'expression accrue de l'homme par KCs conduit à la migration et /ou l'adhérence des cellules CD8 + cellules dans l'épithélium de surface, médiée en partie par la MBP /Homme de liaison voie.
Méthodes
Adulte Fille rats consanguins Lewis (LEW, RT1 l) et Lewis × Brown Norway F 1 hybride (LBNF 1, RTL 1 /n) rats pesant 250 à 350 grammes ont été achetés auprès kyūdō Co. (Saga, Japon). Les études animales ont été menées conformément aux protocoles approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Comité de Fukuoka Dental College.
Induction de GVHD
Spleens retirés de rats LEW ont été disséqués dans une solution de Hanks, forcé à travers un tamis en acier inoxydable, et filtré à travers un filet de nylon (crépines cellulaires; BD Biosciences, CA, USA). Les cellules ont été lavées trois fois dans une solution de Hanks et remises en suspension à 10 8 /ml dans un milieu RPMI-1640 avec 10% de sérum de veau foetal. La viabilité des cellules a été déterminée par trypan bleu analyse d'exclusion. GVH est induite par une injection intra-péritonéale de 3 ml de 3 x 10 8 cellules dans LBNF 1 rats. LBNF non traitées 1 rats et LBNF 1 rats injectés avec un nombre égal de syngénique LBNF 1 splénocytes ont été utilisés comme témoins. Tous les rats ont été pesés quotidiennement et soigneusement observés pour des signes cliniques d'évaluation de la maladie.
De GVHD L'évaluation clinique de GVH a été déterminée par la perte de poids et le développement d'un érythème cutané ou des muqueuses, en particulier sur les oreilles, la muqueuse nasale, les pieds -Rembourrage, et les lèvres. Les deux conditions cliniques sont apparus le jour 10 après l'injection et sont devenus graves par la suite. Un essai de poids de la rate a été réalisée à l'autopsie pour confirmer l'évaluation immunologique de GVHD. 10 jours après, les rats expérimentaux ont montré une splénomégalie remarquable comme une surexpression de la réponse immunitaire liée GVHD [16]. Tous les animaux témoins ont survécu et semblaient en bonne santé.
Préparation des tissus
La langue entière a été excisée 1-21 jours après l'injection de cinq animaux dans chaque groupe de traitement. La moitié des spécimens de languette ont été fixées dans du paraformaldehyde à 4% dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Les sections de paraffine (4 pm) ont ensuite été colorées avec de l'hématoxyline et de l'éosine (H & amp; E) pour examiner les changements histopathologiques. L'autre moitié a été immédiatement congelé dans l'azote liquide, et des sections en série congelées ont été utilisés pour immunocoloration, lectine histochimie, et in vitro
tests d'adhésion lectine histochimie de.
LCA, Ulex europaeus
I (UEA- 1) et Archis hypogaea
(arachide: ANP) ont été utilisés pour la détection d'α-D-Man, α-L-fucose, et galactose β1,3galactosamine, respectivement (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA ). liaison LCA a été détectée en utilisant l'Alexa Fluor 568 - méthode de la biotine streptavidine marquée. coupes congelées Acétone-fixe ont été incubées avec LCA biotinylé (25 pg /ml; Vector Laboratories) pendant 30 min et Alexa Fluor streptavidine 568 marqué (1: 400; Molecular Probes, Eugene, OR, USA) pendant 30 min à température ambiante. contrôles histochimiques substitués LCA non conjugué pour le conjugué de l'ACV-biotine et réaction avec LCA biotinylé inactivé par son inhibiteur de sucre spécifique (D-mannose, 2 mM; Laboratoires EY, Inc., San Mateo, CA, USA)
immunohistochimie Abs utilisées dans cette étude sont les suivants: (a) un anticorps polyclonal de lapin Ab contre ALG11, réactif avec mannosyltransferase (1: 300; Novus Biologicals, Littleton, CO, USA), (b) un anticorps polyclonal de lapin Ab contre LMAN2, réactif avec PBM 2 (1: 100; Aviva Systems Biology, San Diego, CA, USA), (c) un anticorps monoclonal de souris Ab contre 1A29, réactif avec ICAM-1 (1: 100; Cederlane Lab, Ontario, Canada.), et ( d) un anticorps monoclonal de souris Ab contre OX-8, réactif avec CD8 (1:. 100; Cederlane Lab). les coupes congelées ont été fixés à l'acétone d'abord incubées avec du sérum de lapin normal pour diminuer la liaison non spécifique, puis on fait réagir avec l'un des Abs, pendant une nuit à 4 ° C. Les coupes ont été ensuite mises en incubation avec alcaline anti-lapin conjugué à la phosphatase ou Ab Ab anti-souris (1: 150 dilution, DakoCytomation, Tokyo, Japon) pendant 45 min à température ambiante. Les réactions immunohistochimiques ont été visualisés en utilisant du 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate /nitro solution de chlorure de tétrazolium (solution de BCIP /NBT, DakoCytomation). En tant que témoin, les sections ont été traitées avec de l'IgG de lapin normal au lieu de la première série de Abs.
