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mucines MUC5B surface associée à promouvoir l'activité de la protéase dans Lactobacillus fermentum biofilms

 

Résumé de l'arrière-plan
surfaces muqueuses sont revêtues avec des couches de gel de mucus qui protègent les tissus sous-jacents et favorisent la colonisation par les membres de la microflore commensale. Lactobacillus fermentum
est un habitant commun de la cavité buccale, gastro-intestinales et de reproduction et est l'une des plus importantes de bactéries d'acide lactique qui contribuent à la formation d'une microflore intestinale saine. Nous avons étudié l'activité protéolytique dans L. fermentum
en réponse aux interactions avec le MUC5B mucine, qui est une composante majeure de gels de mucus dans les sites colonisés par ce micro-organisme
. Méthodes de biofilms de Lactobacillus fermentum
ont été établis dans les cellules mini-flux en présence ou en absence de salive humaine MUC5B. L'activité protéolytique des cellules du biofilm a été examinée au microscope confocal à balayage laser avec un substrat de protéase fluorescente. La dégradation des MUC5B par L. fermentum
a été analysé par SDS-PAGE suivie par transfert de Western avec des antiserums dirigés contre le peptide MUC5B. protéines de surface cellulaire differentialy exprimées dans un environnement MUC5B riches ont été identifiés à l'aide d'une électrophorèse comparative à deux dimensions suivie par LC-MS /MS.
Résultats de Lactobacillus fermentum de
adhère bien aux surfaces revêtues MUC5B mucine et dans les biofilms de L. fermentum
formées dans un environnement MUC5B, la proportion de cellules protéolytiquement actives (47 ± 0,6% de la population), comme le montre le clivage d'un substrat de caséine fluorescent, était significativement plus élevée (p & lt; 0,01 ) que dans les biofilms formés dans un bouillon nutritif (0,4 ± 0,04% de la population). Ainsi, la présence de mucines MUC5B une activité accrue de protéase bactérienne. Cet effet a été principalement attribuable au contact avec les mucines associées à la surface plutôt que ceux qui sont présents dans la phase fluide. Comparaison des biofilms de L. fermentum
étaient capables de dégrader les mucines MUC5B suggérant que cette glycoprotéine complexe peut être exploitée en tant que source d'éléments nutritifs par la bactérie. Des protéomes de surface des cellules de L. fermentum biofilm dans un
MUC5B environnement avec celles dans un bouillon nutritif par électrophorèse bidimensionnelle et spectrométrie de masse a montré que l'activité protéolytique accrue est associée à une augmentation de l'expression d'une glycoprotéase; O
sialoglycoprotéine endopeptidase, ainsi que des protéines chaperonnes telles que DnaK et le facteur de déclenchement. Le plus d'adhérence à la mucine revêtu les surfaces des conclusions conduit à un déplacement vers un phénotype plus une protéase active au sein de L. fermentum
biofilms et les protéases produites dans les biofilms peuvent dégrader mucines MUC5B. L'activité protéolytique accrue est associée à une augmentation de l'endopeptidase sialoglycoprotéine de O à la surface cellulaire. Nous proposons que la régulation positive des protéines chaperonnes dans l'environnement de mucine peut contribuer au phénotype de protease active à travers l'activation de la glycopeptidase. Cela représenterait une façon pour commensal lactobacilles par exemple L. fermentum
pour exploiter des substrats complexes dans leur environnement local afin de survivre sur des surfaces muqueuses
Mots-clés
lactobacilles protéolytique activité protéolyse Mucus glycoprotéine électronique matériel supplémentaire
La version en ligne de cet article (doi.: 10. 1186 /1472-6831-13-43) contient du matériel supplémentaire, qui est disponible pour les utilisateurs autorisés.
Contexte
surfaces muqueuses du corps sont colonisés par un grand nombre d'espèces bactériennes commensales qui coexistent dans une relation de mutualisme avec leur hôte humain. Ces communautés microbiennes, ou biofilms, sont censés constituer la première ligne de défense contre l'infection par la concurrence inhibant les organismes non-autochtones qui peuvent causer des maladies. Dans l'intestin, la flore commensale a été proposé d'avoir une influence importante sur le développement, l'immunité et de la nutrition (pour avis voir [1-3]). En dépit de leur importance, étonnamment peu est connu sur la façon dont les membres de ces communautés de survivre dans l'environnement de la muqueuse et interagissent les uns avec les autres, et l'hôte, pour former un écosystème dynamique. Lactobacillus
