pilote
Résumé de l'arrière-plan
Les papillomavirus humains (HPV) sont oncogènes et principalement associée à des cancers du col utérin. Des données récentes ont démontré l'infection par le VPH dans d'autres tissus, y compris les épithéliums orale et de la muqueuse. Bien qu'une récente étude pilote a fourni de nouvelles informations sur l'état de HPV par voie orale chez les adultes en bonne santé de Nevada, aucune information n'a été obtenue sur la prévalence du VPH par voie orale chez les enfants ou les adolescents, par conséquent, l'objectif de cette étude est de fournir des informations plus détaillées sur la prévalence orale de haute VPH à risque chez les enfants et les adolescents dans les méthodes du Nevada
Cette étude rétrospective utilisé des échantillons de salive prélevés antérieurement, obtenu à partir de patients de la clinique dentaire enfants (âgés de 2-11). et les adolescents du district scolaire local (12-17 ans) pour la haute Résultats de -Risque dépistage du VPH (n = 118) en utilisant qPCR pour la quantification et la confirmation de la sensibilité analytique et la spécificité.
Un petit sous-ensemble d'échantillons de salive ont été trouvés au port HPV16 à haut risque (n = 2) et HPV18 ( n = 1), ce qui représente 2,5% du total. Tous trois ont été obtenus à partir de l'adolescence mâles, et deux de ces trois échantillons provenaient de participants blancs.
Conclusions
Bien que cette étude rétrospective n'a pas pu fournir des corrélations avec des données comportementales ou socio-économiques, ce projet projeté avec succès plus d'une centaine d'échantillons de salive pour HPV à haut risque, confirmant à la fois HPV16 et HPV18 souches étaient présents dans un petit sous-ensemble. Avec l'augmentation des preuves de l'infection par le VPH par voie orale chez les enfants, cette étude fournit des informations essentielles d'une valeur significative à d'autres professionnels de la santé dentaire, médical, oral et public qui cherchent à favoriser une meilleure compréhension de la santé bucco-dentaire et le risque de maladie dans les populations pédiatriques.
Mots-clés
Human papillomavirus Saliva orale dépistage électronique matériel supplémentaire
La version en ligne de cet article (doi:. 10 1186 /1472-6831-12-43). contient du matériel supplémentaire, qui est disponible pour les utilisateurs autorisés
Contexte
les papillomavirus humains (HPV) englobe une famille étroitement liée des virus à ADN, qui sont capables d'intégrer dans le génome humain pour conduire la transformation des épithéliums infecté [1-4]. Une grande partie de la preuve épidémiologique de la cancérogenèse conduit HPV, ainsi que les mécanismes biologiques, ont été tirées d'études de cancers du col utérin [5-7] qui a isolé HPV à haut risque des deux carcinomes épidermoïdes adenovirus et [6-9] . Bien que HPV à haut risque entraîne le processus de presque tous les cancers du col de transformation et de la malignité, l'infection par le VPH est maintenant connu pour moduler la transformation épithéliale du sein, du poumon, du pénis, l'anus, ainsi que des tissus buccaux [10-20].
Le principal les facteurs de risque pour la carcinogenèse orale sont le tabac et la consommation d'alcool, bien que de nouvelles preuves suggèrent maintenant HPV peut également être un facteur de risque indépendant [17-23]. La prévalence plus élevée des souches de VPH à risque élevé dans les tumeurs oropharyngées pré-cancéreuses et cancéreuses suggère que le VPH peut infecter préférentiellement le développement ou établi cancers, modulant ainsi la progression cancérigène et finalement influencer les résultats de santé [24-26]. En fait, certaines données suggèrent que l'infection par le HPV à haut risque peut être associée à une meilleure réponse au traitement et des taux plus élevés de survie [27-29], tandis que des rapports contradictoires ont démontré diminué de façon significative la survie des patients [30-32] ou ont observé aucune discernable et des effets statistiquement significatifs [33].
