Background
Abstract Dans des études récentes, la santé parodontale a été liée à l'excès de poids et /ou obèses. Parmi les bactéries buccales communes, Selenomonas noxia
a été impliquée dans la conversion de la santé du parodonte à la maladie, et les espèces de Selenomonas ont également été trouvés dans les ulcères gastriques. L'objectif de cette étude était de développer et valider une réaction en chaîne par polymérase quantitative (qPCR) analyse pour la détection spécifique et rapide de S. noxia
. Méthodes
Deux paires d'amorces oligonucléotidiques et une sonde ont été conçues et testés afin de déterminer d'amplification de signal optimale avec trois souches de S. noxia
. Les résultats du test de PCR a été testé contre quatorze organismes non visés, y compris les Selenomonads oraux étroitement apparentés, une bactérie phylogénétiquement étroitement liés, et deux bactéries buccales souvent isolées.
Un des jeux d'amorces était plus sensible à la détection de la cible organisme et a été choisi pour des expériences d'optimisation et de validation. Les amorces conçues et sonde amplifié l'organisme cible avec 100% de spécificité. inhibition de la PCR a été observée avec un contrôle positif interne, et l'inhibition a été résolu en diluant l'extrait d'ADN.
Conclusions
Le test qPCR conçu dans cette étude peut être utilisée pour détecter spécifiquement S. noxia
dans le cadre clinique et dans la recherche future impliquant la détection améliorée de S. noxia
. Le test peut également être utilisé dans les études épidémiologiques pour comprendre le rôle de S. noxia
dans les processus de la maladie, y compris, mais sans s'y limiter, la santé bucco-dentaire et l'obésité d'origine infectieuse.
Mots-clés
bactéries santé parodontale et les maladies Selenomonas noxia
Contexte PCR
Le genre Selenomonas
a été décrite pour la première en 1683 par Antony Van Leeuwenhoek comme une bactérie en forme de croissant à partir d'un échantillon oral [1]. Selenomonas noxia
est une bactérie qui colonise la cavité buccale humaine et a été maintes fois associé à une maladie périodontique [2-4]. Cette espèce est composée de anaérobique obligatoirement, motile, non sporulée, gram négatives tiges [5]. S. noxia
a été parmi les cinq nouvelles espèces du genre Selenomonas
, Phylum Firmicutes, caractérisé pour la première fois par Moore et al
. en 1987 [5]. Les maladies parodontales sont probablement l'une des infections bactériennes les plus fréquentes chez l'homme. Seuls quelques-uns des plusieurs centaines d'espèces de micro-organismes qui ont été identifiés dans la crevasse gingivale et la poche parodontale sont pensés pour jouer un rôle important dans l'initiation et la progression de la maladie [6], et S. noxia
a été parmi les nouveaux organismes ajoutés en tant que pathogène parodontal putative [7]. Très peu de littérature est disponible sur le pathogénicité de S. noxia
, mais le genre Selenomonas
a été trouvé dans des proportions plus élevées par rapport à d'autres bactéries orales dans les cas de parodontite agressive généralisée (GAP). En outre, S. noxia
a été détectée en utilisant la culture et l'ADN à base de techniques dans les deux parodontite chronique (CP) et GAP lésions [8, 9]. Dans une étude menée par Kumar et al.
[10], les échantillons associés à la maladie ont été recueillies à partir des quatre sites les plus profonds chez les sujets atteints de parodontite établie, et les espèces les plus nombreuses par 16S analyse clonale appartenaient aux genres Selenomonas
, Streptococcus
, Veillonella
, Campylobacter
et Peptostreptococcus
. Alors que les clones oraux de Selenomonas ne sont pas associés à la maladie [8], d'autres études ont suggéré que S. noxia
est parmi les principales espèces associées aux sites de conversion santé parodontale à la maladie parodontale [3, 11]. Par ailleurs, dans un rapport publié récemment par Andersen et al.
[12], un -Comme Organism
Helicobacter (HLO) dans la coupe histologique d'un ulcère gastrique humaine a été jugée espèces d'un Selenomonas. La littérature et les études menées à ce jour ne donnent pas de données précises sur la prévalence globale de S. noxia
chez les individus sains.
