Résumé de l'arrière-plan
West Virginia a la pire santé bucco-dentaire aux États-Unis, mais les raisons de cela sont pas clair. Cette étude pilote a exploré l'étiologie de cette disparité en utilisant des analyses de culture indépendante pour identifier les espèces bactériennes associées à la maladie par voie orale.
Méthodes
bactéries dans des échantillons de plaque sous-gingivale de douze participants dans deux études dentaires liées West Virginia indépendants ont été caractérisés en utilisant ARNr 16S séquençage génique et orale Microbe identification Microarray (HOMIM) analyse humaine. analyse Unifrac a été utilisé pour caractériser les différences phylogénétiques entre les communautés bactériennes obtenues à partir de la plaque de participants ayant une maladie orale faible ou élevé, qui a ensuite été évalués en utilisant le regroupement et analyse en coordonnées principales.
Résultats
Statistiquement différentes signatures bactériennes (P
& lt; 0,001) ont été identifiés dans la plaque sous-gingivale des personnes atteintes de la maladie orale faible ou élevé en Virginie-occidentale basé sur le séquençage des gènes ARNr 16S. Faible maladie contenait une fréquence élevée de Veillonella
et Streptococcus
, avec un nombre modéré de Capnocytophaga
. Haute maladie présentaient sensiblement augmenté la diversité bactérienne et comprenait une grande partie des bactéries Clostridiales de cluster (Selenomonas
, Eubacterium, Dialister
). Les arbres phylogénétiques construits en utilisant le séquençage des gènes ARNr 16S a révélé que Clostridiales ont été répétées colonisateurs dans la plaque associée à la maladie orale élevée, fournissant la preuve que l'environnement oral est en quelque sorte une influence sur la signature bactérienne liée à la maladie. Conclusions de
analyses de culture indépendante identifiés une signature bactérienne atypique associée à la maladie orale élevée en Virginie-occidentale et a fourni des preuves que l'environnement oral influencé cette signature. Les deux résultats permettent de comprendre l'étiologie de la disparité orale en Virginie-Occidentale
matériel supplémentaire électronique
La version en ligne de cet article. (Doi:. 10 1186 /1472-6831-11-7) contient du matériel supplémentaire , qui est disponible pour les utilisateurs autorisés.
Contexte
Virginie-occidentale ont la pire santé bucco-dentaire dans le pays, avec près de deux fois la moyenne nationale (48,2%) des adultes âgés de 65 ans ou ayant plus toutes leurs dents naturelles extraites [1 ]. Ces statistiques deviennent plus alarmantes sachant que les infections de la cavité buccale ont été associés à des maladies chroniques, comme le diabète, les maladies cardiovasculaires et de l'athérosclérose [2-4]. Ni l'origine de la mauvaise santé buccodentaire en Virginie-Occidentale, ni sa relation avec la maladie systémique est entendu. Au centre de ce problème est la détermination des populations microbiennes responsables d'infections orales. Historiquement cela a été difficile en raison de la complexité du microbiome dans les biofilms buccaux, et des difficultés à cultiver les bactéries obtenues à partir de l'environnement buccal.
Biofilms peuvent jouer soit un rôle protecteur (probiotique) ou pathogènes en santé bucco-dentaire en fonction de leur composition microbienne . biofilms buccaux sont initiées par la colonisation du probiotique cocci à Gram positif, en premier lieu streptocoque, en adhérant à la surface des dents, ainsi que coaggregating Actinomyces et paris Veillonella
[5]. Coagrégation est une propriété commune dans le développement de la plaque et les bactéries colonisant précoces sont pontées par des bactéries telles que fusobactéries, à colonisateurs tardifs. La succession écologique des populations microbiennes du colonisant précoce cocci à Gram positif à la fin colonisatrices anaérobies gram-négatives de divers morphotypes conduit à un changement dans la composition de biofilm qui est en corrélation avec l'apparition de la gingivite et la parodontite [6]. organismes spécifiques ont été liés à des maladies orales. La carie dentaire se produit à la suite d'un changement dans la communauté de biofilm contre les bactéries acidogènes et tolérantes aux acides, en particulier Streptococcus mutans
et lactobacilles [7]. En plaque sous-gingivale, Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia
et actinomycetemcomitans Aggregatibacter
ont été fortement associées à la maladie parodontale [8, 9]. Jusqu'à récemment, les associations de microbes avec la maladie par voie orale ont été basées sur la culture in vitro. Comme il est maintenant reconnu que seulement environ 60% de l'espèce dans les biofilms buccaux sont [10], l'utilisation des analyses de culture indépendante a conduit à un nouveau niveau de compréhension des microbes associés oraux [11].