Western blot
La protéine totale a été extrait de la rate et de la langue des spécimens dans les rats témoins ou GVHD en utilisant un tampon de lyse cellulaire glacée (20 m m de Tris-HCl, pH 7,5; 150 mMNaCl; 1 mM d'acide éthylènediaminetétra-acétique [EDTA], 1 mM de Na 2EDTA; 1 mM d'acide éthylèneglycol tétraacétique; 1% [v /v] de Triton-X 100, 2,5 mM de sodium pyrophosphate; 1 mMβ-glycérophosphate; 1 mM Na 3VO 4, et 1 pg /ml de leupeptine et de fluorure de phénylméthylsulfonyle). Des quantités égales de protéine (20 ug) ont été séparés par électrophorèse sur dodécylsulfate de sodium sur gel polyacrylamide (SDS-PAGE; 12% gel de séparation). Après électrophorèse, les protéines ont été transférées sur des membranes de difluorure de polyvinylidène (Bio-Rad Laboratories, Tokyo, Japon). Les transferts ont été bloqués avec 1% de caséine dans une solution saline tamponnée au Tris (TBS) contenant 0,1% de Tween-20 (TBS-T) pendant 1 h à température ambiante, puis incubées avec des anticorps primaires pendant une nuit à 4 ° C. Abs primaire contre LMAN2 (décrit plus haut) et de β-actine (Sigma-Aldrich) ont été utilisés. Les membranes ont été lavées dans du TBS-T et incubées avec du raifort secondaire marqué à la peroxydase Ab pendant 1 h à température ambiante. des complexes Ab liés ont été détectés par chimioluminescence amplifiée (Bio-RadLaboratories).
Isolement des cellules CD8 + à partir des rates de CD8 de GVHD à médiation par les rats + cellules de rats GVHD ont été utilisés dans les essais de migration Transwell et Stamper- Woodruff essais de liaison. Les lymphocytes ont été taquiné de la rate, présentant une splénomégalie, des rats de GVHD et en suspension dans un milieu RPMI-1640 à 4 ° C. Les cellules ont été dispersées par pipetage rapide de sortie, et les amas cellulaires ont été éliminés par passage à travers une maille de nylon (crépines cellulaires; BD Biosciences). La suspension de cellules isolées résultante a été lavée trois fois dans le même milieu et remis en suspension à une concentration de 3 x 10 7mononuclear cellules /ml. CD8 + cellules provenant de la suspension ont été isolés par purification sur billes magnétiques en utilisant des microbilles Miltenyi CD8a selon le protocole du fabricant (Miltenyi Biotec, Tokyo, Japon).