Techniques moléculaires ont fourni une bonne base pour identifier le rôle des espèces Selenomonas de la santé parodontale indicateurs [8, 13]. Dans une étude utilisant des sondes d'oligonucléotides ciblant la majorité de tous les isolats oraux pour explorer la distribution spatiale des espèces Selenomonas de biofilms en sous-gingivales, une prévalence relativement faible de Selenomonas
a été montré dans les BPA et les patients atteints de CP. Néanmoins, une fluorescence in situ
hybridation (FISH) analyse de la même biofilm a montré que Selenomonas
a apporté une contribution pertinente à l'organisation structurelle des biofilms [9].
Outre le rôle de S noxia
en santé bucco-dentaire., une étude réalisée par Goodson et al.
[14] implique que S. noxia
peut être associé à l'obésité. L'étude a montré que 98,4% des individus en surpoids ont été correctement identifiés par la présence de la bactérie unique, S. noxia
. Cette constatation a fourni un indice pour mieux comprendre l'association et /ou la présence de S. noxia
dans la cavité buccale et le développement de l'obésité. Récemment, il y a eu un intérêt croissant pour comprendre la relation entre la diversité microbienne humaine et d'être en surpoids ou obèses. Compte tenu de la probabilité que la maladie parodontale peut contribuer au développement de l'obésité, le rôle du microbiome par voie orale dans l'obésité a gagné une attention accrue [14]. Le mécanisme par lequel les bactéries orales contribuent au développement de l'obésité est expliqué dans au moins trois manières: augmentation de l'efficacité métabolique, l'augmentation de l'appétit et /ou réorienter le métabolisme énergétique [14]
l'importance clinique et épidémiologique de plus en plus de S. noxia.
nécessite le développement d'une méthode de détection rapide. Jusqu'à présent, les méthodes de détection pour S. noxia
ont été limitées à la culture et l'ADN des tests d'hybridation. analyse de la culture de Selenomonas de spp. est pas courant dans le laboratoire de microbiologie clinique et peut prendre du temps, car il est une bactérie anaérobie obligatoirement fastidieuse. Avec la technique de culture anaérobie, la différence entre la reprise de la salive et la présence sous-gingivale a été importante, ce qui rend cette approche ne convient pas pour une utilisation dans le diagnostic microbien des patients atteints de parodontite [15]. En utilisant la réaction en chaîne par polymérase (PCR), la technique de détection des espèces d'amorces et des sondes d'oligonucléotides spécifiques peut améliorer la détection rapide de S. noxia
. La méthode de PCR quantitative (qPCR) combine la chimie PCR avec détection de fluorescence de la sonde produit amplifié dans le même récipient de réaction, et elle est achevée en deux heures ou moins. L'objectif de cette étude était de développer et valider un test qPCR pour la détection spécifique de S. noxia
. Amélioration de la détection de Selenomonas noxia
dans la microflore buccale est la première étape dans l'élucidation de son implication dans l'obésité et les maladies humaines.
Trois souches différentes de test des organismes de méthodes de S. noxia
ont été obtenus à partir de la American type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) et utilisée pour évaluer le protocole de PCR conçues (Tableau 1). Quatorze organismes non visés, y compris les autres Selenomonads oraux étroitement apparentés, une bactérie phylogénétiquement étroitement liés, et deux bactéries buccales couramment trouvés,
ont été obtenues auprès de l'ATCC et utilisées pour tester la spécificité des amorces conçues et sonde (tableau 1). Tableau 1 les organismes d'essai
espèces bactériennes
ATCC #
Bacillus cereus
14579
Candida albicans
14053
Centipeda periodontii
35019
Klebsiella pneumoniae
4352
Lactobacillus acidophilus
3456
Pectinatus cervisiiphilus
29359
Pseudomonas aeruginosa
27853
Selenomonas artemidis
43528
Selenomonas dianae
43527
Selenomonas flueggei
43531
Selenomonas infelix
43532
Selenomonas noxia
43541
Selenomonas noxia
51893
Selenomonas noxia
700.225
Selenomonas sputigena
35185
Staphylococcus aureus
25923
Streptococcus mutans
25175
extraction d'ADN
Microbial ADN a été extrait en utilisant le kit QIAamp® DNA Mini ( Qiagen, Valencia, CA) selon les instructions du fabricant, avec les modifications suivantes; 100 ul de volume d'échantillon a été utilisé pour l'extraction et le volume d'élution final était de 200 ul. Des échantillons choisis ont été extraits avec le kit ADN du sol d'isolation Ultraclean® (Mobio, Carlsbad, CA). Les extraits d'ADN ont été stockés à -70 ° C jusqu'à utilisation.