Analyses moléculaires cultivable de la microflore parodontale avait pas encore été utilisée pour examiner le profil bactérien de la plaque sous-gingivale de la Virginie-occidentale. Le but de cette étude était d'utiliser gène 16S ARNr analyses afin de mieux comprendre l'étiologie de la disparité de santé bucco-dentaire observée dans cette population. Dans cette étude préliminaire, nous avons pu identifier de façon significative différentes ARNr 16S signatures phylogénétiques bactériennes dans la plaque d'individus ayant une maladie orale élevée ou faible, et la signature de la maladie élevée était évidente dans deux populations indépendantes qui couvrent un large éventail de groupes d'âge. Dans l'ensemble nous avons trouvé que les communautés riches en Veillonella
et streptocoques déplacés vers les communautés riches en Selenomonas
et d'autres Clostridiales en association avec un déclin de la santé bucco-dentaire, ce qui pourrait lier une signature bactérienne atypique avec la maladie par voie orale dans la Virginie-Occidentale. La conclusion selon laquelle une signature bactérienne atypique peut être liée à des disparités de santé bucco-dentaire observées en Virginie occidentale met en évidence la nécessité de nouvelles analyses d'espèces bactériennes associées à la maladie par voie orale élevée et faible dans cette population afin de comprendre l'origine de cette disparité.
Méthodes
échantillons de plaque sous-gingivale des populations Sujet utilisées dans cette étude ont été obtenus en collaboration avec deux projets de recherche menés en Virginie-occidentale. Plaque d'une population 23 ans à 48 a été obtenue par le Centre de recherche en santé buccodentaire dans les Appalaches (étude COHRA), un partenariat entre l'Université West Virginia et l'Université de Pittsburgh examen génétique, épidémiologique, microbiologiques et les facteurs comportementaux qui contribuent à la santé bucco-dentaire. Plaque d'une population plus âgée a été obtenue par les disparités en santé bucco-dentaire chez les aînés avec et sans déficience cognitive (étude cognitive), réalisée en collaboration avec l'École West Virginia University of Dentistry et le Centre sur le vieillissement. Nous avons choisi d'inclure des sujets de deux piscines indépendantes West Virginia de la population (médiane d'âge 23-48 ou âge & gt; 70) dans notre étude pour aider à prolonger la compréhension de la pertinence de nos conclusions à un large échantillon de la population de l'Ouest de la Virginie. Être financé en tant que projet pilote, relativement peu de sujets de chaque groupe ont pu être analysés. Toutes les procédures ont été effectuées en utilisant Institutional Review Board protocoles approuvés.
Critères d'évaluations Sujet pour l'évaluation de la santé bucco-dentaire, les méthodes de collecte de la plaque de participants, et l'étalonnage des chercheurs du projet COHRA ont été décrits précédemment [12]. Notre étude a porté sur la plaque sous-gingivale de sept participants COHRA, qui a été obtenu à partir de quatre premières molaires (n ° 3, 14, 19 et 30). Ces mêmes sites ont été évalués pour la profondeur de sondage (PD), la récession et le saignement au sondage (BOP), comme résumées dans le tableau 1. L'évaluation Caries était basée sur les surfaces des dents coronales, et les dents ont été classés comme son, cariées, rempli ou manquant. Pourcentage de dents saines pour chaque participant est rapporté dans le tableau 1. L'état oral des sujets de l'étude COHRA a été déterminé sur la base des examens parodontales (bordée par des pointillés dans