Malgré la nature contradictoire de ces résultats, il est clair que le VPH peut être impliqué dans la modulation de la réactivité et la progression tumorale cancérogène, donc un grand nombre de ces études ont fourni des informations épidémiologiques précieuses sur lesquelles haut risque souches de VPH sont le plus souvent impliqués dans ces cas [34-36]. Ces études ont révélé HPV16 et HPV18 dans une moindre mesure, ont représenté la grande majorité (71 à 94,7%) à haut risque HPV par voie orale détectée [17, 18, 21-23, 34-36]. En outre, de nouvelles preuves suggèrent maintenant que ces souches de VPH à risque élevé (HPV16 et HPV18), peuvent initier la cancérogenèse orale parmi les plus petite fraction des patients atteints de cancer de la bouche qui ne consomment pas d'alcool ou consomment du tabac [37, 38].
Based sur les conclusions du HPV par voie orale dans les cancers oraux non-tabac et sans alcool associé, d'autres efforts récents ont porté plus spécifiquement à évaluer la prévalence du VPH par voie orale et de transmission au sein des populations en bonne santé, qui a également confirmé que HPV16 et HPV18 ont été la grande voie orale le plus souvent détecté souches -Risque de VPH [39-41] chez les adultes en bonne santé.
à cette fin, une étude pilote récente évaluation HPV orale chez les adultes en bonne santé a été réalisée dans le Nevada [42], un état récemment documenté avec l'augmentation des taux de cancers de l'oropharynx, en contraste avec la baisse des taux observés dans les pays voisins et les États-Unis, plus généralement, [43, 44]. Cette étude a révélé la présence d'un risque élevé souche HPV16, mais pas HPV18, chez les femmes et les minorités, les seuls sous-groupes de population démontré avoir la hausse des taux de cancer du orpharyngeal - en dépit de la baisse des taux globaux observés au sein de la population générale [45-47]. Cette étude a utilisé une procédure de dépistage sur la salive, une partie d'une tendance croissante vers des méthodologies moins invasives, telles que lavage- orale et des projections sur la salive, pour analyser l'état de HPV par voie orale chez les patients adultes en bonne santé [48-51].
Bien les taux de prévalence varient largement, ces études ont suggéré que l'infection à HPV par voie orale peut être de plus en plus, non seulement chez les adultes, mais plus particulièrement chez les jeunes adultes, les adolescents et les enfants [52-54] .à cette fin, certaines études ont examiné le VPH oral des enfants ou des adolescents, bien que beaucoup d'entre eux portait principalement sur les enfants ayant des conditions médicales sous-jacentes, telles que la co-infection par le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) [55-57]. La plupart des autres recherches, cependant, a mis l'accent plus particulièrement sur l'élucidation du rôle de la transmission du VPH vertical des nouveau-nés, ce qui démontre le potentiel d'acquérir HPV à haut risque pendant le processus de livraison et de l'accouchement, bien que ces infections généralement résoudre [58-63].
Cependant, de nouvelles preuves émergentes qui à haut risque démontré l'infection à HPV orale, les enfants normaux en bonne santé, avec les taux les plus élevés observés chez les enfants de moins de 7 ans (7,9% -8,7%), et à la baisse observée chez les adolescents en bonne santé (13- 20 ans, 5,1% -5,2%) et adultes en bonne santé (3,5%) [64, 65]. Ces observations peuvent suggérer que l'infection à HPV par voie orale peut se produire par contact personnel étroit avec les membres de la famille ou par contact avec fomites et d'autres vecteurs dans les centres de garderie, préscolaire ou dans les milieux de l'enseignement primaire, avec la plupart des enfants immunologiquement compétentes pour résoudre ces infections [66]. Cependant, certaines infections peuvent persister et leur contribution au développement de cancers de la bouche et d'autres pathologies reste incertaine
Bien qu'une étude pilote a récemment été menée afin d'évaluer le statut de HPV par voie orale, cela impliquait des patients adultes seulement en bonne santé -. Aucune information obtenue au sujet par voie orale la prévalence du VPH chez les enfants ou les adolescents. Sur la base des preuves antérieures démontrant un certain niveau d'infection par le VPH par voie orale chez les enfants et les adolescents en bonne santé, combinée à l'absence de données sur cette population, plus précisément, l'objectif de cette étude est de fournir des informations plus détaillées sur la prévalence des souches de VPH à risque élevé Résultats de HPV16 et HPV18 dans la cavité buccale des enfants et des adolescents dans le Nevada.