Transwell test de migration des cellules effectrices
migration des cellules CD8 + cellules de la GVHD-rate ont été évalués dans un système d'insertion de Transwell® dans lequel les puits supérieurs et inférieurs ont été séparés par une membrane de polycarbonate (taille des pores de 3 um, Corning, NY, USA). CD8 + cellules, pré-incubées ou non avec anti-MBP Ab (50 pg /ml), ont été ensemencées à une densité de 5 x 10 4 cellules /puits sur 3 um inserts Transwell. La chambre inférieure a été remplie avec 500 pi de milieu RPMI seul ou le milieu contenant Man (2 mM), mélange de l'homme et de l'ACV (50 pg /ml) ou du galactose (Gal, 2 mM EY Laboratories). Les cellules ont été incubées pendant 4 h à 37 ° C (5% de CO 2) puis colorées avec Diff-Quik (Sysmex Corp., Hyogo, Japon). l'activité de migration a été évaluée comme la migration pour cent des cellules de la chambre supérieure de l'insert Transwell à la chambre inférieure en trois champs de forte puissance (100x) par puits. L'expérience a été réalisée en triple.
Test Stamper-Woodruff liaison (SWBA)
-Woodruff type Stamper essais frozen-section ont été réalisées comme décrit précédemment [3]. En bref, des aliquotes contenant 2,5 x 10 5 CD8 + cellules isolées dans 200 pi de milieu RPMI-1640 ont été ajoutés à fraîchement coupé (8 pm) sections congelées de la langue obtenue à partir de rats dans les groupes de contrôle et de GVHD. Les sections ont été agitées sur un agitateur rotatif (60 rpm) pendant 60 min à température ambiante. Ensuite, la suspension cellulaire a été soigneusement décanté et les cellules adhérant aux sections ont été fixées avec 2,5% de glutaraldéhyde dans du PBS pendant 5 min. Les lames ont été ensuite lavées dans du PBS et colorées avec 0,5% de bleu de toluidine. Le nombre de CD8 + cellules adhérentes a été déterminé par l'examen de la microscopie optique des champs à 200 × grossissement (Chaque champ de forte puissance a représenté environ 400 um d'épithélium buccal). Le nombre de CD8 + cellules attachées directement sur KCs (mais pas dans la couche cornée) a été compté. Plusieurs expériences de blocage ont été effectuées comme suit: (a) les articles congelés de la langue de rats GVHD ont été incubées avec 25 pg /ml de LCA, PNA ou UEA-I pendant 30 min à température ambiante après un bref lavage avec du PBS, puis ajouté à lymphocytes; (B) CD8 + cellules ont été pré-incubées avec 50 ug /ml de MBP Ab pendant 30 min à température ambiante, avant que le mélange réactionnel entier a été transféré sur des sections congelées des languettes de GVHD; (C) les deux approches ont été utilisées simultanément, à savoir, CD8 + cellules ont été traitées avec de la MBP Ab et les coupes de tissu ont été traitées avec la MBP. Les résultats sont calculés en pourcentage de rapport pour contrôler les lymphocytes et les coupes de tissus exposés à la liaison tampon seul.
Analyse statistique L'analyse statistique
a été réalisée avec une analyse de variance (ANOVA) et des tests de comparaison multiple de Scheffe pour déterminer des statistiques les différences entre les échantillons. Les données sont présentées comme la moyenne ± écart-type (SD) et les valeurs P de de & lt; Résultats de 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives.