le tableau 1): faible maladie définie comme & lt; 3,5 mm PD, 0-25% BOP des sites; haute maladie définie comme & gt; 4,5 mm PD, 100% des sites de la balance des paiements. plaque sous-gingivale a été prélevé à l'aide d'une curette, en suspension dans 100-500 ul de TE (Tris 10 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM) contenant 20% de glycerol et stockées à -70 ° C jusqu'au moment du traitement. Plusieurs spécimens de participants individuels ont été mis en commun pour les évaluations cliniques de l'étude analyses.Table 1 COHRA
Code patient
DB
DC
DF
DL
DG
DI
DA
Age
30 ans
23 ans
32 ans
32 ans
48 ans
40 y
35 y
Sex
F
F
M
F
M
M
F
Race
White
Afr/Am
White
White
Mixed
White
White
Smoker
No
No
Sometimes
No
Yes
Yes
Sometimes
Parodontale 1
|
|
|
|
|
|
(mesuré sur 4 sites: 3,14,19,30)
|
|
|
|
|
|
|
profondeur Probing (moyenne mm /site)
& lt; 3.5
& lt; 3.5
4.5
4.5
5.2
5.2
5.2
Récession (% positive/site)
0
0
0
25
0
75
100
Bleeding au sondage (% des sites)
25
0
100
100
100
100
100
Gingivitis - localized
0
0
0
0
0
0
0
generalized
0
Yes
Yes
0
0
0
0
hyperplasia
0
0
0
Yes
Yes
Yes
Yes
Caries
|
|
|
|
|
|
| <
br> dentiers (inférieur /supérieur)
0
0
0
0
0
0
0
son dents (% des 28 dents)
64,3
78,6
92,9
53,6
78,6
67,9
50
1 les lignes pointillées bordent les paramètres cliniques utilisés pour déterminer le statut oral des participants à l'étude COHRA.
participants à l'étude ont été sélectionnés cognitives basées sur: 1) l'âge de 70 ans et plus, 2) résident de la Virginie-occidentale, 3) de vie communautaire, et 4) denté (ayant au moins quatre dents naturelles). Les évaluations orales ont été réalisées par des chercheurs calibrés à l'aide des lignes directrices et des protocoles de l'Enquête nationale sur la santé et la nutrition (NHANES IV) [13]. Des échantillons de plaque sous-gingivale ont été recueillies à l'aide de curettes parodontales stériles à partir de six sites de la manière suivante: la face vestibulaire de la molaire la plus antérieure dans chaque quadrant, et la surface buccale de # 11 et # 31. échantillons plaque ont été stockés et mis en commun pour les analyses comme ci-dessus. Critères d'évaluation parodontale dans l'étude cognitive inclus PD, gingivite et calcul. évaluation des Caries inclus type de prothèses dentaires et pour cent de son, manquants, remplis, dents cariées ou couronnées. Les deux évaluations sont présentés dans le tableau 2. L'état oral des sujets de l'étude cognitive a été déterminée sur la base de caries examens (bordée par des pointillés dans le tableau 2): faible maladie définie comme & gt; 60% de son /dents obturées présente; haute maladie définie comme & gt; 40% des dents manquantes ou decayed.Table évaluations cliniques 2 de l'étude cognitive
Patient code
DT
DQ
DV
DAA
DZ
Age
74
93
77
91 y
77 y
Sex
F
F
M
F
F
Race
Afr/Am
White
White
White
White
Smoker
No
No
No
Yes
No
Parodontale
|
|
|
|
|
(Nombre de dents sondé)
22
26
22
ND1
10
profondeur Probing (moyenne
|
|
|
|
|
mm /site)
3.01 ± 0.53
1,98 ± 0,71
2,45 ± 0,55
nd
1,66 ± 0,41
gingivite (% des sites positifs)
68,2
4.5
9.1
nd
80
Le Calcul (% des sites positifs)
0
0
4,5
nd
30
caries
|
|
|
|
|
dentiers (inférieur)
0
partiel
0
0
0
dentiers (supérieure)
0
0
partiel
plein
indice de Tooth
partielle (% des 32 dents)
|
|
|
|
|
Sound
59.4
31.3
40.6
37.2
21.9
Missing
31.3
15.6
31.3
40.6
65.6
Filled
6.25
40.6
18.8
15.6
9.4
Decayed
3.1
0
0
6.3
3.1
Crown
0
12.5
9.4
0
0
1Pas données d'examen parodontales a été acquis pour DAA.
Lignes 2Dashed bordent les paramètres cliniques utilisés pour déterminer le statut oral des participants à l'étude cognitive.
