Résumé de l'arrière-plan
gingivale surcroissance (GO) est une commune des effets secondaires de l'utilisation chronique de cyclosporine (CsA), un immunosuppresseur largement utilisé pour prévenir le rejet chez les patients transplantés. Des études récentes ont rapporté des taux élevés de cytokines spécifiques dans le tissu gingival, en particulier la prolifération de TGF-bêta, ce qui suggère que ce facteur de croissance joue un rôle dans l'accumulation de matériaux de matrice extracellulaire. L'efficacité de l'azithromycine, un antibiotique macrolide, dans la régression de cet effet secondaire indésirable a également été démontrée.
Méthodes
Dans cette étude, nous avons créé un modèle expérimental pour évaluer l'effet thérapeutique de la roxithromycine dans GO et l'expression du facteur de croissance transformant bêta (TGF-bêta 2) par immunohistochimie. Nous avons utilisé quatre groupes de rats totalisant 32 personnes. GO a été induite pendant cinq semaines et le traitement médicamenteux a été donné sur la 6e semaine comme suit: groupe 1 a reçu une solution saline; groupe 2 a reçu la CsA et a été traitée avec une solution saline sur la 6ème semaine; le groupe 3 a reçu de la CsA et, 6ème semaine, l'ampicilline; et le groupe 4 a reçu la CsA pendant 5 semaines et, la sixième semaine, a été traitée avec de la roxithromycine.
Résultats Les résultats ont démontré que le traitement roxithromycine est efficace pour réduire GO induite par la cyclosporine chez les rats. Deux épithélial et le tissu conjonctif ont montré une diminution de l'épaisseur et une réduction significative de l'expression du TGF-bêta2, avec un nombre réduit de fibroblastes, la réduction des zones fibrotiques et diminution de l'infiltrat inflammatoire.
Conclusion Les données actuelles suggèrent que la la régulation de l'expression du TGF-beta2 peut être un important mécanisme d'action par lequel la roxithromycine inhibe GO
matériel supplémentaire électronique
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Contexte
gingivale surcroissance (GO) est un effet secondaire courant de certains médicaments, tels que la phénytoïne, les bloqueurs des canaux calciques et cyclosporine [1, 2].
cyclosporine (CsA) a été largement utilisé pour prévenir le rejet de greffe d'organe et de traiter divers immunodiseases [2]. Elle supprime sélectivement la fonction des lymphocytes T helper et module le réseau des cytokines inflammatoires. Cependant, la CsA est associée à plusieurs effets indésirables, tels que la néphrotoxicité, hépatotoxicité, hirsutisme et hyperplasie gingivale (GO) [1, 3, 4]. La prévalence moyenne des patients transplantés dentés qui développent la cyclosporine induite GO est d'environ 30%, avec une variation entre 10 et 85% [5-9]. Lorsqu'il est associé à d'autres médicaments, tels que les antihypertenseurs bloqueur des canaux calciques, cette prévalence augmente, comme le fait de la gravité de la complication, et, par conséquent, le risque [10-13].
Fibrose, l'un des résultats les plus importants de GO est le résultat d'une variété de signaux biochimiques à partir de nombreux types cellulaires, y compris des cellules inflammatoires et des fibroblastes, qui stimulent la prolifération des fibroblastes et la production de matrice extracellulaire [14]. La bêta du facteur de croissance transformant (TGF-bêta) est une famille multifonctionnelle de cytokines présentes dans cette voie et il existe trois isoformes de mammifère de TGF-bêta (TGF-beta1, TGF-beta2 et TGF-bêta 3), qui sont structurellement similaires [15 ]. les niveaux de TGF-beta1 accrus ont été associés dans la fibrose rénale induite par la cyclosporine [16]. La plupart des études plaident en faveur du TGF-beta1 dans le hyperplasie gingivale CsA-induite. Cependant, un petit nombre d'études ont porté sur l'expression du TGF-bêta2 dans cet état pathologique [15, 17]. Le TGF-bêta 2 est considérée comme une cytokine immunosuppressive modulée par la ciclosporine, qui joue un rôle central lors de la formation de fibroses et de la réaction inflammatoire [18-20]. Récemment, il a été démontré que la roxithromycine a un effet inhibiteur sur la production de TGF-βbeta par les cellules mésangiales humaines, et peut être efficace dans le traitement de la glomérulosclérose [21]. Par conséquent, cet antibiotique macrolide ayant des caractéristiques similaires de l'azithromycine, est connu pour avoir des propriétés anti-inflammatoires, immunomodulatrices et tissulaires effets réparatrices outre son activité bactériostatique peut être une alternative thérapeutique dans le traitement d'hypertrophie gingivale. Récemment, nous avons publié une étude avec des résultats intéressants chez les patients transplantés rénaux dans lequel le hyperplasie gingivale a été réduite après traitement roxithromycine [22]. Dans la présente étude, nous avons étudié l'effet de la roxithromycine sur GO chez les rats traités avec la cyclosporine. Nos résultats indiquent que la roxithromycine réduit GO et en bas-régule l'expression du TGF-beta2 dans les tissus gingivaux.