représente le groupe le plus nombreux et diversifiés parmi les bactéries lactiques qui peuplent la surface des muqueuses chez l'homme, y compris le tractus gastro-intestinal [4], de l'appareil reproducteur féminin [5] et de la cavité buccale [6]. Les lactobacilles sont généralement considérés comme conférant des effets biologiques bénéfiques pour l'hôte. Par exemple, dans le tractus gastro-intestinal, les lactobacilles promouvoir la stimulation et le renforcement de la défense des muqueuses [7] immunitaire. Parmi les lactobacilles, Lactobacillus fermentum
est un habitant courant du tractus gastro-intestinal [8], y compris la cavité orale [9, 10]. Contrairement au rôle bénéfique dans l'intestin, des lactobacilles dans la cavité buccale sont souvent associés à la maladie carieuse [6] et Lactobacillus fermentum
est souvent isolé de caries dentinaires lésions chez les enfants, ce qui implique un rôle dans le processus de la carie [11] les surfaces muqueuses de. sont protégés par une couche de gel de mucus provenant de cellules mucine produisant dans les épithéliums sous-jacentes. des gels de glaire sont composées de grandes glycoprotéines, des polymères formant un gel appartenant à la famille des protéines de mucine et les espèces de mucine comprenant ces gels sur différentes surfaces muqueuses peuvent varier. Par exemple, MUC5B est une mucine prédominante dans la cavité buccale, de l'appareil génital féminin et les voies respiratoires [12] tandis que MUC5AC, MUC6 et MUC2 se trouvent à différents endroits à travers le tractus gastro-intestinal [13]. Les grandes mucines polymères sont constitués de sous-unités liées par des liaisons disulfures, et au sein de chaque sous-unités étendues de nu protéine épine dorsale alternent avec des régions fortement glycosylée contenant un grand nombre de chaînes latérales oligosaccharidiques [14]. lactobacilles se lient aux deux mucines gastriques et intestinaux [15] et une protéine de liaison à la mucine (32 Mmubp), qui est un composant du système de transporteur ABC, a été identifié chez L. fermentum
[16]. Les interactions avec les mucines permettent très probablement lactobacilles à retenir dans la couche de mucus où ils contribuent à la formation de biofilms multi-espèces.
Actuellement, les mécanismes de régulation de la survie et la croissance des lactobacilles sur les surfaces muqueuses sont en grande partie non résolue. Cependant, étant donné que les bactéries lactiques ne sont en mesure de prendre des peptides courts via les systèmes de transport, qui sont spécifiques pour les oligopeptides (Opp) et di-tripeptides (dtpT) [17], la croissance et la survie dans les biofilms dans les environnements de mucus sera très probablement dépendre la capacité des bactéries à dégrader des substrats complexes tels que les mucines. La capacité des bactéries à utiliser mucines comme seule source d'éléments nutritifs a été démontrée pour Akkermansia muciniphilia
qui a été isolé à partir d'un échantillon fécal d'un adulte en bonne santé [18]. Des études de bio-informatique révèle que le génome de L. fermentum
souche 28-3-CHN code pour au moins 10 proteases. Parmi ceux-ci, plusieurs sont prévus pour être extracellulaire et ont donc le potentiel de jouer un rôle dans la production de nutriments de mucines sur les surfaces muqueuses. Dans la présente étude, nous étudions la façon dont l'activité protéolytique dans les biofilms de L. fermentum
est lié à l'environnement entourant les bactéries; un environnement riche mucine ou un milieu de bouillon nutritif riche en protéines, ainsi que si de grandes mucines de formation de gel peuvent être dégradés par L. fermentum
comme une source potentielle de substances nutritives. En outre, les changements dans l'expression de protéine de surface cellulaire associée à l'amélioration de l'activité protéolytique ont été examinés.