La présence et la quantité d'ADN dans chaque échantillon a été mesurée avec un spectrophotomètre Spectronic ™ GENESYS 10 Bio UV-Visible en utilisant l'accessoire NanoCell-0,2 mm de longueur de trajet (Thermo Electron Corporation, Madison, WI) pour analyser des échantillons d'ADN du sous-microlitre en solution. L'essai a été effectué avec 1,5 ul d'échantillon d'essai, après avoir été remis à zéro avec du TRIS-EDTA (TE) (pH 7,4). Mode d'ADN /protéines de concentration (absorbance à 260 et 280 nm avec 320 nm de correction) a été utilisé pour la mesure. Les concentrations d'ADN dans S. noxia
(ATCC 43541, ATCC 700225 et ATCC 51893) ont été compris entre 4,2 et 11,7 ng /ul. Les concentrations variaient de 4,2 à 150,8 ng /ul dans les échantillons non-cibles (données non présentées). Les concentrations de modèles d'ADN utilisés pour la PCR variées, mais sont suffisantes pour obtenir un résultat positif dans un test de présence /absence, sur la base de la sensibilité de l'essai (583 fg /réaction). Le plus apprêt et la conception de la sonde The nucléotidique codante les données de séquence de région et la séquence du génome entier de S. noxia
ont été récupérées à partir du national Center for Biotechnology information, NCBI (http:.... //www NCBI nlm nih gov /génomes /) . l'assemblage de la séquence et de l'alignement ont été comparés en silico
contre toutes les séquences disponibles en ligne avec l'algorithme de base Local Alignment Search Tool (BLAST, NCBI).
L'ARN ribosomal 16S (1491 paires de bases) de S. noxia
(ATCC 43541) a été sélectionné pour concevoir des amorces et des sondes spécifiques en comparant la région V8 de ce gène (voir le tableau 2). Cette région est hautement conservée parmi les membres du genre des Selenomonas, mais plus variable parmi les espèces Selenomonas de. amorces et sondes TaqMan ont été conçus et analysés en utilisant la version du logiciel Primer Express 3 (Life Technologies [Applied Biosystems], Foster City, CA). amorces sélectionnées ont été criblés contre la formation de structures secondaires, y compris la formation de structures en épingle à cheveux, et l'auto-croisées et dimères. La longueur de l'amorce, la température de fusion (T
m), le rapport en G-C et d'autres facteurs ont été fixés comme paramètres par défaut sur le Primer Express software.Table 2 alignements multiples de V8 régions du gène de l'ARNr 16S à partir des espèces de Selenomonas. Numérotation utilisé selon Escherichia coli
gène ARNr 16S [31]
espèces
ATCC #
région V8 (pb de 1268 à 1296)
S. noxia
de 43541
CAGAGGGCAGCGAGAGA-GTGATCTTAAGC
S. artemidis
43528
..... A .........-. CCC.C..GGGC ....
S. flueggei
43531
....... A .......- .. GC.C..G.CGG ...
S. infelix
43532
..... A .........-. CCC.C..GGGC ....
S. sputigena
35185
..... A ................-. C ..........
S. dianae
43527
..... A .........-. CCC.C .. GGGC ....