Extraction d'ADN et ARNr 16S analyse de la séquence du gène
ADN a été extrait et purifié à partir de plaque sous-gingivale en utilisant le kit ADN de sol Isolation UltraClean (MO Bio Labs, Carlsbad, CA). Le gène ARNr 16S a été amplifié par PCR en utilisant les 16S universels ARNr amorces (avant, 5'-GAGTTTGATYMTGGCTCAG, inverse, 5'-GAAGGAGGTGWTCCADCC [14]). Chaque réaction de PCR contenait 1 ul d'ADN purifié, 0,4 uM universel amorces directe et inverse, un tampon de PCR 5 pi 10X du platine, MgSO 1,5 mM 4, 0,2 mM de dNTP et 0,5 pi de platine Taq DNA Polymerase High Fidelity (Invitrogen, Life Technologies Corp. , Carlsbad, CA). Les conditions de PCR étaient les suivantes: 94 ° C pendant 4 minutes, suivi par 30 cycles de 94 ° C pendant 45 secondes, 60 ° C pendant 45 secondes et 72 ° C pendant 90 secondes, avec une extension finale à 72 ° C pendant 15 minutes. Les produits de PCR ont été analysés par électrophorèse sur gel d'agarose à 0,8%, et les réactions donnant des produits de ~ 1500 pb ont été clones en utilisant le kit de clonage TOPO TA pour le séquençage (Invitrogen). Les produits de ligature ont été électroporés dans E. coli
(cellules TOP10 chimiquement compétentes, Invitrogen) et les transformants ont été mises en incubation dans du milieu 250 ul de SOC (2% tryptone, 0,5% d'extrait de levure, NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM, MgCl 10 < sub> 2, 10 mM de MgSO 4, glucose 20 mM) pendant 1 heure à 37 ° C, avant le placage sur de l'agar LB contenant 50 pg /ml de kanamycine et un revêtement 25 ul de 2% de X-gal. Après l'incubation pendant une nuit, ~ 100 colonies contenant des inserts (colonies blanches) ont été isolées à partir de chaque échantillon et on cultive à 37 ° C pendant une nuit dans des plaques à 96 puits contenant du bouillon LB avec 50 ug /ml de kanamycine. Un volume 2 pl de culture bactérienne de chaque puits a été amplifié par PCR en utilisant des amorces M13 (avant, 5'-TGTAAAACGACGGCCAGT, inverse 5'-CAGGAAACAGCTATGAC). Les réactions contenaient 0,2 uM de chaque amorce, 5 pi de tampon 10X PCR Qiagen (Qiagen, Valencia, CA), 0,2 mM de dNTP et 0,2 pi de Taq ADN polymerase (Qiagen). Les conditions de PCR étaient les suivantes: 94 ° C pendant 4 minutes, suivi par 30 cycles de 94 ° C pendant 45 secondes, 52 ° C pendant 45 secondes et 72 ° C pendant 90 secondes, avec une extension finale à 72 ° C pendant 15 minutes. Les produits de PCR provenant de chaque puits ont été examinés par électrophorèse, et les produits de la taille appropriée ont été séquencées par une installation commerciale (SeqWright, Houston, TX) de l'ARNr 16S de l'analyse de la séquence du gène de.
Chaque séquence d'ADN a été balayée pendant un seul segment de la séquence d'amorce d'origine (ATCAAACT) entre 440 et 520 pb pour identifier le gène de l'ARNr 16S et pour aider à exclure les chimères. La première partie de chaque séquence contenant des bases non appelés (N) a été retiré, la partie distale (séquence de vecteur) a été coupé à l'amorce, et la séquence est inversée à l'orientation standard. Les séquences nucléotidiques générées par cette étude ont été déposées dans GenBank, les numéros d'accession HQ894465 -. HQ895588
Sequences ont été classés par l'analyse BLASTN à la fois contre une base de données locale et la (nr) base de données GenBank non redondante. La base de données locale a été assemblé dans un processus itératif: si une nouvelle séquence expérimentale ne correspond à & gt; 98% d'identité, une nouvelle base de données a été assemblé en ajoutant des séquences de type correspondant obtenus à partir de GenBank et le projet de base de données ribosomique (RDP) [15]. La base de données locale actuelle contient 375 séquences organisées en 122 «groupes». Chaque groupe contient des séquences étroitement apparentées et a été validé pour être non-chevauchement par l'analyse BLAST de groupes individuels contre la base de données entière. Cette approche a fourni un niveau de détail qui a été instructif pour classer les séquences bactériennes. Logiciel utilisé dans la séquence des analyses inclus: 1) BLAST, en utilisant le serveur NCBI [16] avec des résultats formatés en XML; 2) UniFrac, en utilisant son serveur [17, 18]; 3) la construction de l'arbre phylogénétique, en utilisant le serveur RDP; 4) BLAST local, en utilisant le 'héritage' blastall exécutable à partir de NCBI [19]. Autre terme du logiciel inclus localement: R [20] et l'analyse des Phylogenetics et Evolution (APE) forfait pour la construction et le tracé des arbres phylogénétiques et traçant le principal Coordonner l'analyse (ACoP); ClustalW2 [21] et de muscle [22] pour l'alignement de séquences multiples; et Python [23] pour automatiser les étapes dans les analyses et produire les heatmaps (générés en utilisant matplotlib).