Méthodes
Souche bactérienne
Afin d'étudier les interactions naturelles entre MUC5B et Lactobacillus fermentum,
une clinique souche connue pour être en mesure de survivre et de se développer dans un environnement de mucus riche a été isolé à partir de la plaque dentaire. La souche, qui provient de la plaque supra-gingival proximal d'une bonne santé de 30 ans de sexe masculin,
a été identifié par une croissance sélective en moyenne et de fermentation des tests Rogosa utilisant le système API-50 CHL (BioMerieux, Marcy l'Etoile, France ). Identification comme L. fermentum
a été confirmée par le séquençage du gène de la pheS [19]. Les bactéries ont été stockés à -80 ° Cand sous-cultivées deux fois sur gélose au sang dans une atmosphère de 5% de CO 2 dans l'air à 37 ° C pendant 48 heures avant utilisation.
Isolement de salive humaine MUC5B Humaine salivaire mucine MUC5B a été isolé comme décrit précédemment [20]. Le total de la salive a été recueillie sur la glace de huit volontaires, mis en commun et ensuite mélangé avec un volume égal de 0,2 M de NaCl et on a agité pendant une nuit à 4 ° C. Après centrifugation douce (4400 g pendant 30 min à 4 ° C), le surnageant a été soumis à isopycnique une centrifugation à gradient de densité de CsCl /0,1 M de NaCl (Beckman Optima LE-80 K, le rotor 50.2Ti, 36 000 tpm, 96 h, 15 ° C, commencer la densité de 1,45 g /ml; Beckman, Fullerton, CA, USA) et 22 fractions ont été recueillies. Les fractions contenant MUC5B ont été réunies, dialysées contre du PBS (0,15 M de NaCl, 5 mM de NaH 2PO 4, pH 7) et stockés à -20 ° C jusqu'à utilisation. Pour déterminer la concentration de MUC5B, des aliquotes des fractions contenant MUC5B ont été réunies, dialysées contre de l'eau, lyophilisé et pesé (0,3 mg ml -1). Le bassin de MUC5B a été soumis à dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide électrophorèse sur gel (SDS-PAGE) pour déterminer si les protéines de faible poids moléculaire associé au réseau du gel contaminé à la préparation.
Formation d'un biofilm
L. fermentum de colonies de gélose au sang ont été suspendues dans un bouillon nutritif [bouillon de Todd-Hewitt (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA)] ou dans une solution MUC5B dans du PBS pour donner OD 600 valeurs de 0,4 ± 0,01 (correspondant à environ 1 × 10 6 cellules ml -1). Les biofilms ont été établis dans la cellule mini-flux Ibidi u-slides (Diagnostics intégrés Bio, Martinsried, Allemagne) en inoculant 120 pi de la suspension dans les canaux et l'incubation dans humidifié à 5% de CO 2 dans l'air à 37 ° C pendant 24 heures. Les canaux sont ensuite rincées avec du PBS pour éliminer les cellules non-adhérentes. Dans certains cas, les lames ont été pré-conditionnée avec 100 ul de MUC5B + 10 ul de 10 mM de CaCl 2 humidifiée pendant une nuit à 5% de CO 2 dans l'air à 37 ° C pour obtenir un revêtement MUC5B. Les lames ont été rincées avec du PBS avant la formation de biofilm. La formation du biofilm a été confirmée par coloration avec le BacLight ™, LIVE /kit DEAD (Molecular Probes Inc., OR, USA) et la visualisation en utilisant un Nikon Eclipse TE2000 inversée microscope confocal à balayage laser (CSLM).
activité protéolytique
Pour étudier l'activité protéolytique des cellules planctoniques, les cellules de L. fermentum ont été examinées avec le fluorescent kit de dosage de protease QuantiCleave ™ (Pierce, Rockford, IL, USA) comme décrit précédemment [21]. En bref, les cellules ont été mises en incubation pendant 1 heure à 37 ° C avec le substrat marqué au FITC de la caséine à une concentration de 10 ug ml -1 dans du Tris 25 mM avec NaCl 150 mM et ajusté à pH 7,2. Aliquotes ont ensuite été introduits dans un mini-flux de cellules Ibidi u-slides et de contraste avec la fluorescence rouge SYTO62® ADN-coloration colorant (Molecular Probes Inc., OR, USA) pendant 10 minutes à température ambiante. Pour les cellules de biofilm, le substrat fluorescent et contre-coloration ont été introduits directement dans les cellules de mini-flux dans lequel les biofilms sont en croissance. Les cellules ont ensuite été visualisées en utilisant CSLM et 20 images aléatoires à partir de chaque lame de biofilm ont été capturées en utilisant une station motorisée reliée au logiciel Nikon du microscope. Chaque image contient plus de 1000 cellules bactériennes et la proportion de globules rouges et verts pour chaque lame de biofilm, ce qui correspond à approximativement 20 000 cellules ont été analysées en utilisant le bio progiciel