Deux paires d'amorces et une sonde ont été sélectionnés pour les essais; i) Primer Set 1: SNF1 Primer Forward, TCTGGGCTACACACGTACTACAATG (25 pb) et Reverse Primer SNR1, GCCTGCAATCCGAACTGAGA (20 pb), ii) Primer set 2: SNF2 Primer Forward, GCATGTAAAGATGGGCACTCAA (22 pb) et Reverse Primer SNR2, CCGAACTGAGAAACGGTTTTTG (22 pb); avec des longueurs d'amplicon de 97 et 175, respectivement. La sonde (PNS) sélectionnée pour les deux ensembles d'amorces a été marquée à l'extrémité 5 'avec le colorant rapporteur 6-carboxyfluorescéine (FAM) et l'extrémité 3' avec le colorant rapporteur tétraméthyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA), SnP, [ ,,,0],6 ~ FAM] CAGAGGGCAGCGAGAGAGTGATCTTAAGC [TAMRA]. Les amorces conçues et sonde ont été obtenues à partir d'Eurofins MWG Operon (Huntsville, AL). Les deux ensembles d'amorces ont été testées avec de l'ADN de deux S. noxia
souches de référence (ATCC 43541 et 51893) pour déterminer le signal d'amplification optimale.
Sélection Primer et optimisation PCR
neuf combinaisons différentes, entre 0,2 uM et 0,9 uM des amorces et cinq concentrations différentes de sonde allant de 0,05 uM à 0,25 uM avant et arrière ont été testés avec de l'ADN (600 ug) provenant de S. noxia
souche de référence ATCC 51893 pour déterminer le signal d'amplification optimal. Les paramètres de cyclage de PCR étaient les suivantes: première étape d'incubation de 50 ° C pendant 2 min, la dénaturation de l'ADN de matrice à 95 ° C pendant 10 min, suivie de 40 cycles à 95 ° C pendant 15 s et 60 ° C pendant 1 min . Les conditions de PCR étaient: 1X TaqMan universel PCR mélange maître contenant AmpErase® UNG (uracile-N-glycosylase), l'ADN polymérase AmpliTaq Gold, désoxynucléosides triphosphates, référence passif interne [colorant ROX ™], et des composants tampons optimisés (Applied Biosystems), les amorces ( et SNF1 SNR1or SNF2 et SNR2) à une concentration finale de 0,9 pM, sonde à une concentration finale de 0,2 pM, et 5 pi d'ADN de matrice. de l'eau sans nucléase stérile (Promega, Madison, WI) a été utilisé pour régler le volume de chaque réaction de 25 ul. Les analyses ont été réalisées dans des plaques à 96 puits en utilisant un 7900HT rapide en temps réel du système instrument PCR (Applied Biosystems) en mode standard. Les contrôles négatifs contenant 5 pi d'eau sans nucléase à la place de l'ADN ont été inclus dans chaque essai pour détecter tout ADN contamination croisée. ADN extrait de S. noxia
servi comme témoin positif dans chaque série PCR
contrôle d'amplification interne
A TaqMan exogène interne Contrôle positif disponible dans le commerce. (IPC; Applied Biosystems) a été utilisé pour détecter l'inhibition PCR. Le kit de réactifs inclus 10X Primer Exogène IPC et Probe (VIC ™ Probe) mélange, réactif de blocage 10X Exogène IPC et 50X ADN exogène IPC. L'essai qPCR a été optimisée pour des conditions appropriées pour la détection à la fois l'organisme cible et le contrôle positif interne; par conséquent, une absence ou une diminution de l'amplification de l'ADN CIB dans chaque réaction de PCR multiplex ont indiqué la présence d'inhibiteurs de PCR. Plusieurs dilutions (par exemple, 10 -1 à 10 -6) de chaque échantillon d'ADN ont été testés pour déterminer et éliminer les inhibiteurs potentiels de PCR. Un spectrophotomètre avec l'accessoire NanoCell a été utilisé comme indiqué ci-dessus pour démontrer la présence d'ADN dans les échantillons négatifs non-cibles de PCR PCR Les amplifications Reproduire des données d'analyse de. Ont été réalisées (n = 4). Une