Méthodes
Trente-deux de 6 semaines rats Wistar mâles âgés (Rattus novergicus albinun
), pesant 100 à 150 g. ont été choisis au hasard et répartis également en quatre groupes de huit animaux chacun. Les rats témoins (groupe 1) ont été quotidiennement injection sous-cutanée avec une solution saline. Les rats expérimentaux (groupe 2) ont été traités par injection sous-cutanée de la CsA dans une dose journalière de 10 mg /kg pendant six semaines et, au début de la sixième semaine, elles ont été injectées par voie sous-cutanée avec une solution saline. Groupe 3 était similaire au groupe 2, mais dans la dernière semaine, il a été traité avec 50 mg /kg d'ampicilline (un antibiotique largement utilisé dans les infections parodontales) par l'intermédiaire d'une alimentation gastrique. Dans le groupe 4, les animaux ont reçu CsA par jour pendant 6 semaines et dans la dernière semaine, ils ont été traités avec 40 mg /kg par roxithromycine alimentation gastrique. Les rats ont été pesés chaque semaine et la posologie a été ajustée en conséquence. . L'alimentation et l'eau potable ont été donnés ad libitum
pendant l'expérience
Macroscopie analyse
À la fin de la période expérimentale, tous les animaux ont été sacrifiés au moyen d'un surdosage de l'anesthésie (Kensol
® - 10 mg /kg et Vetanarcol ® - 90 mg /kg). Pour étudier les altérations gingivales au fil du temps, les modèles de pierre ont été faites à partir d'empreintes de silicone de la région antérieure du maxillaire. Plus bucco-linguale largeur et la largeur mésio-distale du segment antérieur de l'os maxillaire ont été mesurées en utilisant un pied à coulisse numérique.
Histopathologie et histomorphométrie
Tous les échantillons obtenus gingivaux ont été fixés dans 10% de formaline tamponnée (pH 7) pour au moins 24 heures. Après fixation, les échantillons ont été déshydratés dans des concentrations progressivement de l'éthanol (70% à 100%) de plus en plus, dégagé dans le xylène, trempés et inclus dans la paraffine, selon des méthodes histologiques de routine.
Les fragments de paraffine ont été coupées avec un " 820 "microtome Spence et 4 um d'épaisseur des sections ont été obtenues. Tous les échantillons gingivaux ont été inclus dans la paraffine avec la même orientation. Les sections analysées ont toujours montré l'épithélium, le tissu conjonctif et musculaire. Les mesures de histometry ont été réalisées depuis le ephitelium jusqu'à ce que le tissu musculaire. Les coupes histologiques ont été maintenues dans un incubateur à sec, puis les coupes ont été colorées avec de l'hématoxyline et de l'éosine pour une analyse histologique. Histomorphométrie a été réalisée en utilisant les images capturées et évaluées par un Axion Vision (Zeiss, Berlin, Allemagne) système de capture d'image informatisée. Les images ont été capturées à partir de quatre champs microscopiques choisis au hasard pour chaque diapositive histologique, en utilisant l'appareil photo numérique (400 × 100 × grossissement) d'un microscope Axiostar Plus (Zeiss, Berlin, Allemagne) et le nombre de cellules TGF-betapositive ont été comptées.