Image_L [22]. Les expériences ont été répétées trois fois et la valeur moyenne pour le pourcentage de cellules actifs protéolytiquement a été calculée. Les résultats ont ensuite été analysés en outre l'utilisation de test et les valeurs p de Mann-Whitney U de moins de 5% ont été considérés comme significatifs.
Analyse de la dégradation des MUC5B par les biofilms de L. fermentum
Mini accréditive chambres ont été pré-conditionnés avec des cellules MUC5B et L. fermentum
puis inoculées dans un bouillon nutritif. Au bout de 24 heures, le milieu a été retiré et les mucines MUC5B en suspension dans du PBS ont été ajoutés dans le biofilm pendant un temps supplémentaire de 24 heures. Après ce temps, le fluide contenu dans le flux de cellules a été recueilli avec une pipette et on le centrifuge pour éliminer les cellules bactériennes (10 000 g, 5 min, 4 ° C). Le surnageant contenant de la mucine, ainsi qu'une commande (mucines MUC5B mis en incubation pendant 24 heures à 37 ° C, mais pas exposés à L. fermentum
) a été analysé par SDS-PAGE dans des conditions suivies par Western Blot dénaturant. Des échantillons (15 ul du surnageant) ont été mélangés avec 5 pi de tampon d'échantillon NuPAGE LDS (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) et fonctionnent sur NuPAGE 4-12% BisTris gels (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) à 180 V pour 1 heure. Les gels ont été électro-transférées sur des membranes de PVDF (Millipore, Immobilon-P, 0,45 mm, Bedford, MA, USA) pendant la nuit en utilisant une cellule de transfert Mini Trans-blot électrophorétique (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) et les membranes puis bloqué avec 5% (p /v) de lait en poudre dans du TBST (Tris 20 mM, NaCl 137 mM, 0,05% de Tween 20) pendant 1 heure. MUC5B mucines ont été détectés en utilisant un antisérum (LUM5B-14), élevé contre un peptide synthétique ayant la séquence CRAENYPEVSIDQVGQVL présente dans le troisième domaine Cys du peptide MUC5B, dilué 1: 1000 dans 5% de BSA /TBST. Les membranes ont ensuite été incubées (1 heure) avec un anticorps de chèvre anti-lapin conjugué à la peroxydase de raifort (Dako, p0448, Glostrup, Danemark) dilué à 1: 2500 dans 5% de lait écrémé /TBST, et les bandes ont été visualisées en utilisant la détection ECL Western 2DE de kit (Pierce, Rockford, IL, USA)., LC-MS /MS et Western blot de protéines de surface cellulaire
La phase en vrac entourant les cellules biofilm qui poussent dans un MUC5B- ou un environnement Frère nutriment, était retiré avec une pipette à partir des cellules d'écoulement et remplacé par 50 ul de tampon d'extraction constitué de 5 M d'urée, thiourée 2 M, 2% de CHAPS, 2% caprylyle sulfobétaïne, 2 mM tributyl phosphine, 0,5 à 2% IPG et 40 mM de Tris la base ajusté à pH 9,5. Afin de solubiliser les protéines de surface des cellules de biofilm restantes, les cellules ont été incubées avec écoulement sous agitation pendant 1 heure à la température ambiante et le tampon d'extraction, puis retirée et centrifugée pendant 10 minutes (6000 g
). Les concentrations de protéines dans les surnageants résultants ont été déterminées en utilisant un kit 2D Quant (GE Healthcare Life Sciences, Little Chalfont, Royaume-Uni). Les surnageants ont ensuite été dilués avec du tampon de réhydratation contenant 8 M d'urée, 2% de CHAPS, 10 mM de DTT, 2% Immobiline (IPG) de mémoire tampon (GE Healthcare Life Sciences, Little Chalfont, Royaume-Uni) pour donner une concentration finale en protéine de 20 pg à 200 ul. Ces échantillons ont été placés dans des cassettes re-gonflement avec 11 cm bandes IPG, la gamme de pH 4-7, en haut et réhydratation a été effectuée dans l'huile à la température ambiante pendant 30 heures. isoélectrofocalisation a été réalisée essentiellement comme décrit par Davies et al.