la proportion de spécimens féminins et masculins de l'échantillon de l'étude n'a pas été statistiquement différente des proportions globales au sein de la communauté locale de Clark County, Nevada ( Tableau 1). Plus précisément, le pourcentage des femmes et des hommes dans l'échantillon était à peu près égale (51,7% et 48,3%, respectivement), ce qui n'a pas été significativement différente de la population de la zone locale (p = 0,7051
). La proportion de minorités (non-blanches) échantillons était beaucoup plus grande dans l'échantillon de l'étude (70,3%) que dans la population locale (39,1%), ce qui était statistiquement significative (p
& lt; 0,0001). que d'adolescents et les adolescents.: Tableau 1 Analyse démographique: Bien que les données de la population locale étaient indisponibles pour les comparaisons par âge, l'échantillon de l'étude était composée de plus d'enfants plus jeunes (59,3% 2-11 ans) (12-17 40,7%) des participants de l'étude
CCDS (n = 48)
UNLV-SDM (n = 70)
échantillon total (n = 118)
Clark County population
analyse statistique
Sexe
Femme
n = 30 (62,5%)
n = 31 (44,3%)
n = 61 (51,7%)
n = 969 781 (49,7%)
χ2 = 0,17849 df = 1
Homme
n = 18 (37,5%)
n = 39 (55,7%)
n = 57 (48,3% )
n = 981.488 (50,3%)
p = 0,7051
Race
Blanc
n = 12 (25%)
n = 23 (32,9%)
n = 35 (29,7%)
n = 1188323 (60,9% )
χ2 = 28,3634 df = 1
non-White
n = 36 (75%)
n = 47 (67,1%)
n = 83 ( 70,3%)
n = 762 946 (39,1%)
p
& lt; 0,0001
Age
2-11
n = 0 (0%)
n = 70 (100 %)
n = 70 (59,3%)
N /A
12-17
n = 48 (100 %)
n = 0 (0%)
n = 48 (40,7%)
N /A
détaillée l'analyse des échantillons de salive ont révélé une certaine variabilité entre les comptages de cellules, la concentration d'ADN et la pureté de l'ADN entre les échantillons (figure 1). Les comptages de cellules ont varié entre 0,8 - 2,3 x 10
6 cellules /mL, qui ont encore été classés en bas (0,8 - 1,4 x 10 6) et élevé (1,6 - 2,3 x 10 6) le nombre de cellules . L'ADN a été isolé avec succès de tous les échantillons de salive, avec la concentration d'ADN moyenne pour les échantillons observés à 842,7 ng /ul. Des échantillons de chaque cohorte (CCDS, UNLV) avec le nombre de cellules dans la catégorie à faible ont été trouvés à avoir des concentrations moyennes inférieures de l'ADN que les échantillons de la même cohorte avec le nombre de cellules dans la catégorie haute. mesures d'absorbance et A260 /A280 analyse du rapport ont confirmé la pureté de l'ADN des isolats, qui était à peu près égale entre les cohortes, ainsi qu'entre les échantillons dans le bas et les catégories de comptage à grande cellule. Figure 1 Saliva analyse de l'échantillon: numération cellulaire, l'isolement de l'ADN et la pureté. A) Après centrifugation et remise en suspension des cellules dans une solution saline, le nombre de cellules pour chaque échantillon a été déterminée révélant trois quarts des échantillons UNLV ont observé que le nombre de cellules inférieures (0,8-1,4 x 106 cellules /ml), tandis que seulement un tiers de l'échantillon du CCDS ont été estimés * pour avoir le nombre de cellules inférieures. B) des concentrations d'ADN ont été trouvés à être plus élevés à partir des échantillons de comptage élevé de cellules au sein de chaque cohorte (CCDS: 859,4 et 707,1 ng /pl, respectivement; UNLV: 886,3 et 910,2 ng /ul, respectivement). la pureté de l'ADN en moyenne entre 1,71 et 1,82. C) des concentrations égales d'ADN extrait (1 pi) a été criblée en utilisant GAPDH, qui n'a révélé aucune variation considérable de l'intensité de la bande entre les cohortes d'échantillons provenant de catégories de comptage haute et basse cellules.