Human Oral Microbe Identification Microarray (HOMIM) analyse
Pour l'analyse HOMIM ARNr 16S gène microarray, ADN purifié à partir d'échantillons de plaque sous-gingivale a été envoyé au Fonds pour l'HOMIM de base à l'Institut Forsyth (Boston, MA). Cette installation offre une analyse à haut débit de ~ 300 des espèces bactériennes orales les plus répandues et fournit un rapport complet des profils bactériens dans les échantillons d'ADN [24] de. Résultats et discussion
Identification des populations bactériennes présentes dans la plaque sous-gingivale qui différencient les individus avec la maladie orale élevée ou faible en Virginie-occidentale d'études antérieures ont trouvé des espèces bactériennes dans le «complexe rouge» être fortement liée à la maladie parodontale [25]. Pour examiner si ces mêmes bactéries ont été associés à la maladie par voie orale en Virginie-Occidentale, nous avons utilisé le séquençage des gènes ARNr 16S pour caractériser les bactéries dans la plaque sous-gingivale de participants COHRA diagnostiqués comme ayant une maladie orale faible ou élevée en fonction des examens parodontales (tableau 1, bordé par des pointillés ). Les analyses ont été réalisées en format de plaque à 96 puits, et en raison du coût relativement élevé de séquençage de l'ADN, notre objectif pratique était à la séquence de 96 clones par échantillon, réalisant que nous ne serions pas en mesure de détecter les types de bactéries présentes à basse fréquence. En réalité, le nombre de clones séquencés par échantillon variait de 55 à 133, avec de faibles nombres relatifs à des difficultés à obtenir des séquences de haute qualité pour certains échantillons. Les séquences obtenues ont été analysées par BLAST contre la base de données GenBank qui inclut tous les 16S ARNr séquences de gènes connus, et contre une base de données locale qui a facilité la classification des «types» bactériens basés sur l'identité de séquence ≥95% de. L'évaluation ultérieure des données de séquence en utilisant la Oral Database microbiome humain (HomD) serveur BLAST [26] a donné des résultats presque identiques, sauf pour quelques changements causés par le reclassement des souches de type Clostridiales, qui ont affecté certaines missions à Eubacterium
et Lachnospiraceae.