[23], en utilisant la Multiphor II (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, RU) pendant 85 heures, à 500 volts. Les bandes ont été équilibrées et intégrées au-dessus de 14% de gels de polyacrylamide. SDS-PAGE a été réalisée à un courant constant de 15 mA /gel, 10 ° C, pendant la nuit dans une cellule PROTEAN II xi (Bio-Rad, Hercules, CA) avec haut de gamme arc standards de poids moléculaire (GE Healthcare Vie Sciences, Little Chalfont, Royaume-Uni) sur le côté acide des bandes IPG. Les gels ont été colorés avec de l'argent conformément aux instructions ou colloïdales du produit bleu brillant de Coomassie G pour l'identification des protéines. Gels ont été analysées en utilisant le logiciel Delta2D (Decodon GmbH, Greifswald, Allemagne). Après l'identification des limites de la place, les valeurs de densité optique intégrée (IOD) ont été déterminées et exprimées en pourcentage de l'intensité totale par gel. Taches montrant une différence de plus de trois fois ont été découpées à partir des gels colorés au bleu de Coomassie, soumis au gel digestion tryptique et analysé par LC-MS /MS comme décrit [23]. Pour la détection de endopeptidase sialoglycoprotéine de O-, gels 2DE étaient électro-transférés sur des membranes de PVDF (Millipore, Immobilon-P, 0,45 mm, Bedford, MA, USA) pendant la nuit en utilisant une cellule de transfert Mini Trans-blot électrophorétique (Bio-Rad , Hercules, CA, USA) et les membranes, puis bloquées avec 5% (p /v) de lait en poudre dans du TBST (Tris 20 mM, NaCl 137 mM, 0,05% de Tween 20) pendant 1 heure. La protéine a été détectée en utilisant un antisérum polyclonal MOB-LFGE-2 dirigé contre un peptide synthétique avec la séquence (CDAAGEAYDKVGRV) (Innovagen AB, Lund, Suède), dilué 1: 1000 dans 5% de BSA /TBST. Les membranes ont ensuite été incubées (1 heure) avec un anticorps de chèvre anti-lapin conjugué à la peroxydase de raifort et les bandes ont été visualisées en utilisant le kit de détection ECL Western comme décrit ci-dessus.
Résultats Comparaison de l'activité protéolytique dans les cellules planctoniques et du biofilm de L. fermentum
pour étudier l'effet de MUC5B sur l'activité protéolytique dans les cellules planctoniques de L. fermentum
, les cellules ont été exposées à MUC5B dans la phase fluide. bouillon nutritif a été utilisé comme témoin. La proportion de cellules protéolytiquement actives a été évaluée à l'aide CLSM après incubation avec de la FITC-caséine. Cette étude a révélé aucune différence entre la proportion de cellules protéolytiquement actives dans un bouillon nutritif à ceux mucines MUC5B en suspension dans du PBS, et dans les deux cas, l'activité de la population était inférieure à 4% (figure 1). Aucune différence dans le niveau d'activité de la population de cellules en suspension dans du PBS dans mucines MUC5B et mis en suspension dans du PBS seul (témoin) a été observée (données non présentées). Afin de comparer l'activité protéolytique des cellules planctoniques avec celle des cellules de biofilm de L. fermentum,
bactéries ont été autorisés à former des biofilms dans des conditions statiques dans un système de chambre de mini-débit pendant 24 heures dans un milieu MUC5B (sur des surfaces recouvertes de MUC5B et MUC5B dans la phase liquide) ou un milieu de bouillon nutritif. La proportion de cellules protéolytiquement actives dans les biofilms dans l'environnement MUC5B était dix fois plus élevé (47 ± 0,6%) que celle de leurs homologues planctoniques (figure 1b) alors que cette augmentation a été observée dans les biofilms formés en présence de bouillon nutritif. L'imagerie du biofilm a montré que les cellules de L. fermentum respecter à la fois la non revêtue et que les surfaces revêtues MUC5B et les biofilms formés (figure 2). Dans l'environnement MUC5B, les cellules protéolytiquement actives ont été uniformément répartis dans le biofilm (Figure 2a) tandis que l'activité dans le milieu de bouillon nutritif était faible (figure 2b). Ces données indiquent que l'activité protéolytique est augmentée dans les cellules du biofilm de L. fermentum