Échantillons d'ADN extrait ont ensuite été projeté pour la présence de HPV16 et HPV18 en utilisant une PCR (Figure 2). Ce dépistage a donné trois échantillons de HPV-positif (n = 3/118), ce qui représente 2,5% du total projeté. Deux de ces échantillons (S5, S38) nourrissaient l'ADN de HPV16 et un a été trouvé pour abriter HPV18 ADN (S7). Le traitement des échantillons d'ADN à l'aide qPCR fourni des évaluations quantitatives, ainsi que des mesures de sensibilité et de spécificité. Analyse du nombre de copies par génome pour le gène de ménage (β-actine) pour le HPV-positif (gamme: 25 - 40 copies /génome) et des échantillons de HPV-négatif (4 - 93 copies /génome) a révélé des valeurs qui étaient bien au-dessus de la valeur seuil (& gt; 0,1 copies /génome). Les résultats des analyses qPCR a révélé le nombre de copies d'échantillons de HPV-positives (plage: 150 - 880 copies /génome) qui étaient significativement plus élevés que les échantillons de HPV-négatif (gamme: 0,00148 - 0.0000016 copies /génome), qui pourraient être distingués en utilisant la valeur de coupure (& gt; 0.001 copies /génome). Ces analyses ont révélé aucun faux positifs ou de faux négatifs, ce qui démontre une sensibilité et une spécificité suffisantes pour déterminer la proportion de vrais échantillons de HPV-positifs (3/118 ou 2,5%, 3/3 ou 100%) et de véritables échantillons de HPV-négatif (115/118 ou 97,5%, 115/115 ou 100%). Figure 2 Saliva le dépistage de l'échantillon: analyse des résultats de HPV qPCR. A) Trois échantillons ont été trouvés pour abriter l'ADN du HPV: Des échantillons de HPV16 positives (S5, S38); Un échantillon a été HPV-positive (S7). B) L'analyse qPCR a révélé des échantillons de HPV-positives ont des valeurs bien au-dessus de la valeur limite établie (& gt; 0.001 copies /génome). C) Tous les échantillons de trois HPV-positives étaient de sexe masculin, ce qui représente 2,5% du total (n = 118). Deux des trois échantillons de HPV-positives étaient des participants blancs. Tous les échantillons de trois HPV-positives étaient de la cohorte de CCDS (âges: 12-17); Les deux échantillons de HPV16-positifs ont été obtenus à partir de vieux participants de 14 ans, tandis que l'échantillon de HPV18 positif a été obtenu à partir d'un vieux de 15 ans. Le plus Bien que la proportion relativement faible d'échantillons de HPV positif ne permet pas de larges déductions plus, une analyse descriptive des informations démographiques sur ces échantillons a révélé que tous les trois ont été dérivées des mâles (n = 3/57 ou 5,3%) et aucun sont issus de femelles. Les deux échantillons HPV16-positifs ont été recueillies auprès des participants blancs âgés de 14 ans (n = 2/35 ou 5,7%), tandis que l'échantillon de HPV18-positifs ont été recueillies auprès d'un participant non-blanc de 15 ans (n = 1/83 ou 1,2%) . Tous les échantillons de trois HPV-positives étaient de la CCDS (adolescente) cohorte (n = 3/48 ou 6,25%), alors qu'aucun n'a été observé dans le UNLV-SDM (pédiatrique) cohorte (n = 70) de. Discussion
l'objectif principal de cette étude était de dépister les enfants et les adolescents normaux en bonne santé dans le Nevada pour la présence de HPV à haut risque par voie orale. Cette analyse rétrospective a utilisé des échantillons de salive existants, recueillies auprès de patients dentaires pédiatriques et les adolescents du district scolaire local, d'obtenir de nouvelles données de cette population juvénile auparavant inexploré complétant ainsi le corps sans cesse croissant de preuves concernant la prévalence du VPH par voie orale chez les enfants. Plus important encore, ces données ont suggéré une prévalence orale de taches de VPH à risque élevé d'environ 2,5%.