muqueuse orale GVHD est caractérisée par ICAM-1 expression et CD8 + T-cell infiltrats
Nous avons d'abord examiné si les caractéristiques immunohistochimiques peuvent être détectées dans la muqueuse buccale lors du développement de GVHD . En langues témoins non traités, aucun changement histologique n'a été observé chez H & amp; E coloration (figure 1a). ICAM-1 expression a été restreinte aux cellules endothéliales et périvasculaires des vaisseaux sanguins (figure 1c). Seuls quelques CD8 + cellules ont été observées dans la lamina propria et l'épithélium buccal (figure 1E). Les résultats étaient les mêmes dans les coupes de tissus prélevés chez des rats expérimentaux 8 jours après l'injection. Cependant, 10 jours après l'induction de la GVHD dans LBNF 1 rats, les changements à la fois histologiques et immunohistochimiques ont été observées dans les languettes. H & amp; E coloration a révélé des lésions typiques de GVHD mucocutaneous aiguë, ce qui indique la dégénérescence éosinophiles cytoplasmiques et une nécrose des cellules épithéliales KCs (le satellitose soi-disant) résultant de l'infiltration intra-épithéliale de lymphocytes (figure 1b). ICAM-1 expression a été observée dans la base de couches épineuses de l'épithélium (Figure 1d) et le nombre de CD8 + cellules a augmenté dans la lamina propria de la langue (figure 1f). En outre, ces cellules ont été infiltrés dans l'épithélium de surface dans laquelle KCs epitheliales ont été colorées avec un anticorps anti-ICAM-1 Ab. Figure 1 expression immunohistochimique de intercellulaire molécule-1 adhérence (ICAM-1) et CD8 + dans la réaction du greffon contre l'hôte (GVHD) muqueuse buccale concernant la PI. a et b: Aucun changement évidents sont observés dans l'hématoxyline et l'éosine (H & amp; E) -stained sections de contrôle de la langue (a). Dans des coupes de tissu provenant de rats de languette GVHD, la destruction de l'épithélium est observée (b). c et d: Dans la langue des spécimens de rats témoins, ICAM-1 est exprimé uniquement dans les fentes vasculaires (flèches) (c). Épithéliale ICAM-1 expression est observée dans la base des couches épineuses de la muqueuse buccale chez des rats GVHD (d). e et f: Seules quelques cellules CD8 + se trouvent dans la commande (e). Chez les rats GVHD, le nombre de cellules CD8 +, on observe une augmentation à la fois dans la lamina propria et la surface de l'épithélium (f). La ligne pointillée montre une jonction entre l'épithélium de surface et la lamina propria de la langue. Bar = 100 um
. Modifications dans la liaison LCA par voie orale muqueuse GVHD
Pour élucider si l'expression histochimique de l'homme à la surface cellulaire sur épithéliale KCs est affectée par le développement de GVHD, nous avons examiné LCA coloration dans les langues de contrôle et des rats GVHD. la liaison LCA a été limitée à la surface cellulaire de la base de parabasale KCs dans l'épithélium de surface des languettes de rats témoins (figure 2a). Le même schéma de coloration a été montré dans des coupes de tissus prélevés chez des rats expérimentaux huit jours après l'injection. En revanche, le niveau de coloration LCA étendue aux couches épineuses de l'épithélium de surface de 10 jours après l'injection, ce qui indique que les oligosaccharides sur KCs peuvent être modifiés pendant le développement de la GVH (figure 2b). En outre, le schéma d'extension de l'ACV coloration était identique à celui de l'expression d'ICAM-1. Figure 2 lectine de Lens culinaris (LCA) de liaison dans la maladie du greffon contre l'hôte (GVHD) de la muqueuse buccale. LCA de liaison se produit sur la surface cellulaire des cellules parabasales à base de languettes de contrôle (a). La coloration se prolonge sur les couches épineuses de l'épithélium de surface chez les rats GVHD (b). La ligne en pointillé blanc délimite la couche de la langue épithéliale de surface. Bar = 100 um.
Expression accrue du complexe mannosyltransferase dans la muqueuse buccale GVHD
Nous avons ensuite examiné l'expression immunohistochimique de complexe mannosyltransferase, en utilisant ALG11 Ab, en langues des deux rats témoins et GVHD, pour élucider si le mannosyltransferase pourrait être responsable de l'addition de l'homme sur les oligosaccharides dans KCs pendant le développement de GVHD. Dans la langue normale, ALG11 lié faiblement et /ou faiblement à basales et parabasales KCs de l'épithélium de surface (Figure 3a). des sites réactifs avec ALG11 étendus au cytoplasme de KCs dans les couches épineuses de l'épithélium de surface dans les pattes des rats GVH (figure 3b). La gamme réactif avec ALG11 semblait être identique à celui de LCA contraignant, ce qui suggère que l'expression accrue de mannosyltransferase dans les couches épithéliales peut être liée à une vaste liaison de LCA. Figure 3 de détection immunohistochimique de complexe mannosyltransferase dans greffon contre l'hôte (GVHD) muqueuse buccale affectés par le. ALG11, un anticorps (Ab) de complexe mannosyltransférase, est faiblement réactif et faiblement dans les cellules basales et parabasales de l'épithélium des languettes de contrôle (a). En revanche, la coloration avec ALG11 se prolonge vers les kératinocytes (KCS) dans les couches épineuses des languettes de rats GVHD (b). Bar = 100 um.