La phase initiale de séquençage a examiné 2 faible (DB et DC) et 5 haute maladie (DF, DL, DG, DI, DA) participants COHRA. Un faible échantillon supplémentaire de la maladie (DM), évaluée en fonction des critères parodontales, a été obtenue par l'Université Clinique dentaire Virginie-Occidentale et a servi de témoin à faible maladie non COHRA. Le pourcentage d'un type bactérien dans chaque échantillon par rapport au nombre total de clones séquencés (indiqué en bas de chaque colonne) est représentée sur la carte thermique de la figure 1. Comme indiqué précédemment [6], l'augmentation de la diversité bactérienne était évidente dans la plaque de les personnes diagnostiquées avec la maladie orale élevée. Cependant, de manière inattendue un grand nombre de haute maladie types bactériens ont été classés dans le cluster Clostridiales (Selenomonas
, Eubacterium
, Dialister
), qui étaient totalement absents de la plaque de la maladie est faible. Aussi remarquable en haute maladie était la faible fréquence des types bactériens traditionnellement liés à la parodontite (Porphyromonas de
, Tannerella
, Treponema
et Aggregatibacter
). Plaque de faible maladie présentait une population bactérienne nettement différente, incluant principalement Streptococcus
et Veillonella
avec un nombre modéré de Capnocytophaga
. La diversité bactérienne en basse maladie échantillons COHRA était très compatible avec une étude récente, qui a identifié Streptococcus
, Veillonella
et Capnocytophaga
dans 100% des échantillons de plaque obtenues chez des individus avec des cavités orales en bonne santé [27]. Ainsi, tandis que les bactéries associées à la santé bucco-dentaire en Virginie-Occidentale était très réfléchissant d'autres régions des États-Unis, une signature phylogénétique pathogène atypique qui comprend Selenomonas
et d'autres bactéries de cluster Clostridiales semblait être associée à la baisse de la santé bucco-dentaire dans l'Ouest Virginie. Figure 1 Identification des populations bactériennes dans la plaque sous-gingivale de la Virginie-Occidentale. composition bactérienne dans des échantillons de plaque a été déterminée à l'aide de l'ARNr 16S séquençage des gènes dans 2 bas et 5 participants haute COHRA de la maladie par voie orale, un classement basé sur les examens parodontales, et 5 participants à l'étude cognitive, classés en fonction de l'indice des caries. DM est un faible parodontale échantillon de contrôle de la maladie obtenue par l'Université Clinique dentaire Virginie-Occidentale. Chaque case numérotée indique le pourcentage de clones du gène bactérien de l'ARNr 16S par rapport au nombre total de clones séquencés, qui est indiqué en bas de chaque colonne spécifique de type. La couleur de la boîte reflète les chiffres observés.
Participants à l'étude COHRA étaient âgés de 23 à 48, et les participants à l'étude cognitive (âges 73-93) ont fourni un moyen d'évaluer comment les types de bactéries liées à l'état des dents plus tard dans la vie. La santé parodontale des 5 participants à l'étude cognitive inclus dans cette étude a été exceptionnellement bon, comme évident dans les profondeurs de sondage de 3 mm ou moins, présentés dans le tableau 2. Toutefois, comme prévu pour cet âge, une variation considérable a été observée dans la santé des caries (tableau 2, bordé par des lignes en pointillés), avec DT ayant le pourcentage le plus élevé de dents saines, et DAA et DZ ayant le pourcentage le plus élevé de disparus /dents cariées. L'examen des types de bactéries dans la plaque sous-gingivale de DT a révélé principalement Veillonella
, Streptococcus
et (la figure 1) de Capnocytophaga, comme observé pour les participants de COHRA bas de la maladie. En comparaison, DAA et DZ avaient des motifs bactériens qui comprenaient la diversité accrue et la richesse en espèces de Selenomonas
, Eubacterium
et Dialister
, en plus de beaucoup d'autres espèces bactériennes observées chez les participants de haute COHRA de la maladie par voie orale. Statistique de ces données sont cohérentes avec la signature bactérienne de la Virginie-Occidentale âgés avec la perte des dents étant similaire à celui des jeunes Virginie-Occidentale avec la maladie parodontale. Analyses des types bactériens identifiés dans la plaque sous-gingivale
analyse Unifrac [17], qui prend compte distances phylogénétiques, est devenue la méthode de choix pour analyser les différences entre les communautés microbiennes et a été utilisé dans nos études pour fournir une validation statistique des différences dans les environnements de plaque maladie basse et haute. La méthode nécessite un arbre phylogénétique enraciné comme entrée, et nous avons utilisé le serveur RDP pour générer l'arbre, qui est particulièrement adapté pour les alignements ARNr car il emploie Infernal [28] qui est guidé par la structure secondaire prédite. L'arbre a été construit par la méthode de neighbor-joining [29], en utilisant APE R. Il était enraciné en incluant Thermotoga maritima