Des études récentes d'adultes en bonne santé ont révélé des taux de prévalence similaires, se situant entre 3,1 et 5% [40, 41]. En fait, l'étude pilote récente des adultes en bonne santé dans le Nevada a rapporté HPV oral chez 2,6% des 151 patients sans cancer [42]. Les résultats de l'étude étaient nettement différentes, cependant, parce que deux des échantillons de trois HPV-positifs ont été obtenus de Blancs et tous étaient des mâles - alors que l'étude préalable des adultes a révélé HPV par voie orale chez les femmes et les minorités seulement. D'autres preuves ont suggéré que, bien que des échantillons provenant de femmes et les hommes avaient des taux similaires de HPV par voie orale (56 et 44%, respectivement), les échantillons de HPV négatif de cette étude étaient essentiellement des femmes (82%) - à fournir des preuves d'une possible mâle, sexospécifiques phénomène similaire aux résultats de l'étude en cours [67]. Bien qu'il existe de nombreuses explications possibles, telles que la nature transitoire de la population locale, de nombreux autres facteurs tels que le stress, l'alimentation, le revenu, la pauvreté, le statut socio-économique, et l'exposition au HPV par voie orale peuvent affecter les différents groupes raciaux et des deux sexes de façon similaire.
Cette étude représente un tournant important dans les efforts de santé publique pour élucider la détection du VPH par voie orale dans une zone géographique connue pour supérieur à la moyenne (et auparavant augmentation) des taux de cancers de l'oropharynx [43, 44]. Cependant, cette étude a plusieurs limites qui doivent être reconnus. Premièrement, la nature rétrospective de cette étude a limité les déductions qui pourraient être apportées, contrairement à d'autres études prospectives récentes de HPV par voie orale chez les enfants et les adolescents [64-68]. En outre, aucune donnée de comportement ou socio-économiques détaillées sont disponibles, tels que les comportements de revenu ou le tabagisme des parents, en raison de la nature de cette étude pilote rétrospective. On espère que les futures enquêtes portant sur le VPH orale fourniront un éclairage supplémentaire avec des informations comportementales plus détaillées, ainsi que les données concernant le logement, l'éducation, le revenu et d'autres indicateurs socio-économiques [67-71]
. Conclusions
Ce projet projeté avec succès des échantillons de salive pour HPV à haut risque, ce qui confirme les deux souches de HPV16 et HPV18 étaient présents dans un petit sous-ensemble. Bien que les travaux antérieurs ont porté sur la transmission du VPH par voie orale de la mère au nouveau-né pendant l'accouchement et pendant l'allaitement [58-63, 68], il existe des preuves de plus en plus à penser que la suite de la période périnatale, la transmission du VPH par voie orale par contact personnel étroit, comme manger partagée ustensiles, jouets, baisers et baignade peuvent expliquer la transmission du VPH par voie orale (principalement HPV16) chez les enfants et les adolescents [72-75]. Cette étude fournit donc des informations essentielles d'une valeur significative à d'autres professionnels de la santé dentaire, médical, oral et public qui cherchent à favoriser une meilleure compréhension du risque élevé prévalence du VPH chez les enfants dans le cadre d'une compréhension plus large du risque pour la santé et de la maladie par voie orale en pédiatrie . la taille de l'échantillon de méthodes de populations
Étant donné la prévalence connue de haut risque HPV par voie orale dans l'étude précédente que projeté adultes en bonne santé dans cette zone géographique, la taille de l'échantillon a été calculé selon la formule suivante: n = Z
2
P
(1 - P
) /d
2, où n = taille de l'échantillon, Z = Z
statistique pour un niveau de confiance, P =
prévalence attendue, et d
= précision [76, 77]. En utilisant le niveau de confiance de 95%, la valeur Z
a été déterminée à 1,96; Utilisation de la précédente proportion /prévalence des HPV à haut risque de 2,6%, la valeur P
a été défini comme P
= 0,026; La valeur de d
doit être calculée à 0,5 (P
), résultant en une valeur pour d
= 0,013. L'utilisation de ces entrées, la taille minimale de l'échantillon pour cette étude a été calculée à n = 75.