PBM /Man liaison CD8 + migration cellulaire voie induit in vitro
Pour élucider si la migration des CD8 + cellules est médiée par la voie MBP /Man liaison, nous avons examiné l'expression MBP dans les languettes des rats GVHD et la détermination de la migration transwell pour CD8 + cellules. Tout d'abord, nous avons examiné la détection immunohistochimique de la MBP dans des coupes de tissu de la langue de la GVHD chez le rat. MBP + infiltrant les cellules ont été observées à la fois dans la lamina propria et la surface supérieure de l'épithélium des languettes (figure 4a). Nous avons également examiné l'expression des protéines de MBP dans les langues et la rate de contrôle et de GVHD rats par analyse Western blot. Comme on le voit sur la figure 4b, la quantité d'accumulation de MBP a été augmenté de façon marquée à la fois la languette et la rate des rats GVHD. En revanche, l'expression de la protéine MBP était faible ou négative dans les deux la langue et la rate des rats témoins (figure 4b). Ces résultats suggèrent que la MBP peut être induite sur les cellules effectrices liées GVHD et la MBP sur les cellules effectrices peuvent réagir contre l'homme de surface cellulaire de KCs les langues des rats GVHD. Pour tester cette hypothèse, nous avons ensuite procédé à des dosages transwell de migration des cellules effectrices. Comme on le voit sur la figure 5, la migration pour cent des CD8 + cellules à l'homme a considérablement augmenté (77,9 ± 4,6) par rapport au témoin (1,7 ± 0,6). Le pour cent de la migration des CD8 + cellules est devenu plus faible dans la chambre inférieure contenant homme et LCA (8,3 ± 0,7) et Gal (1,5 ± 0,7). En outre, la migration de cellules CD8 + de cellules à l'homme a considérablement diminué (5,6 ± 0,4), lorsque les cellules ont été pré-incubées avec des anticorps anti-MBP Ab. Ces résultats indiquent que la migration des CD8 + cellules à l'homme est médiée par la voie MBP /Man contraignant. Figure 4 protéine de liaison au mannose (MBP) expression dans la langue et de la rate spécimens de greffon contre l'hôte (GVHD) rats. cellules infiltrant sont exprimées par immunohistochimie d'anticorps anti-MBP (Ab) (a). Analyse par Western blot des niveaux PBM de la langue et de la rate de rats témoins et de GVHD (b). Tant la langue et de la rate des rats GVHD médiée montrent la réaction remarquable avec PBM. β-actine (ACTB) a été analysé de manière similaire en tant que témoin de chargement. Bar = 100 um.
Figure 5 Induction de mannose (Man) à la migration des cellules CD8 +. la migration des cellules CD8 + a été examinée par le test de migration Transwell. Man, Man avec Lens culinaris
lectine (LCA), ou le galactose a été placé dans la chambre inférieure ainsi. Les puits de la chambre supérieure reçoivent CD8 + isolé de cellules, prétraitées ou non avec des anti-protéine liant le mannose (MBP) anticorps (Ab). RPMI a été utilisé comme témoin négatif. La figure représente les résultats de trois expériences différentes exprimées ± écart-type en tant que moyenne. Mêmes symboles montrent aucune différence statistiquement significative. D'autres, sensiblement différentes à P & lt;
0,05.