Les images ont été stockées et soumises à un comptage de cellules inflammatoires et de toutes les cellules de type fibroblaste. Les mesures linéaires ont été faites pour obtenir le diamètre plus élevé de l'épithélium et du tissu conjonctif gingival, en utilisant le marquage numérique.
immunohistochimie
sections de paraffine (4 um d'épaisseur) des tissus fixés au formol ont été obtenus à des profondeurs variables de chaque bloc de tissu. La présence de la protéine TGF-ß2 dans les échantillons gingivaux a été étudiée dans des coupes en paraffine en utilisant la procédure complexe avidine-biotine-peroxydase (ABC), avec une étape supplémentaire de récupération d'antigène avec une solution d'extraction (Dakopatts, Copenhague, Danemark). En bref, les coupes ont été incubées avec un anticorps polyclonal de lapin anti-TGF-bêta2 dilué 1/20 et mises en incubation pendant une heure à la température ambiante (Santa Cruz, Santa Cruz, USA) suivi d'un anticorps de chèvre anti-IgG de lapin biotinylé (Dakopatts, Copenhague, Danemark). Les contrôles de la procédure ABC ont été effectuées en remplaçant l'anticorps anti-TGF-bêta2 avec du sérum de lapin normal, ou en omettant l'anticorps anti-TGF-bêta2. Les sections ont été analysées par microscopie optique et photomicrographies ont été prises avec un microscope Axiostar Zeiss (Zeiss, Allemagne). Le nombre des TGF-beta2 cellules immunoréactives par champ microscopique (400 × grossissement) a été compté dans le tissu conjonctif.
Analyse statistique
données ont été exprimées en tant que moyen et écart-type. ANOVA a été utilisée pour l'évaluation statistique et le test post-hoc de Bonferroni a été utilisé après ANOVA. La largeur de la muqueuse gingivale, le nombre de cellules inflammatoires, toutes les cellules de type fibroblaste et les cellules immunoréactives TGF-beta2 ont été comparés entre les groupes à l'aide de l'étudiant t
-test. Le niveau de signification a été adoptée p
& lt; Résultats de 0,05.
Le manuscrit a été réalisée avec l'approbation du comité d'éthique de la recherche expérimentale sur les animaux par l'Université Fédérale de Juiz de Fora /Brésil (protocole de n ° 039/2005).
Tous cyclosporine rats traités présenté GO qui était évident dans toutes les localisations gingivaux. Le graphique 1 montre les mesures macroscopiques de la largeur buccale-linguale et mésio-distale largeur (p & lt; 0,05). L'analyse macroscopique a révélé une réduction significative de la largeur bucco-linguale et la largeur mésio-distale chez les rats roxithromycine traités (groupe 4) en comparaison avec le groupe 2 et du groupe 3 (schéma 1) (p & lt; 0,05). L'analyse histopathologique a révélé que GO est le résultat de l'élargissement de tissus épithéliaux et conjonctifs (figures 1A, 1B, 1C, 1D). Une acanthose modérée a été observée chez les animaux des groupes 2, 3 et 4. Aucune différence statistique n'a été observée par rapport à l'épaisseur de l'épithélium gingival détecté dans des échantillons obtenus à partir des groupes témoins positifs avec les groupes traités. Une hyperplasie sévère des fibres de collagène a été observée dans les échantillons gingivaux obtenus à partir des groupes 2 et 3. Cependant, l'étude microscopique a révélé une réduction des fibres de collagène dans les échantillons gingivaux des rats traités par rapport aux échantillons gingivaux des rats témoins. Pas de zones fibrotiques ont été observés dans les échantillons gingivaux du groupe 1 (groupe témoin négatif). fibrose extensive est une conclusion commune dans les échantillons gingivaux des groupes 2 et 3, mais un petit nombre de zones fibrotiques ont été observées dans le tissu gingival de roxithromycine rats traités (figure 2). Les mesures de diamètre des tissus épithéliaux et conjonctifs ont été obtenues (figure 3). Les mesures observées dans roxithromycine rats traités (groupe 4) étaient statistiquement inférieurs à ceux observés dans les groupes témoins positifs GO (groupe 2 et du groupe 3). L'analyse histomorphométrique a également démontré que les animaux traités avec la roxithromycine présentaient un plus faible nombre de fibroblastes par champ microscopique (figure 4). L'identification des fibroblastes, basée sur des critères morphologiques, a été faite par deux chercheurs différents. Enfin, un nombre inférieur de cellules inflammatoires a été observée dans les échantillons gingivaux obtenus du groupe roxithromycine traité en comparaison avec le groupe 2 et le groupe 3 (figure 5). une coloration cytoplasmique pour le TGF-beta2 a été détectée dans la plupart des types de tissu conjonctif cellulaire. Le TGF-ß2 a été exprimé dans le tissu conjonctif par des cellules inflammatoires, des fibroblastes et des cellules endotheliales (figure 6). La plupart des fibroblastes et des cellules endothéliales étaient TGF-beta2 positif et a montré un profil de coloration variable généralement faible ou sombre positive (figure 6). L'analyse immunohistochimique a montré une diminution du nombre de cellules TGF-beta2 positives (figure 7) - reconnus morphologiquement comme les fibroblastes, les cellules endothéliales et des cellules inflammatoires dans les échantillons de tissu conjonctif de la roxithromycine rats traités par rapport aux GO contrôles positifs rats (groupe 2 et le groupe 3 ) (figure 7). Aucune différence significative n'a été observée par rapport au nombre de cellules positives pour le TGF-bêta2 dans des échantillons obtenus à partir gingivaux groupe 1 et du groupe 4 (figure 7). Figure 1 mesures macroscopiques des régions maxillaires buccales-linguale et mésio-distale. Résultats exprimés en moyenne et le niveau de signification statistique pour analyser était p & lt; 0,05. G1 (n = 8 animaux) - groupe de contrôle négatif - l'administration d'une solution saline. G2 (n = 8 animaux) - groupe de contrôle positif - l'administration de CsA + solution saline. G3 (n = 8 animaux) - groupe- contrôle positif - l'administration de CsA + AMP. G4 (n = 8 animaux) - groupe traité - administration de CsA + ROX
Figure 2 champs microscopiques représentatifs.. A: tissu conjonctif normal dans le groupe 1 (témoin négatif); B-C: fibrose extensive dans les groupes 2 et 3 (témoins positifs); D: Peu de zones de fibrose dans le groupe 4 (groupe traité). magnificance originale 400 ×.
Figure 3 Mesures de la muqueuse gingivale (épithélium et la lamina propria). Résultats exprimés en moyenne (p & lt; 0,05). G1 (n = 8 animaux) - groupe de contrôle négatif - l'administration d'une solution saline. G2 (n = 8 animaux) - groupe de contrôle positif - l'administration de CsA + solution saline. G3 (n = 8 animaux) - groupe- contrôle positif - l'administration de CsA + AMP. groupe traité - - G4 (n = 8 animaux). administration de CsA + ROX
Figure 4 Nombre de fibroblastes par champs microscopiques. Cinq champs microscopiques avec grossissement de 400 ont été étudiés par des lames histologiques. Résultats exprimés en moyenne (p & lt; 0,05). G1 (n = 8 animaux) - groupe de contrôle négatif - l'administration d'une solution saline. G2 (n = 8 animaux) - groupe de contrôle positif - l'administration de CsA + solution saline. G3 (n = 8 animaux) - groupe- contrôle positif - l'administration de CsA + AMP. G4 (n = 8 animaux) - groupe traité - administration de CsA + ROX
Figure 5 Nombre de cellules inflammatoires par champs microscopiques.. Cinq champs microscopiques avec grossissement de 400 ont été étudiés par des lames histologiques. Les résultats sont exprimés sous forme de moyenne ± écart-type (p & lt; 0,05). G1 (n = 8 animaux) - groupe de contrôle négatif - l'administration d'une solution saline. G2 (n = 8 animaux) - groupe de contrôle positif - l'administration de CsA + solution saline. G3 (n = 8 animaux) - groupe- contrôle positif - l'administration de CsA + AMP. G4 (n = 8 animaux) - groupe traité - l'administration de la figure 6 échantillons représentatifs de CsA + ROX indiqué une expression élevée de TGF-beta2 dans les cellules du tissu conjonctif (groupes 2 et 3); C: Lumière TGF-beta2 de cellules colorées dans le groupe 4. Les flèches rouges - les cellules de coloration négative. Les flèches bleues: cellules de coloration positive. magnificance originale 400 ×.
Figure 7 Nombre de cellules de coloration positive de TGF-beta2 dans le tissu conjonctif par champ microscopique. Cinq champs microscopiques avec grossissement de 400 ont été étudiés par des lames histologiques. Résultats exprimés en moyenne moyenne ± écart type (p & lt; 0,05). G1 (n = 8 animaux) - groupe de contrôle négatif - l'administration d'une solution saline. G2 (n = 8 animaux) - groupe de contrôle positif - l'administration de CsA + solution saline. G3 (n = 8 animaux) - groupe- contrôle positif - l'administration de CsA + AMP. groupe traité - - G4 (n = 8 animaux). administration de Rapport de CsA + ROX
Cyclosporine (CsA) est un polypeptide cyclique neutre hydrophobe composé de onze acides aminés et fabriqués à partir du champignon Tolypocladium inflatuns gams
. Il agit en particulier dans la suppression de la réponse immunitaire à médiation par les lymphocytes T. Elle passe par biotransformation dans le foie, ce qui entraîne 14 produits métaboliques, dont 90% est excrété dans les fèces et 10% sont éliminés par les reins [23] gingivale la surcroissance de. Est l'un des effets secondaires causés par l'utilisation chronique de la cyclosporine (CsA), qui est utilisé pour prévenir le rejet d'organes transplantés et de traiter plusieurs maladies auto-immunes telles que le diabète sucré, la maladie de Behçet, le psoriasis, la sclérose en plaques, le lichen plan érosif, lupus érythémateux disséminé, la pemphigoide bulleuse, l'arthrite rhumatoïde, la myasthénie , uvéite et divers glomerulopathies des niveaux élevés [3, 24, 25] Plusieurs études
. ont démontré de cytokines spécifiques dans la prolifération du tissu gingival, en particulier TGF-bêta, un médiateur inflammatoire multifonctionnel, ce qui suggère que ce facteur de croissance joue un rôle l'accumulation de la matrice extracellulaire [14, 25, 26], y compris des protéines collagéniques [27, 28]. Les isoformes du TGF-bêta peuvent être exprimées par la plupart des cellules, y compris les cellules inflammatoires gingivaux, les cellules endothéliales et les fibroblastes [17]. TGF-beta1 gingival Elevated et TGF-beta2 ont été proposées par l'étude immunohistochimique sur phénytoïne et induite par la nifédipine-GO [29]. et nos données indiquent des niveaux d'expression de TGF-beta2 sur GO induite par la cyclosporine élevée.
GO traitement comprend enlever la plaque bactérienne, le maintien de l'hygiène buccale adéquate, et comprend également des procédures invasives, telles que gingivectomie. Le traitement de cette complication, jusqu'à récemment, était seulement chirurgicale. De nos jours, plusieurs études ont été menées pour déterminer l'effet du traitement antibiotique sur la régression de hyperplasie gingivale. En 1995, Wahlstrom, Zamora et Teichmann utilisés par hasard azithromycine - un antibiotique semi-synthétique, dérivé de l'érythromycine macrolide - pour traiter les infections respiratoires chez deux patients transplantés rénaux qui avaient cyclosporine induit GO. Ils ont observé une réduction gingivale après l'avoir utilisé. Le traitement quotidien avec 500 mg pendant cinq jours est simple, pas cher, conservateur, rapidement efficace, et évite la chirurgie gingivale. Il agit principalement contre les bactéries gram-positives et négatives, a une absorption orale rapide, ne modifie pas les taux sériques de cyclosporine ou les niveaux de créatinine. L'azithromycine est bien toléré et associé un programme efficace d'hygiène buccale induisent une réduction de la hyperplasie gingivale [28], mais peut produire des effets secondaires, tels que la diarrhée, des douleurs abdominales, des nausées et des vomissements [28-33].
Récemment, nous avons utilisé la roxithromycine chez quatre patients transplantés rénaux et les résultats suggèrent que la roxithromycine peut être un outil thérapeutique important utilisé pour réduire induite cyclosporine-GO [22]. Yamabe et al. (2006) ont suggéré que l'utilisation de la roxithromycine a un effet inhibiteur sur la production de TGF-bêta par les cellules mésangiales humaines, et peut être efficace dans le traitement de la glomérulosclérose. Les mécanismes qui roxithromycine inhibe la production de TGF-bêta ne sont pas claires, mais dans cette étude, le médicament n'a pas inhibé l'activation de la tyrosine kinase et MAP kinase par la thrombine. Roxithromycine a supprimé la translocation induite par la thrombine du NF-kB protéine p65 dans le noyau. Il est suggéré que l'activation de NF-kB régule la production de TGF-bêta, ainsi ROX inhibe la production de TGF-bêta par l'intermédiaire de l'inhibition du NF-kB.
Conclusion
Dans la présente étude, les résultats ont démontré que le traitement était roxithromycine efficace pour réduire GO induite par la cyclosporine chez les rats. Les deux tissus épithéliaux et conjonctifs ont montré une diminution de l'épaisseur des rats traités par la roxithromycine en comparaison avec les animaux des groupes témoins. En outre, la réduction significative de TGF expression beta2 dans roxithromycine rats traités a été associé à un nombre inférieur de fibroblastes, avec une réduction des zones fibrotiques et la diminution de infiltrat inflammatoire. Pris ensemble, nos données suggèrent que la régulation négative de l'expression du TGF-beta2 peut être un important mécanisme d'action par lequel la roxithromycine inhibe GO
abréviations
AMP:.
Ampicilline
CsA:
ciclosporine
GO:
hyperplasie gingivale
CARTE quinase:
protéines quinase actived par mithogen
NF-kB:
facteur nucléaire kappa B
ROX:
roxithromycine
TGF-beta1:
facteur de croissance transformant beta1
TGF-beta2:
facteur de croissance transformant beta2
UFJF:
Université fédérale de Juiz de Fora
Déclarations Remerciements
soutien financier: FAPEMIG - Rede Mineira de toxicología; Rede Mineira de Bioterismo
auteurs de fichiers originaux soumis pour les images
Voici les liens vers les auteurs de dossiers soumis originaux pour les images. de fichier d'origine pour la figure 1 12903_2008_142_MOESM2_ESM.jpeg Auteurs Auteurs 12903_2008_142_MOESM1_ESM.jpeg fichier d'origine pour la figure 2 Auteurs 12903_2008_142_MOESM3_ESM.jpeg de fichier d'origine pour la figure 3 Auteurs 12903_2008_142_MOESM4_ESM.jpeg de fichier original pour le fichier d'origine de la figure 4 Auteurs 12903_2008_142_MOESM5_ESM.jpeg pour la figure 5 de fichier d'origine pour la figure 6 12903_2008_142_MOESM7_ESM.jpeg auteurs auteurs 12903_2008_142_MOESM6_ESM.jpeg fichier d'origine pour la figure 7 intérêts concurrents
Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun conflit d'intérêts. SC les contributions de
auteurs ont été impliqués dans la rédaction le manuscrit, l'acquisition et l'analyse des données et effectuer l'immunohistochimie. MB a participé à la conception de l'étude et la coordination, comme effectué l'analyse statistique. analyse BV et l'interprétation des données. IM a aidé dans la phase expérimentale, induisant hyperplasie gingivale. LV effectué l'immunohistochimie. FA a participé à la conception de l'étude et la coordination et ont reçu l'approbation finale de la version à publier. Tous les auteurs ont lu et approuvé la version finale du manuscrit.