dans un environnement riche mucine. L'effet n'a pas été observé lorsque les cellules de L. fermentum planctoniques sont exposés aux mêmes mucines dans la phase liquide ou en présence d'un bouillon nutritif. Figure 1 Proportion de cellules Lactobacillus fermentum protéolytiquement actives dans planctoniques et biofilm culture. Des graphiques montrant le pourcentage de cellules dans les populations actifs protéolytiquement de (a) planctoniques ou (b) des cellules de biofilm de L. fermentum
dans un bouillon-milieu nutritif ou MUC5B- comme révélé à l'aide d'un substrat fluorescent combiné à CSLM. Les barres représentent la valeur moyenne de trois expériences indépendantes ± erreur type (** p & lt; 0,01).
Figure 2 Les activités protéolytiques des populations de biofilm Lactobacillus fermentum en présence ou en l'absence de mucines MUC5B. images CSLM montrant des cellules de biofilm qui poussent dans (a) la présence d'un environnement MUC5B ou (b) un milieu de bouillon nutritif. L'activité protéolytique a été visualisée par incubation avec un substrat de caséine conjuguée à FITC (vert) pendant 1 heure. Les cellules ont ensuite été contre-colorées à l'aide Syto 24 (rouge). La barre représente 20 um et les inserts montrent des agrandissements quadruples des principales micrographies.
L'activité protéolytique dans les cellules de biofilms de L. fermentum
est influencée par la surface associée MUC5B
Pour déterminer si l'amélioration de la protéolytique activité dans la population de biofilm de la L. fermentum dans l'environnement MUC5B était principalement attribuable aux mucines associées à la surface ou ceux de la phase en vrac, les effets de ceux-ci ont été étudiés séparément. Biofilms de L. fermentum
ont donc été soit établies sur des surfaces MUC5B revêtues avec un bouillon nutritif dans la phase fluide, ou sur des surfaces non revêtues avec MUC5B dans la phase fluide. En présence d'MUC5B de surface associée, analyse d'image a révélé que 13 ± 3% de la population est protéolytiquement active (figure 3), tandis que dans les cellules exposées à MUC5B dans la phase fluide unique, l'activité est très faible (0,3 ± 0,02%). Ainsi, ces données montrent que la présence de mucine sur la surface est important pour l'amélioration de l'activité protéolytique. Toutefois, la proportion de cellules actives sur les mucines associées à la surface seule était significativement inférieure à celle observée dans l'environnement MUC5B, où les mucines étaient également présents dans la phase brute. Ceci suggère que l'adhérence à la surface MUC5B associée peut avoir «apprêté» les cellules en leur permettant de réagir à la présence de MUC5B dans la phase fluide. Figure 3 activités protéolytiques des populations biofilm Lactobacillus fermentum en présence de (a) (b) phase fluide mucines MUC5B surface associée ou. CSLM images montrant des cellules en croissance biofilm en (a) la présence d'un agent tensio-couche de mucine MUC5B ou (b) en présence de mucines MUC5B dans la phase fluide. L'activité protéolytique a été visualisée par incubation avec un substrat de caséine conjuguée à FITC (vert) pendant 1 heure. Les cellules ont ensuite été contre-colorées à l'aide Syto 24 (rouge). La barre représente 20 um et les inserts montrent des agrandissements quadruples des principales micrographies.
Dégradation de MUC5B par L. fermentum
Pour déterminer si mucines dans l'environnement de mucine riches sont dégradés par les protéases produites au sein des biofilms de L. fermentum, MUC5B mucines qui avaient été en contact avec le biofilm pendant 24 heures ont été soumises à une SDS-PAGE suivie par transfert de Western avec un antisérum anti MUC5B (figure 4). mucines de contrôle, qui n'a pas été en contact avec des bactéries, ont été visualisées en une seule bande sur le dessus du gel montrant qu'ils étaient de haute masse moléculaire (& gt; 300 kDa). Cependant, lorsque les mucines ont été mises en incubation avec L. fermentum
biofilms, une bande supplémentaire est apparu dans la région supérieure du gel à gradient de 4 à 12% indiquant qu'une partie des mucines a subi une certaine dégradation qui a permis MUC5B de migrer dans le gel. Ainsi, ces données confirment que les populations de biofilm protéolytiquement actives de L. fermentum