Anti-MBP Ab et LCA inhibent l'adhésion des cellules CD8 + à KCs dans des échantillons de langue de rats avec GVHD
Dans le modèle de GVHD de rat, les cellules effectrices peuvent se lier à lésionnelle KCs par la ICAM-1 /LFA-1 voie [3]. Nous avons effectué SWBA utilisant CD8 + cellules et /ou des cellules épithéliales orales prélevés chez des rats avec GVHD, de fournir la preuve d'un rôle direct de la voie MBP /Man liaison dans la liaison de CD8 + cellules épithéliales KCs . Prétraitement des coupes de tissus préparés à partir de la muqueuse buccale avec l'ANP et UEA-I n'a eu aucun effet, tandis que l'ACV a diminué l'adhérence des lymphocytes de 42,3% de la valeur témoin (figure 6). Lorsque des lymphocytes de rats atteints GVHD ont été incubées avec des anticorps anti-MBP Ab, l'adhérence des lymphocytes aux épithéliales KCs était de 42,7% de la valeur témoin (figure 6). Lorsque les deux approches ont été appliqués simultanément, à savoir, lorsque les lymphocytes ont été traités avec des anticorps anti-MBP Ab et les coupes de tissu ont été traités avec l'ACV, l'adhérence des lymphocytes a été abaissée à & lt; 40% de la valeur témoin (figure 6). Ces résultats indiquent que l'adhésion de CD8 + cellules épithéliales KCs est médiée en partie par la voie MBP /Man contraignant. Figure 6 Effet des lectines et des protéines anti-mannose liaison (PBM) anticorps (Ab) sur l'adhérence des cellules CD8 + à l'épithélium buccal en GVHD. Adhérence de cellules CD8 + aux kératinocytes orales (KCS) ont été étudiés par Stamper-Woodruff essai (SWBA) de liaison. La liaison des cellules CD8 + était significativement diminué lorsque les cellules ont été prétraitées avec des anticorps anti-MBP Ab, ainsi que lorsque les épithéliums ont été prétraités avec de la lectine Lens culinaris
(LCA). La figure représente les résultats de trois expériences différentes et exprimés en moyenne ± écart-type. Mêmes symboles montrent aucune différence statistiquement significative. D'autres, sensiblement différentes à P & lt;
0,05. Discussion de la
Dans cette étude, nous utilisons la haploidentical allogénique F 1 modèle de rat hybride pour élucider le rôle de l'expression de surface cellulaire de résidus Man par KCs à GVHD. Bien que ce modèle ne représente pas directement la transplantation de cellules hématopoïétiques clinique chez l'homme, il offre un système pratique et génétiquement bien défini à partir de laquelle pour mieux comprendre les mécanismes sous-jacents des dommages tissulaires à médiation immunologique du tissu épithélial de l'hôte par l'étude in vivo
les interactions entre les lymphocytes et KCs [17]. Nous présentons trois lignes de preuve pour étayer la conclusion que l'expression de surface cellulaire de l'homme par KCs joue un rôle dans la migration et /ou l'adhésion des CD8 + cellules de l'épithélium au cours du développement de GVHD. Tout d'abord, une approche histochimique de lectine a confirmé que l'expression de surface cellulaire de l'homme par KCs a été régulée à la hausse dans le développement de GVHD. Deuxièmement, l'expression des protéines et les résultats de la migration Transwell ont indiqué que la migration CD8 + cellulaire à l'homme a été liée à une interaction entre la MBP et Man. En troisième lieu, CD8 + adhésion cellulaire de l'épithélium de la surface de la muqueuse était médié par la voie de la MBP /Homme de liaison tel que révélé à l'aide SWBA.
Une régulation positive de la liaison LCA sur la surface cellulaire de KCs indique que le Cell- l'expression de surface de l'homme est modifiée au cours du développement de GVHD par voie orale de la muqueuse. Dans la GVHD mucocutanée, des modifications moléculaires spécifiques se produisent dans KCs pour permettre la migration des lymphocytes dans la couche épithéliale de la surface [7, 8, 18]. Une étude antérieure a indiqué que l'induction d'ICAM-1 expression KCs conduit à la migration des cellules CD8 + cellules dans l'épithélium et que ce processus est médiée en partie par l'ICAM-1 /LFA-1 voie [3] . Les résultats présentés ici fournissent un soutien supplémentaire aux changements moléculaires dans KCs au cours du développement de GVHD orale de mucsal. L'étude immunohistochimique des anti-ALG11 Ab rapporté ici montre que les sites réactifs Ab étendre également aux couches épineuses dans l'épithélium de surface dans la langue de GVHD. ALG11 est connu comme l'alpha-1,2-mannosyltransférase dans glycoprotéine N-liée et est localisé du côté cytosolique du réticulum endoplasmique dans les cellules basales de l'épithélium pavimenteux normal [19]. Ces résultats suggèrent que l'expression étendue de complexe mannosyltransferase peut être indirectement responsable de la régulation positive de Man expression sur la surface cellulaire de KCs dans la langue de GVHD. Les travaux à venir expliquer pourquoi l'expression de mannosyltransferase complexe et Man développer pendant le développement de GVHD.