sujets humains
Le protocole de cette étude intitulée «Évaluation rétrospective de Microbial Présence dans Repository Saliva existant: Une étude moléculaire PCR-Based des oraux populations microbiennes à partir d'échantillons de salive existants »a été déposée, modifiée, et approuvé par l'office of Research Integrity UNLV - sujets humains (OPRS # 1104-3801M) le 10 mai 2011. les échantillons de salive existants ont été recueillies au cours de deux études antérieures au sein l'école de médecine dentaire UNLV (SDM) en 2009-2010. Des échantillons de salive prélevés à partir d'une étude préalable des adolescents (14-15 ans) ont été calculées à partir d'un échantillon de commodité des écoles sélectionnées dans le comté de Clark, Nevada District School (CCDS; n = 48); initialement obtenu pour le but de surveiller les niveaux de bactéries cariogènes par voie orale. Des échantillons de salive prélevés jeunes enfants (2-11 ans) ont été obtenus à partir d'un échantillon de convenance au sein de la clinique dentaire pédiatrique UNLV-SDM (n = 70); obtenue initialement à des fins de dépistage de métaux lourds (plomb ou Pb) fardeau. En bref, pour les collections d'échantillons de salive d'origine à CCDS et UNLV-SDM, les parents et les sujets ont été recrutés sur place. Critères d'inclusion: consentement éclairé /Parent La permission a été exigé et réalisé sur place, ainsi qu'une sanction à participer à la recherche pour tous les enfants âgés de plus de sept qui étaient capables de lire. Critères d'exclusion: les sujets âgés de moins de sept ans, les sujets qui ont refusé de participer, et les sujets avec les parents qui ont refusé de participer. Chaque échantillon a été attribué un numéro unique, généré aléatoirement pour éviter le biais de la recherche, avec les seules informations démographiques sur les échantillons de salive: le sexe, l'âge et l'origine ethnique des participants à l'étude originale. Ce projet en cours était une analyse rétrospective de ces deux collections d'échantillons de salive; la taille totale de l'échantillon combiné pour cette étude était n = 118.
Saliva protocole de collecte
En bref, les sujets qui ont accepté de participer ont reçu un petit récipient de collecte de salive stérile, 50 ml tube en polypropylène stérile (Fisher Scientific: Fair Lawn, New Jersey, USA). Les participants ont ensuite été invités à mâcher sur un petit morceau de cire de paraffine pendant une minute, puis à expectorer, conformément au protocole de l'étude pilote précédente [42]; volumes d'échantillons variaient d'environ 50 pi à 2,5 pi. Les échantillons ont été stockés sur de la glace jusqu'à ce que le transport vers un laboratoire biomédical pour l'analyse. Chaque échantillon de salive a été attribué un numéro unique, généré aléatoirement pour éviter le biais de la recherche. Les données démographiques concernant l'échantillon a été recueilli en même temps, qui se composait de l'âge, le sexe et l'origine ethnique seulement.
comptage des cellules et l'isolement de l'ADN
Tous les échantillons ont été centrifugés pendant 10 minutes à 2.100 g (RCF) et le culot cellulaire lavé avec saline 1X tampon phosphate (PBS) (HyClone: Logan, Utah, États-Unis) et remises en suspension dans 5 ml de PBS 1X. Le nombre de cellules a été déterminée en utilisant Bleu Trypan (Fisher Scientific: Fair Lawn, New Jersey, USA) en utilisant un microscope inversé Zeiss Axiovert 40 (Carl Ziess, Inc: Thornwood, New York, États-Unis) et un hématimètre (Fisher Scientific: Fair Lawn, New Jersey, USA). Pour déterminer si des échantillons hébergeaient le virus HPV, l'ADN a été isolé à partir de l'échantillon de salive en utilisant un minimum de 3,5 x 10 5 cellules en utilisant le kit d'isolement GenomicPrep ADN (Amersham Biosciences: Buckinghamshire, Royaume-Uni), en utilisant la procédure recommandée par le fabricant comme décrit précédemment [12, 42, 78, 79]. la pureté de l'ADN a été calculée en utilisant la mesure du rapport de l'absorbance à 260 et 280 nm (rapport A260 /A280 compris entre 1,7 et 2,0). réactionnel
en chaîne par polymérase (PCR)
ADN de chaque échantillon a ensuite été utilisé pour effectuer la PCR avec le Fisher kit PCR complète exACTGene (Fisher Scientific: Fair Lawn, New Jersey, États-Unis) et un gradient thermocycleur Mastercycler (Eppendorf: Hambourg, Allemagne) en utilisant les amorces suivantes pour HPV16 [12, 78], HPV18 [12, 78, 79], et glyceraldehyde- 3- phosphate déshydrogénase (GAPDH) [80] (SeqWright: Houston, Texas, États-Unis):.