peuvent dégrader MUC5B. Figure 4 Dégradation du polypeptide squelette MUC5B par des protéases de biofilms de L. fermentum. Un échantillon de MUC5B (a) et MUC5B contrôle qui avait été en contact avec les cellules pendant 24 heures biofilm (b) ont été soumis à SDS-PAGE sur des gels de 4-12%. Après que l'électro-transfert sur des membranes de PVDF, MUC5B a été détectée en utilisant l'antisérum LUM5B-14. Le fond du puits est indiqué
. L'expression des protéines de surface dans le
de L. fermentum Depuis mucines MUC5B ont été dégradés par les cellules de biofilms de L. fermentum
, la base de données du génome a été scannée pour les protéases capables de glycoprotéines dégradantes. En utilisant cette approche, une protéase, O-
sialoglycoprotéine endopeptidase, avec un poids moléculaire d'environ 35 kDa, a été choisi comme un candidat possible. Western blot des gels 2DE de protéines de surface de cellules de biofilm L. fermentum de avec un antisérum polyclonal dirigé contre un peptide dans la séquence de l'glycopeptidase identifié une tache à 32 kDa, correspondant à O-
endopeptidase sialoglycoprotéine (voir Figure 5a). Afin de déterminer si cette protéine a été exprimée de manière différentielle sur la surface de L. fermentum de cellules de biofilms dans les différents milieux, les protéines de surface des cellules de biofilm dans un environnement MUC5B ont été comparés à ceux de cellules dans un bouillon milieu nutritif à l'aide 2D- électrophorèse sur gel. L'analyse des images de gels colorés à l'argent a montré que l'expression de la O-endopeptidase de sialoglycoprotéine a été améliorée de 2,7 fois, en présence d'MUC5B, comparativement à un bouillon nutritif. En outre, un certain nombre de points dans la gamme 52-76 kDa a montré des niveaux plus élevés d'expression dans le MUC5B- que dans nutriment bouillon-environnement (voir Figure 6 et le tableau 1). Ceux-ci ont été coupées à partir d'un gel Coomassie teinté correspondant (voir la figure 5b), soumis à LC-MS /MS et les protéines puis identifiés par comparaison des fragments tryptiques avec la base de données Mascot. Cela a révélé quatre protéines avec un plus de trois fois la régulation dans le MUC5B- par rapport aux éléments nutritifs-bouillon-environnements, correspondant aux protéines chaperons; facteur de déclenchement (25 fois plus), DnaK (9 fois plus), Ef-G (6 fois plus) et GroEL (3 fois plus). Ainsi, ces données montrent que, outre la régulation de la glycoprotéase, l'augmentation de l'activité protéolytique dans la population est associée à une augmentation de la surface de l'expression des protéines chaperonnes DnaK, GroEL et le facteur de déclenchement. Figure 5 protéines de surface identifiées dans les cellules de biofilms de L. fermentum. (A) par Western Blot de l'électrophorèse bidimensionnelle (2DE) des protéines de surface. Les échantillons ont été soumis à une IEF dans un gradient de pH 4-7 suivi par SDS-PAGE à 14% de gels. Après électrotransfert sur des membranes de PVDF, GPR,
endopeptidase O-sialoglycoprotéine a été détectée en utilisant l'antisérum polyclonal MOB-LFGE-2. (B) Gel coloré au bleu brillant de Coomassie après 2DE des protéines de surface. Les taches ont été excisés du gel coloré, soumis à une digestion tryptique et les protéines dans le gel identifiés par analyse LC-MS /MS. Les protéines identifiées étaient: arg
, arginine déiminase; ATPase
, ATP synthase pyruvate déshydrogénase; DnaK
; Ef-G
, facteur d'élongation G; , Facteur d'élongation Tu es Ef-Tu; fum
, fumarate hydratase; Groel
; ldh
, lactate déshydrogénase; ket
, phosphocétolase; orn
, carbamoyltransferase ornithine; pdh
, pyruvate déshydrogénase et ppc
, hydratase phophopyruvate.
Figure 6 bidimensionnelle électrophorèse sur gel des protéines de surface de Lactobacillus fermentum. Les protéines isolées à partir de bactéries dans un MUC5B-environnement (à gauche) ou un milieu de bouillon nutritif (à droite) ont été soumis à IEF dans un gradient de pH 4-7 suivie par SDS-PAGE à 14% de gels. Les gels ont été colorés à l'argent et analyse d'image des protéines exprimées différemment réalisées en utilisant le logiciel delta 2D.
Tableau 1 Identification des protéines de surface dans L. biofilms fermentum amélioré de plus de 2,0 fois dans le milieu MUC5B par rapport à un milieu de bouillon nutritif a
Protein
IOD%
Pliez changeb
MUC5B
bouillon nutritif
Trigger factor