SL7 comme un exogroupe. L'algorithme Unifrac a été utilisé pour calculer la fraction unique de la longueur des branches pour chaque échantillon. Ces résultats (qui sont des distances phylogénétiques séparant les échantillons individuels) ont été analysées en utilisant une analyse de cluster (UPGMA) et ACoP et des séquences en double ignorées. Comme on le voit sur la figure 2A, PCoA séparée faible maladie d'échantillons malades en deux groupes le long du premier vecteur propre. L'analyse par grappes également divisé faible maladie et des échantillons pathologiques dans différents clades, avec un échantillon DT (T marqué sur la figure 2), l'échantillon malade moins sur la base de la carie issue de l'étude cognitive, le fractionnement au clade la maladie est faible. Soutien aux grappes a été évaluée par des tests jackknife (1000 répétitions; Figure 2B). Lorsque les analyses ont été effectuées à nouveau avec toutes les séquences comme un nouveau libellé malade ou en bonne santé, l'analyse Unifrac trouvé les deux environnements pour être statistiquement différent (P
& lt; 0,001), si oui ou non dupliqués séquences ont été considérées. Figure 2 Analyses statistiques des populations bactériennes présentes dans la plaque de la maladie basse et haute. A) Principal analyse des communautés bactériennes de la plaque sous-gingivale de la Virginie-Occidentale avec une faible maladies bucco-dentaires (bleu coordonnées) par rapport à la plaque de la Virginie-Occidentale avec des degrés variables de la maladie par voie orale (rouge). B) L'algorithme Unifrac a été utilisé pour calculer la longueur de la branche unique pour un sous-échantillon donné. L'analyse typologique scission faible (bleu) et des échantillons malades (rouge) dans différents clades. Soutien aux grappes a été évaluée par des tests jackknife (1000 répétitions). T était l'échantillon moins malades dans l'étude cognitive, selon le classement dans le tableau 2. Le «D» a été retiré de notations d'échantillons dans ces chiffres pour l'analyse de la clarté. Des populations bactériennes dans la plaque en utilisant HOMIM analyses
Depuis séquençage du gène ARNr a révélé une signature bactérienne inattendue dans la plaque de la Virginie-occidentale avec une maladie orale élevée, nous avons demandé si ce modèle pourrait être détectée en utilisant une autre méthode d'analyse du gène ARNr 16S, HOMIM. Dans HOMIM, de multiples amorces sont utilisées pour amplifier initialement ARNr 16S dans un échantillon d'ADN, qui sont ensuite analysés pour déterminer la présence d'ARNr 16S spécifiques de gènes à l'aide de sondes conçues pour optimiser la détection de 272 espèces bactériennes différentes [30]. A la différence de séquençage de l'ARNr 16S, ce qui permet la quantification de la fréquence des clones bactériens, la sortie de lecture pour HOMIM est une intensité relative de signal pour chaque séquence ARNr 16S détectée sur une échelle de 0 à 5. Dans nos études HOMIM résultats sont présentés comme la somme des signaux pour tous les taxons orale au sein de chaque genre. Les comparaisons de HOMIM et la séquence d'ADN des analyses des échantillons de plaque de 4 faible maladie (DB, DC, DM, DT) et la 5 plus élevée maladie (DA, DI, DG, DZ, DAA) les participants à notre étude sont présentés dans la figure 3. HOMIM analyse de la plaque de faible maladie détecté une fréquence élevée de Veillonella
, Streptococcus
et Capnocytophaga
, en parallèle étroitement résultats du séquençage de l'ARNr 16S (figure 3A). types bactériens Moins répandus détectés dans le séquençage de l'ARNr 16S, comme Gemella
, Fusobacterium
, Actinomyces
, Granulicatella
, Neisseria
et Haemophilus
, ont été confirmées par HOMIM. types bactériens supplémentaires, probablement à une fréquence trop faible pour détecter par séquençage, ont également été détectés en basse maladie en HOMIM, la plus évidente qui étaient Campylobacter
, Prevotella
, Leptotrichia
, Lautropia
et Aggregatibacter
. Ces résultats mettent en évidence les différences qui peuvent être observées entre le séquençage de l'ADN et HOMIM due aux méthodologies employées dans HOMIM qui peut augmenter la sensibilité de détection des espèces bactériennes spécifiques par 10 fois. Figure 3: Comparaison des gènes ARNr 16S analyses utilisant le séquençage et HOMIM. La fréquence des types bactériens (en pourcentage), déterminée par séquençage de l'ARNr 16S, de 4 échantillons de plaque de faible maladie et 5 échantillons de plaque de haute maladie Ouest Virginiens, classés en fonction de critères définis dans Matériels et Méthodes, a été comparée à l'intensité du signal de microréseau obtenus à partir des mêmes échantillons dans HOMIM analyses. types bactériens au-dessus de la ligne rouge étaient plus fréquentes en basse maladie.