HPV16 amorce sens, ATGTTTCAGGACCCACAGGA;
HPV16 amorce inverse, CCTCACGTCGCAGTAACTGT
HPV18 amorce avant, ATGGCGCGCTTTGAGGATCC;
HPV18 amorce inverse, GCATGCGGTATACTGTCTCT;
GAPDH amorce avant, ATCTTCCAGGAGCGAGATCC;
GAPDH amorce inverse, ACCACTGACACGTTGGCAGT;
Un pg d'ADN matrice a été utilisé pour chaque réaction. L'étape initiale de dénaturation a duré trois minutes à 94 ° C. Un total de 30 cycles d'amplification ont été exécutés, constitué de 30 secondes de dénaturation à 94 ° C, 60 secondes de recuit à 58 ° C, et 30 secondes d'extension à 72 ° C. L'extension finale a été effectuée pendant cinq minutes à 72 ° C. Les produits de réaction PCR ont été séparés par électrophorèse sur gel en utilisant 4% Reliant NuSieve® 3: 1 des gels plus Agarose (Lonza: Rockland, Maine, USA). Les bandes ont été visualisées par illumination UV de bromure d'éthidium-gels colorés et capturés à l'aide d'un Kodak Gel Logic 100 Système d'imagerie et d'analyse d'images 1D Software (Eastman Kodak: Rochester, New York, USA) PCR quantitative (qPCR) de les échantillons d'ADN ont ensuite été traitées à l'aide qPCR pour fournir une quantification plus précise et sensible. Amorces et sondes ont été conçues à l'aide du logiciel de bibliothèque Roche Universal Probe (UPL) de conception d'essai pour amplifier la région chevauchant E6 et E7 séquence du gène de HPV16 (GenBank accession no. K02718) et le gène de ménage de β-actine humaine (GenBank accession no. M10277) . Ces amorces ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, États-Unis) et des sondes de Roche Applied Science (Indianapolis, Indiana, États-Unis).
HPV16 E6 /E7 amorce sens 5'-CAACTGATCTCTACTGTTATGAGCAA-3 ', HPV16 E6 /E7 amorce inverse 5'-CCAGCTGGACCATCTATTTCA-3 ', HPV16 E6 /E7 hydrolyse "Taqman" sonde 5' - (fam) -AGGAGGAG- (foncé quencher colorant) -3 '(UPL sonde n ° 63) a été utilisé pour amplifier la 73 paire de base (pb) région entre la position 535 nucelotide (nt) et 607 position nt. HPV18 E7 amorce sens 5'-GACTCAGAGGAAGGAAAACGATGAAA, HPV18 E7 amorce inverse 5'-GTGACGTTGTGGTTCGGCT; HPV18 E7 sonde 5'-TGGAGTTAATCATCAACATTTACCA a été utilisée pour amplifier la région de 25 pb entre les positions 715 et 739 nt. β-actine humaine amorce sens 5'-GTGGGGTCCTGTGGTGTG-3 ', β-actine humaine 5'-GAAGGGGACAGGCAGTGA-3', l'hydrolyse de β-actine "Taqman« humain sonde 5 '- (fam) -GGGAGCTG- (foncé quencher colorant) - 3 '(UPL sonde n ° 24) amplifié la région de 61 pb entre 2642 position nt et 2702 position nt.