3.53

0.14

25.2


DnaK

2.57

0.29

8.9


Elongation facteur G

2.91

0.46

6.3


GroEL

5.66

1.84

3.1


O-sialoglycoprotein endopeptidase

3,31
1,24
2.7
pyruvate déshydrogénase

3,04
1,22

2.5
aData obtenu à partir de l'analyse des gels colorés à l'argent 2DE illustrés à la figure 6.
bFold changement calculé comme la valeur pour cent de la densité optique intégrée (IOD) de protéines dans Discussion de la
du MUC5B contre l'environnement de bouillon nutritif. dans leurs milieux naturels dans la cavité buccale, tractus gastro-intestinal et des voies reproductrices femelles, lactobacilles se trouvent dans les biofilms multi-espèces dans les couches de mucus adhérentes sur l'hôte les surfaces des muqueuses. Survie et la croissance sur ces sites dépendent de la capacité des bactéries à se lier à des couches de mucus ainsi que de dégrader des substrats complexes tels que les glycoprotéines de mucus pour produire de petits peptides et des saccharides en tant que source de nutrition. Dans cette étude, L. fermentum
a été capable de se lier et former des biofilms dans l'environnement MUC5B, conformément à l'expression de la protéine de liaison à la mucine, 32 Mmubp par cette espèce [16]. Le MUC5B mucine est une composante majeure des couches de mucus adhérentes dans la cavité buccale et de l'appareil génital féminin, les deux sites où L. fermentum
est connue pour coloniser [10, 24].
La proportion de protéolyse actif cellules au sein des populations de biofilms de L. fermentum
était significativement plus élevée dans un environnement de mucine riche que dans la présence d'un milieu nutritif qui suggère que la présence de mucines favorise l'activité protéolytique dans L. fermentum
. La capacité de mucines MUC5B pour induire une activité protéolytique a déjà été démontré dans la bactérie commensale orale, Streptococcus mitis
[25] et a également été montré une régulation de l'activité protéolytique dans le champignon pathogène Aspergillus fumigatus
croissante dans l'estomac mucines [26]. Pour déterminer les rôles respectifs des mucines associées à la surface et le fluide en phase dans la médiation de cette activité accrue, les cellules de L. fermentum ont été autorisés à adhérer à des surfaces revêtues de mucines ou de former des biofilms sur-non mucine surfaces revêtues où ils étaient exposé aux seuls mucines fluide de phase. Cela a révélé que l'exposition aux seuls mucines fluide de phase n'a eu aucun effet jusqu'à réglementaire sur l'activité protéolytique dans les biofilms. De même, l'activité protéolytique n'a pas été améliorée dans des cellules exposées à planctoniques mucines en solution, ce qui indique que la présence de mucines dans la phase fluide ne régulent à la hausse l'activité protéolytique de L. fermentum
. En revanche, le contact des cellules avec mucines associées à la surface a provoqué une augmentation significative de l'activité protéolytique dans la population qui suggère que les mucines jouent un rôle central dans la régulation de l'effet et que les molécules associées à la surface revêtent une importance particulière. Les mécanismes qui sous-tendent cette observation ne sont pas connus, mais il est possible que des epitopes au sein des mucines, a révélé un résultat de la liaison à une surface, sont nécessaires pour la régulation de l'activité protéolytique. Fait intéressant, le niveau d'activité protéolytique dans les cellules de biofilm sur les mucines associées à la surface (13 ± 0,4%) était inférieure à celle observée lorsque les mucines sont présents à la fois sur la surface et dans la phase fluide (47 ± 0,6%), ce qui suggère que les cellules Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.