Dans la plaque d'individus avec une grande maladie, HOMIM analyses ont confirmé la présence des genres de l'ordre Clostridiales, y compris Selenomonas
, Eubacterium
et Dialister
(figure 3B). Notamment, comme les données de séquençage, les bactéries dans le «complexe rouge» étaient absents ou présents à des niveaux faibles dans les analyses HOMIM. Comme plaque faible de la maladie, les signaux disproportionnellement plus élevés pour certaines bactéries, en particulier Campylobacter
, Prevotella
et Leptotrichia
, ont été observés dans l'analyse HOMIM par rapport au séquençage, a de nouveau expliqué par la sensibilité accrue des méthodes de détection des microréseaux. Fait important, les conclusions de HOMIM analyses confirment ceux du séquençage de l'ARNr 16S, et identifié des signaux de haute intensité pour Selenomonas
, Eubacterium
et Dialister
en association avec un déclin de la santé bucco-dentaire accrue genre richesse et.
Origin des types de bactéries dans la plaque de morbidité élevée
arbres phylogénétiques de types bactériens développés en utilisant 16S séquençage de l'ARNr également permis de mieux comprendre l'origine des signatures bactériennes associées à la maladie orale élevée. Par exemple, la comparaison des séquences de gènes 16S ARNr a révélé que spp Selenomonas diverses. ont effectivement été répétées colonisateurs de l'environnement orale élevée de la maladie. L'arbre ARNr 16S représenté sur la figure 4 montre la grande diversité des Selenomonas de les phylotypes récupérés dans un seul échantillon de plaque d'un sujet élevé de la maladie (DA). En revanche, le même clade dans un échantillon provenant d'un sujet faible de la maladie (DB) ne contenait qu'une faible diversité de Veillonella des phylotypes. L'ordre Clostridiales a sa mission phylogénétique dans les Firmicutes (généralement à Gram positif), mais il comprend une grande famille, Veillonellaceae, qui sont anaérobies strictes qui tachent à Gram négatif en raison d'une membrane pseudo-externe poreuse. Faible maladie Veillonella
ont des séquences presque identiques typiques d'une seule espèce (& gt; 97% ARNr 16S d'identité de séquence du gène), tel que représenté sur la figure 4. Dans nos études, nous avons trouvé le groupe serré de Veillonella
observé en basse la maladie a été remplacé dans la plaque de haute maladie par une large expansion d'autres membres de la famille Veillonellaceae, comme Selenomonas
et Dialister
. Dans le même temps en haute maladie il y a eu une expansion de Gram-positifs de l'ordre Clostridiales, principalement dans les familles Eubacteriaceae et Lachnospiraceae. L'ampleur de ce groupe bactérien est grande (minimum ~ identité de 85%), ce qui nous a permis de reconnaître que Clostridiales ont été répétées colonisateurs dans la plaque d'individus ayant une maladie orale élevée, tel que représenté par la diversité phylogénétique des Selenomonas
à la figure 4 . Cette constatation est importante, car elle met en évidence le rôle de l'environnement oral (par opposition à l'évolution in situ en raison du transfert horizontal de gènes) dans la génération de signatures bactériennes associées à la maladie orale élevée en Virginie-occidentale. Figure 4 arbres phylogénétiques de Selenomonas et Veillonella isolés à partir des échantillons de plaque individuels. 16S ARNr séquences de gènes à partir d'un seul échantillon élevée de la maladie de la plaque (DA, texte rouge) et un seul faible échantillon de plaque de la maladie (DB, le texte en bleu) ont été utilisés pour générer des arbres phylogénétiques de Selenomonas
et Veillonella
, respectivement. L'axe des abscisses indique la différence pour cent de la séquence du gène de l'ARNr 16S. Les grappes séparées de Selenomonas
montrent que cette population est descendu de colonisant indépendamment mais les bactéries phylogénétiquement lié. Conclusions de Veillonella
de DB exposa diversité limitée.
L'étiologie de la mauvaise santé bucco-dentaire conduisant à des statistiques de perte élevée de dents en Virginie-Occidentale est inconnue. Le but de cette étude était de mieux comprendre ce problème en utilisant 16S gène ARNr analyse pour caractériser les espèces bactériennes en plaque sous-gingivale de la Virginie-Occidentale ayant une maladie orale élevée. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.
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