le temps réel a été préparé le mélange de réaction dans un LightCycler® 480 Plate multipuits 96 contenant 1x LightCycler® 480 Sondes master (Roche Sciences appliquées: Indianapolis, Indiana, États-Unis), 1 uM de chaque ensemble d'amorces respectives (avant et arrière), 0,2 pM de la sonde respective, et 2 ul de matrice d'ADN; dans un volume réactionnel final de 20 ul. Le mélange des sondes maître contenu du tampon de réaction, mélange de dNTP (y compris dUTP à la place de dTTP), 3,2 mM MgCl 2, et Taq
l'ADN polymérase. Le test de PCR en temps réel a été réalisée sur un système LightCycler 480 (Roche Applied Sciences: Indianapolis, Indiana, États-Unis) avec les paramètres suivants du cycle: pré-incubation pour l'activation de l'enzyme initiale à 95 ° C pendant 10 minutes, suivies de 45 cycles de 95 ° C pendant 10 secondes (vitesse d'élévation de 4,4 ° C /seconde), 60 ° C pendant 30 secondes (vitesse de rampe de 2,2 ° C /seconde) et 72 ° C pendant 1 seconde (vitesse de rampe de 4,4 ° C /seconde). À la suite de la phase d'amplification, une étape de refroidissement a été effectué à 40 ° C pendant 30 secondes (vitesse de 2,2 ° C /seconde rampe). Acquisition du signal de fluorescence a été effectuée en utilisant le réglage (465-510 nm) après la phase de 72 ° C extension de chaque cycle mono Hydrolyse de la sonde. Tous les échantillons ont été réalisées en triple
Le CaSki (American Type Culture Collection, Manassas, Virginie, USA). Lignée cellulaire d'adénocarcinome du col utérin a été utilisé pour développer des courbes standard tant pour le HPV16 (600 copies /génome) et GAPDH (2 exemplaires /génome) gènes. Le GH354 (American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, USA) lignée cellulaire d'adénocarcinome du col utérin a été utilisé pour développer les courbes standard pour HPV18 (200 copies /génome). ADN extrait de cellules CaSki et GH354 sont dilués en série de dix fois à partir de 50 ng à 0,0005 ng [81] La quantification a été réalisée à l'aide du seuil de cycle (C T) mesurée avec la seconde méthode maximale dérivée (LightCycler 480 Software Version 1.5.0.39; Roche Applied Sciences: Indianapolis, Indiana, États-Unis). échantillons & gt Saliva; 0,001 copie /génome ont été considérés comme positifs pour le VPH. analyse de spécificité a été réalisée sur qPCR test contre HPV18 et jugé spécifique à 100% (données non présentées)
évaluation statistique
sensibilité et la spécificité ont été calculées comme étant la proportion de vrais positifs et vrais négatifs (valeur de coupure & gt;. 0,001 copies /génome), respectivement. Suite à l'acquisition d'échantillons de salive et les résultats de dépistage du VPH, des informations démographiques à partir des échantillons ont été comparés avec le profil démographique global de la population locale en utilisant un (χ2) test du chi-carré, afin de déterminer si caractéristique (sexe, la race, l'âge) a été différent de celui attendu chez les sujets évalués dans cette étude (n = 118). Un niveau d'alpha (α) = 0,05 probabilité a été utilisé pour déterminer la signification statistique
abréviations
HPV:.
Papillomavirus humain
ADN:
acide désoxyribonucléique
Etats-Unis:
États-Unis
PCR:
réaction en chaîne par polymérase
OPRS:
office pour la protection de la recherche humaine Sujets
CCDS:
Clark County Nevada - School District
< dfn> UNLV-SDM:
Université du Nevada à Las Vegas - école de médecine dentaire
RCF:
la force centrifuge relative
PBS:
tampon phosphate salin
GAPDH:
glycéraldéhyde-3- phosphate déshydrogénase
qPCR:
réaction en chaîne par polymérase quantitative
pb:
paire de base
nt:
Nucleotide
dNTP:
désoxyribonucléotide triphosphate
dUTP:
2-désoxyuridine triphosphate
dTTP:
désoxythymidine triphosphate .
Déclarations de les Remerciements
les auteurs tiennent à remercier l'école UNLV de UNLV-SDM Département des sciences biomédicales Sciences et santé communautaire, Bureau de la recherche, Programme d'éducation et avancée en pédiatrie Dentisterie pour fournir les fournitures et réactifs pour cette étude pilote initiale.
auteurs fichiers originaux soumis pour les images
Voici les liens vers les auteurs originaux soumis fichiers pour les images. de fichier d'origine pour la figure 1 12903_2012_246_MOESM2_ESM.pdf Auteurs '12903_2012_246_MOESM1_ESM.pdf Auteurs fichier d'origine pour la figure 2 Intérêts concurrents
Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun conflit d'intérêts. Les contributions de
Auteurs
KK et CF conçus, surveillés, et coordonné la conception expérimentale. KH, EE, JA et AH étaient responsables des sujets de recrutement, le consentement éclairé, la collecte d'échantillons et une analyse biomédicale. CF, EE, JA, et AH a réalisé l'extraction d'ADN, l'analyse par PCR et qPCR. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.