blot immunohistochimique et Western analyses présentées ici montrent que les cellules effectrices de GVHD montrent l'expression de MBP en utilisant LMAN2 Ab, en plus de CD8. MBP, également appelée protéine de liaison au mannane ou lectine de liaison au mannane, est un Ca2 + - dépendante lectine (type C) animale [20-22]. Une étude récente a révélé que cette protéine pourrait afficher un effet spécifique sur l'activation des lymphocytes T [23]. MBP se lie préférentiellement aux glucides terminés par l'homme, la N-acétylglucosamine, ou fucose [24]. Par conséquent, les lymphocytes MBP exprimant semblent interagir avec KCs Man exprimant à l'oral GVHD de la muqueuse. Les résultats de l'essai de migration Transwell indiquent que la migration de la protéine MBP-exprimant CD8 + cellules est accéléré par un milieu contenant de l'Homme. CD8 migration + cellulaire a été inhibée par un mélange de l'homme et de l'ACV et le prétraitement des cellules avec LMAN2 Ab, ce qui indique que la MBP CD8 + cellules ont reconnu l'homme en particulier. Ces résultats suggèrent que la migration des cellules effectrices CD8 + lymphocytes, à l'homme exprimant KCs peut être médiée par une interaction entre la MBP et l'Homme.
CD8 + adhésion cellulaire à l'épithélium coloré avec Man- LCA spécifique a été démontrée en utilisant SWBA. Ainsi, la liaison de CD8 + cellules de l'épithélium de surface au cours du développement de GVHD augmente avec l'homme et l'expression est en corrélation avec la progression de la maladie. Ces résultats sont cohérents avec les observations in vivo
de KCs exprimant spécifiques Man LCA à adhérer à CD8 + cellules au cours de la progression de la GVHD. Dans un processus d'adhésion, la PBM sur CD8 + cellules joue un rôle important en tant que facteur d'adhésif de Man exprimant KCs lors du développement de GVHD. En outre, les résultats de l'ACV et les expériences Ab-bloquants ont soutenu l'idée que les interactions MBP /Man représentent la liaison de CD8 + cellules. Ainsi, LMAN2 Ab, LCA, ou LMAN2 Ab avec LCA, bloquant tous les CD8 + cellule liaison par rapport à lecitns reconnaissant les résidus de Man indépendants. Notre étude précédente a révélé que l'induction d'ICAM-1 expression sur KCs conduit à l'adhésion de CD8 + cellules à l'épithélium de surface et que cela a été médiée en partie par l'ICAM-1 /LFA-1 voie [3]. Les interactions /Man MBP présentés ici appartiennent à une autre voie d'adhésif pour la migration et l'adhérence des cellules effectrices de l'épithélium de surface pendant le développement de la voie orale GVHD muqueuse.
En résumé, ces résultats définissent le rôle de l'homme expression KCs pendant la développement de GVHD comme induisant la migration des PBM exprimant CD8 + cellules dans l'épithélium buccal où ils adhèrent à KCs. La surexpression de Man expression sur KCs est sans aucun doute une étape clé dans la pathogenèse de la GVHD orale de la muqueuse.
Conclusion
Une augmentation de l'expression de l'homme sur KCs conduit à la migration et /ou l'adhésion des CD8 + cellules l'épithélium de surface, ce qui est médiée en partie par la voie MBP /Man lors du développement de GVHD orale muqueuse
abréviations
ACTB:.
β-actine
Ab:
Antibody
GVHD:
la maladie du greffon contre l'hôte
H & amp; E:
