Résumé de l'arrière-plan
Les études précliniques soutiennent l'hypothèse que les greffes de tissus conjonctifs préserver l'os alvéolaire de résorption; les mécanismes cellulaires sous-jacents, cependant, restent inconnus. Les mécanismes cellulaires peuvent être attribués à l'activité paracrine des fibroblastes palatines. Il était donc raisonnable de penser que les greffes de tissu conjonctif palatines réduisent la formation des ostéoclastes.
Méthodes
Pour tester cette hypothèse, les fibroblastes palatines humaines ont été examinés pour leur capacité à moduler la formation des ostéoclastes dans des cultures de moelle osseuse de souris exposées à RANKL, M-CSF et TGF-β1. Ostéoclastogenèse a été déterminée par la phosphatase acide résistant au tartrate (TRAP), la coloration et l'analyse de l'expression génique. La formation de cellules présentatrices d'antigènes est basé sur l'expression de CD14 et des molécules costimmulatory des cellules présentatrices d'antigènes. Les résultats de l'interaction paracrine des fibroblastes et la moelle osseuse a été modélisée in vitro avec des inserts de membranes cellulaires-occlusive.
Dans cocultures sans contact cellule à cellule, palatin fibroblastes ont provoqué une diminution de l'expression du marqueur des ostéoclastes des gènes dans les cellules de la moelle osseuse; récepteurs de la calcitonine, la cathepsine K, TRAP et récepteur des ostéoclastes associée. De plus, le nombre de cellules multinucléées positives pour TRAP a été diminuée en présence des fibroblastes. En particulier, des fibroblastes palatines a augmenté l'expression de CD14 et les protéines co-stimulatrices CD40, CD80 et CD86 dans des cellules de moelle osseuse. les cellules de la moelle osseuse n'a eu aucun impact considérable sur les gènes fibroblaste de viabilité et de marqueurs de prolifération. En ce qui concerne la répartition des cellules, les ostéoclastes étaient le plus important dans le centre des membranes, tandis que les fibroblastes accumulés immédiatement adjacente à la frontière de l'insert formant une structure en forme d'anneau sur la surface de la plaque de culture.
Conclusion
La les données indiquent que les fibroblastes palatines fournissent un environnement paracrine qui réduit ostéoclastogenèse et augmente les marqueurs des cellules présentatrices d'antigènes. Morover, le modèle paracrine a révélé une activité conjointe entre les fibroblastes palatines et les cellules de moelle osseuse visualisées par la distribution cellulaire caractéristique dans les deux compartiments séparés.
Mots-clés
fibroblastes palatines ostéoclastes Macrophages Co-culture Inserts murin cultures de moelle osseuse Contexte
palatines greffes de tissu conjonctif sont utilisés en parodontologie pour la couverture des racines et pour traiter les défauts de récession gingivale [1]. greffes de tissu conjonctif palatines ont également été proposées pour améliorer les paramètres esthétiques lorsque l'os vestibulaire est mince ou résorbés en dentisterie implantaire et prothétique [2-6]. En fonction de la technique utilisée, les greffes de tissu conjonctif palatine peuvent être placés en contact direct avec l'os alvéolaire. La question se pose à propos de l'impact possible des greffes de tissu conjonctif palatines sur l'os alvéolaire. Il existe un soutien au moins faible pour un rôle potentiel des greffes de tissu conjonctif dans la préservation de l'os sous-jacent. greffe de tissu conjonctif placé à la face vestibulaire de la paroi osseuse, immédiatement après l'extraction de la dent, a abouti à une conservation raisonnable des tissus durs [7]. En outre, les greffes de tissus conjonctifs gingivaux peuvent réduire la résorption de la crête marginale dans des modèles canins [8]. Pris ensemble, les deux études précliniques appuient l'hypothèse que les greffes de tissu conjonctif peuvent préserver l'os alvéolaire; le mécanisme cellulaire sous-jacent reste cependant inconnu.
Le mécanisme cellulaire peut être attribuée à l'activité paracrine des fibroblastes palatines. Cette hypothèse est étayée par des expériences in vitro avec des fibroblastes gingivaux isolés et leur capacité à influencer ostéoclastogenèse, la formation de cellules osseuses résorbant. Par exemple, le milieu conditionné obtenu à partir de fibroblastes gingivaux et les fibroblastes du ligament parodontal inhibent la formation de cellules ostéoclastes comme dans les cultures de moelle osseuse de la souris [9-11]. Il est donc probable que les facteurs paracrines libérés à partir de fibroblastes palatines peuvent réduire le processus de ostéoclastogenèse. Plus intéressant est de comprendre le mécanisme moléculaire comment les facteurs paracrines libérés à partir de fibroblastes palatines modifient l'expression de gènes représentant les ostéoclastes, mais aussi cellules présentant l'antigène, les deux provenant de cellules précurseurs fom de hématopoïétiques.
Ostéoclastogenèse dans les cultures de moelle osseuse murines nécessite les présences de l'activateur du récepteur du facteur nucléaire kappa-B ligand (RANKL), M-CSF, et les récepteurs respectifs [12]. Les ostéoclastes sont généralement multinucléées et expriment la phosphatase acide résistant au tartrate (TRAP), la cathepsine K (CatK) et le récepteur de la calcitonine (CTR). Ostéoclastes expriment également des molécules co-stimulatrices d'activation du motif d'activation à base de tyrosine d'immunorécepteur (ITAM) voie dépendante [13]. récepteur d'ostéoclastes associé (OSCAR), et le récepteur de déclenchement exprimé dans les cellules myéloïdes (TREM2) sont des récepteurs qui sont associés aux molécules d'adaptateurs respectifs Fc chaîne récepteur gamma commune (FcRy) et DNAX activant la protéine de 12 kDa (DAP 12), respectivement [13] . Lorsque la différenciation se déplace vers un phénotype de macrophage, l'expression de CD14, un co-récepteur pour la signalisation des lipopolysaccharides et les protéines de costimulation CD40, CD80 et CD86, communément exprimée dans les cellules présentatrices d'antigènes telles que les monocytes et les macrophages, lever [14, Objectif de 15]. cette étude pilote présente était d'étudier l'impact de l'environnement paracrine des fibroblastes palatines sur ostéoclastogenèse à partir de précurseurs de la moelle osseuse en utilisant un modèle in vitro où les deux sources de cellules sont séparées par des membranes occlusifs cellulaire.
Méthodes
fibroblaste palatine humain
fibroblastes palatines humains ont été préparés à partir de cultures d'explants de trois donateurs indépendants après l'approbation du comité d'éthique de l'Université médicale de Vienne (EK Nr. 631/2007). Fibroblastes qui a grandi à partir des explants et n'a pas subi plus de cinq passages ont été utilisés. Les fibroblastes ont été cultivés en Dubeccos Modified Eagle Medium (DMEM) avec des antibiotiques (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA)) et étalées à 100.000 cellules /cm
2 dans les plaques à 12 puits respectifs (Greiner-Bio-One GmbH) . Après la période de culture, la coloration du fibroblaste a été réalisée avec DiffQuik (Roche Diagnostic Systems, Bâle, Suisse). Les cellules de moelle osseuse de moelle osseuse murine
cultures ont été préparées par rinçage fémur et tibia de 4 à 8 semaines femelle souris Balb /c (BE76 /12 Veterinärdienst des Kantons Bern) et ensemencées dans ThinCert ™ inserts de culture cellulaire (12 format bien avec des tailles de pores nominales de 0,4, um; Greiner-Bio-One GmbH, Frickenhausen, Allemagne) à un million de cellules par cm 2 minimum Essential Medium-Alpha Modification de Eagle (aMEM) additionné de 10% de sérum de veau foetal (FCS), des antibiotiques, M-CSF à 25 pg /ml, le TGF-β1 à 10 pg /ml, et RANKL à 25 pg /ml. cultures de moelle osseuse ont alors été transférés aux plaques contenant des fibroblastes. Les protéines recombinantes ont été achetées chez Prospec (Ness-Ziona, Israël). Des cellules de moelle osseuse ont été cultivées avec et sans le fibroblaste. Les deux types de cellules restent séparés par la membrane d'occlusion cellulaire des ThinCert ™ inserts de culture cellulaire. Coloration pour TRAP (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) a été réalisée à cinq jours. Expression de cellules ont été considérés comme des ostéoclastes lorsqu'elle est positive pour TRAP et ayant trois ou plusieurs noyaux comme observé par microscopie optique. des gènes marqueurs dans les cultures de moelle osseuse murines
ARN a été isolé à partir des cultures de moelle osseuse et les fibroblastes palatines utilisant le haut pur Kit d'isolation d'ARN (Roche Applied science, Rotkreuz, Suisse). Transcription inverse (RT) a été réalisée avec Transcriptor Universal ADNc Master, et PCR analyses ont été effectuées en triple en utilisant TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) ou le FastStart Universal Probe Maître Rox sur un système de PCR en temps réel 7500 ( Roche). cellules de moelle osseuse ont été analysés pour les gènes suivants: SybrGreen: RANK, C-FMS, TRAF6, C-FOS, MITF, PU1, NFATc-1, DC-STAMP, ATP6V0D2, CD14, CD40, CD80, CD86, CD11c; TaqMan (Applied Biosystems, Carlsbad, CA): CTR, CATK, TRAP, OSCAR, TREM2, DAP12, FcRy. Les fibroblastes ont été analysés pour les gènes suivants: BCL2, PLK1, CCNB1, CCNE1, CCND1, MYBL2, GAPDH, BAD, BAX et BCL-XL. Les données ont été normalisées pour β-actine en utilisant la méthode ΔΔCt (tableaux 1 et 2) .Table 1 SYBRGreen Amorces pour RT-PCR
Gene
Amorce
Amorce
m 18 s
tccagcacattttgcgagta
cagtgatggcgaaggctatt
m βactin
ctaaggccaaccgtgaaaag
accagaggcatacagggaca
m RANK
gtgctgctcgttccactg
agatgctcataatgcctctcct
m c-fms
gaccatggtgaatggtaggg
ggataacgttgaatcccactg
m TRAF6
ttgcacattcagtgtttttgg
tgcaagtgtcgtgccaag
m c-fos
gcaactttctatgacactgaaacac
tctctctagggctgcattgg
m MITF
gacaccagccataaacgtca
ttttccaggtgggtctgc
m PU1
ggagaagctgatggcttgg
caggcgaatctttttcttgc
m NFATc-1
ccgttgcttccagaaaataaca
tgtgggatgtgaactcggaa
m DC-Stamp
aagctccttgagaaacgatca
caggactggaaaccagaaatg
m Atp6vOd2
aagcctttgtttgacgctgt
gccagcacattcatctgtacc
m CD14
aaagaaactgaagcctttctcg
agcaacaagccaagcacac
m CD40
gagtcagactaatgtcatctgtggtt
accccgaaaatggtgatg
m CD80
tcgtctttcacaagtgtcttcag
ttgccagtagattcggtcttc
m CD86
gaagccgaatcagcctagc
cagcgttactatcccgctct
m CD11c
gagccagaacttcccaactg
tcaggaacacgatgtcttgg
h βactin
ccaaccgcgagaagatga
ccagaggcgtacagggatag
h BCL2
caggagaatggataaggcaaa
ccagccagatttaggttcaaa
h PLK1
aaccgagttattcatcgagacc
ttggttgccagtccaaaatc
h CCNB1
cctccggtgttctgcttc
ttcagcattaattttcgagttcc
h CCNE1
ggccaaaatcgacaggac
gggtctgcacagactgcat
h CCND1
gccgagaagctgtgcatc
ccacttgagcttgttcacca
h MYBL2
gtcaaatggacccatgagga
gtcagtgcggttagggaagt
h GAPDH
agccacatcgctcagacac
gcccaatacgaccaaatc
h BAD
cgagtttgtggactcctttaaga
caccaggactggaagactcg
h BAX
agcaaactggtgctcaagg
tcttggatccagcccaac
h BCL XL
agccttggatccaggagaa
agcggttgaagcgttcct
Tableau 2 TaqMan Amorces Assay ID pour la RT-PCR
m CTR
Mm 00432282_m1
m CatK
Mm 00484039_m1
m TRAP
Mm 00475698_m1
m Oscar
Mm 00558665_m1
m TREM2
Mm 04209424_g1
m DAP12
Mm 00449152_m1
m FcRy
Mm 02343757_m1
analyse statistique
les cultures cellulaires ont été effectuées en utilisant au moins arbre différent donateurs fibroblaste. Les deux groupes ont été comparés avec le T-apparié
test avec α & lt; Résultats
fibroblastes palatines de 5%. Inhibent les cellules ostéoclastes comme
voie Pour déterminer l'impact des palatine fibroblaste sur ostéoclastogenèse, un modèle de co-culture paracrine basée sur des inserts a été réalisée. Une conclusion principale est que la présence de fibroblastes palatines dans la chambre inférieure a diminué l'expression des caractéristiques des gènes marqueurs des ostéoclastes CTR, CATK, TRAP et OSCAR d'environ 30% (p & lt;
0,05), mais pas l'autre co molécules stimulatrices de ostéoclastogenèse. RANK et c-fms sont également restés inchangés. De plus, la coloration TRAP était visiblement réduite en présence de fibroblaste palatine. nombre d'ostéoclastes en co-culture avec des fibroblastes par région d'intérêt moyenne, choisis au hasard dans chaque puits: 11.7 (SD 6.7). nombre d'ostéoclastes sans fibroblastes par région d'intérêt moyen était de 53,0 (SD 12,8; p & lt;
0,05). Fait important, la présence de fibroblastes palatines a augmenté l'expression de CD14 et les protéines co-stimulatrices CD40, CD80 et CD86 d'environ 2 à 4 fois (p & lt;
0,05) par rapport aux témoins respectifs sans la présence de fibroblastes palatines (Tableau 3). Ainsi, les données étayent le concept selon lequel les fibroblastes palatines favorisent le développement des cellules présentatrices d'antigène plutôt que d'un phénotype d'ostéoclastes. les cellules de la moelle osseuse n'a pas affecté la viabilité ou la prolifération des fibroblastes palatines, comme indiqué par l'analyse de l'expression des gènes du cycle liés à l'apoptose et des cellules (données non montrées) .Tableau 3 RT-PCR de cellules ostéoclastes analogue (OCL), en collaboration -Culture avec des fibroblastes de palais (PF) à l'aide de M-CSF, RANKL et TGF β1 comparativement aux co-cultures sans PF, avec des valeurs moyennes et écart-type
cible genes
CD14
CD40
CD80
CD86
CTR
CatK
TRAP
OSCAR
Mean
3.13
2.48
1.57
4.31
0.63
0.71
0.75
0.62
Standard Deviation
0.66
0.82
0.53
1.42
0.31
0.34
0.31
0.30
Les gènes étaient groupe de différenciation 14, 40, 80 et 86 (CD), la calcitonine récepteur (CTR), la cathepsine K (CatK), tartrate résistant à l'acide phosphatase 5 (TRAP), le récepteur de type immunoglobuline ostéoclastes associé (OSCAR). Le tableau représente la moyenne et l'écart-type de n = 6
résultant de deux expériences indépendantes avec des fibroblastes provenant de trois donneurs différents. Toutes les valeurs moyennes étaient différentes par rapport aux témoins sans fibroblastes (p & lt;
0,05)
distribution caractéristique des ostéoclastes et palatines fibroblastes dans fibroblaste palatine de l'insert cultures ont eu un impact majeur sur la distribution des ostéoclastes. Ostéoclastes TRAP étaient positifs proéminente dans le centre de l'insert (fig. 1). Un autre phénomène a eu lieu vers la distribution des fibroblastes palatines. Les fibroblastes accumulés immédiatement adjacente à la frontière de l'insert, formant un anneau de haute densité cellulaire (Fig. 1). Ces observations soutiennent essentiellement que les fibroblastes palatine réduisent la formation des ostéoclastes dans un mode paracrine d'action, mais aussi que les cellules de la moelle osseuse peuvent attirer des fibroblastes in vitro. Ainsi, le modèle paracrine basé sur des membranes occlusifs cellulaire avec des cellules de la moelle osseuse dans les inserts et les fibroblastes dans le compartiment inférieur de la plaque de culture a révélé une activité réciproque visualisée par la distribution de la cellule différentielle. Figue. 1 La coloration des fibroblastes dans les puits et les cellules ostéoclastes, comme dans les inserts après incubation des cellules de moelle osseuse de souris pendant 5 jours avec du M-CSF, RANKL et de TGF-β1 (MRT). cultures combinées avec des fibroblastes et des ostéoclastes (a1) ont montré une accumulation des fibroblastes immédiatement adjacentes à la frontière de l'insert, formant un anneau de fibroblastes à une densité cellulaire élevée (a2, a3). En outre, fibroblaste palatine a eu un impact majeur sur la distribution des ostéoclastes: ostéoclastes étaient de premier plan dans le centre de l'insert (a4, a5). Dans les cultures sont pas des fibroblastes étaient présents (b1, b2, b3), le TRAP-coloration des cellules ostéoclastes, comme montré une réduction du nombre et étaient plus uniformément répartie par rapport aux ostéoclastes cellules qui ont une interaction avec des fibroblastes (b4, b5)
Discussion
la principale conclusion de la présente étude était que les fibroblastes palatines créé un environnement paracrine que modérément supprimé ostéoclastogenèse tout en déplaçant la différenciation vers un phénotype macrophage. gènes maîtres d'ostéoclastes ont été régulés à la baisse en présence de fibroblastes, tandis que les gènes caractéristiques des cellules présentatrices d'antigènes ont été régulés à la hausse. RANK et c-fms est resté inchangé suggérant que le décalage de la différenciation ne peut être expliquée par une diminution de la réactivité aux ligands respectifs, avec M-CSF étant critique aussi pour le développement des monocytes. De plus, nous avons observé une caractéristique dans la distribution de cellules in vitro, avec les ostéoclastes qui restent dans les centres des inserts, tandis que les fibroblastes accumulés dans une structure en forme d'anneau.
Ces résultats in vitro sont intéressants parce qu'ils soutiennent essentiellement les observations provenant d'études précliniques que les greffes de tissu conjonctif réduisent la résorption osseuse de la paroi buccale [7, 8]. Il est pas surprenant que ostéoclastogenèse réduite va de pair avec une évolution vers des cellules présentant l'antigène. Des observations similaires ont été faites avec de la salive [15] et la doxycycline et la minocycline a également induit l'expression de marqueurs de cellules dendritiques, CD11c et CD86 dans des cellules de moelle osseuse en présence de RANKL [14]. Pris ensemble, les données donnent un aperçu un éventuel mécanisme paracrine sur la façon dont les fibroblastes palatine peut réduire ostéoclastogenèse tout en soutenant simultanément l'immunité innée indiquée par l'expression de marqueurs de cellules présentant l'antigène, au moins in vitro. Il est clair que ce n'est pas une conclusion, mais plutôt une suggestion soutenue soit nos données préliminaires. Ainsi, les données in vitro et particularily la possible pertinence clinique doivent être interprétés avec prudence.
L'étude pilote a d'autres limitations. Ceci est une étude d'observation montrant un phénomène, alors que les mécanismes moléculaires sous-jacents restent floues. Les facteurs libérés par les fibroblastes palatines qui sont responsables de l'évolution observée de ostéoclastogenèse vers la formation de cellules présentant des antigènes non encore défini en outre reste à déterminer. Un candidat probable est ostéoprotégérine, un leurre-récepteur pour RANKL [12]. Ostéoprotégérine est produit par les fibroblastes, mais qui étendent et, le cas échéant, ce facteur a provoqué l'inhibition de l'ostéoclastogenèse est encore peu clair. De plus, nous avons utilisé un système xénogénique, ce qui pourrait avoir affecté le résultat global; fibroblastes palatines humaines et des cellules de moelle osseuse de souris. Cependant, les molécules jouant un rôle dans la différenciation des ostéoclastes sont évolutives conservées et travaillent donc inter-espèces [16]. Par conséquent, l'utilisation de cellules de l'os de moelle de souris en combinaison avec des fibroblastes humains est approprié comme une expérience de validation de principes qui peut être affiné par l'utilisation future des interspécifique dans des modèles in vitro.
Conclusions
Pris ensemble, le présent étude pilote est une base scientifique pour les recherches futures visant à révéler l'impact de l'environnement paracrine des fibroblastes palatines sur ostéoclastogenèse et l'impact respectif sur le système immunitaire inné. La présente étude est également une amorce d'étudier plus la dynamique du mouvement cellulaire créé par l'environnement paracrine mutuelle.
Disponibilité des données et des matériaux
Les ensembles de données à l'appui des conclusions de cet article sont inclus dans l'article.
Déclarations
Remerciements
Nous tenons à remercier Catherine Solioz pour son aide. L'étude a été soutenue par une subvention ITI 852_2012
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VV a effectué les expériences et a écrit en collaboration avec RG le manuscrit. RG planifié la conception de l'étude, JCS a aidé à établir les méthodes et workted sur les chiffres. AS contribué à rédiger et réviser le manuscrit. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.