fois que l'amplification a été réalisée, les données ont été analysées et tracées (fluorescence en fonction du nombre de cycles) en utilisant le logiciel fourni avec l'instrument 7900HT PCR. Le niveau d'amplification a été signalé par le logiciel comme la valeur seuil de cycle moyen (Ct) d'échantillons répétés. Ct se réfère au cycle de PCR auquel la fluorescence (par exemple, le produit d'amplification) est tout d'abord détecté, et est inversement proportionnelle à la concentration initiale de la matrice d'ADN. Une valeur Ct de 40 ne représente pas l'ADN cible présente
. Résultats
Primer et les résultats de la sonde conception de la protéine Sorter famille (PFS) en utilisant PATRIC a montré 14 protéines uniques pour S. noxia
, mais le protéines BLAST n'a pas trouvé une sortie fiable pour concevoir l'amorce /sonde située dans cette région. Par conséquent, les jeux d'amorces ont été conçues en utilisant la séquence ARNr 16S [GenBank: AF287799]. Les deux ensembles d'amorces, l'amorce set 1 (SNF1, SNR1) et l'amorce set 2 (SNF2, SNR2) amplifié l'organisme cible. Amorce 1 a été trouvé pour produire les valeurs Ct les plus bas, ce qui indique qu'il était plus sensible à la détection de l'organisme cible (tableau 3). Par conséquent, cet ensemble d'amorces a été sélectionnée pour une optimisation supplémentaire et validation experiments.Table 3 résultats PCR quantitative pour S. noxia
détection
organisme cible
Primer fixé
facteur de dilution
100
10-1
10-2
moyenne cycle seuil (Ct) valeur ± SE (N = 2)
S. noxia
(ATCC 43541)
1
11,68 (0,56)
14,99 (0,42 )
17,97 (0,02)
2
13,55 (0,95)
15.51 (1.12) 18.21
(0,16 )
S. noxia
(ATCC 51893)
1
9,39 (0,10)
13,56 (0,08)
16,91 (0,11)
2
11,66 (0,44)
13,35 (0,28)
17,23 (0,11)
optimisation PCR
les neuf combinaisons différentes de concentrations d'amorces testé produit d'amplification de signal optimale dans cinq des neuf combinaisons, comprise entre 19-20 valeurs Ct pour 0,2 uM /0,9 uM, 0,5 /0,5 uM, 0,5 /0,9 uM, 0,9 /0,5 pm et 0,9 /0,9 pm avant et arrière des concentrations d'amorces, respectivement (données non montrées). les résultats d'optimisation de la sonde a montré que trois des cinq concentrations différentes (à savoir, 0,15 uM, 0,2 uM et 0,25 uM) produit les valeurs de Ct plus faible (& lt; 20) (données non présentées). Comme recommandé par le fabricant de l'instrument et du logiciel, 0,9 uM avant et arrière concentrations d'amorces et 0,2 uM concentration de la sonde ont été sélectionnés pour les tests de spécificité. La limite inférieure de détection de l'noxia
test PCR Selenomonas (en utilisant S. noxia
ATCC 51893 comme organisme d'essai) était de 583 fg /réaction.
Amplification PCR quantitative de Spécificité Test de l'organisme cible à l'aide les amorces et les sondes, les conditions de réaction et les paramètres des cycles décrits ci-dessus ont donné lieu à une amplification du fragment de 97 pb attendu à partir des trois S. noxia
souches testées (tableau 4). Le non-cible Selenomonas de spp. testé n'a pas amplifier avec les amorces conçues et sonde. Les organismes non-cibles restantes ont également été pas amplifiés avec le test 16S qPCR développé (tableau 4) .Table essais 4 Spécificité de S. noxia
essai de qPCR l'Organisme d'essai
ATCC #
Résultats
PCR
Bacillus cereus
14579
négatif
Candida albicans
14053
négatif
Centipeda periodontii
35019
négatif
Klebsiella pneumoniae
4352
négatif
Lactobacillus acidophilus
3456
négatif
Pectinatus cervisiiphilus
29359
négatif
Pseudomonas aeruginosa
27853
négatif
Selenomonas artemidis
43528
négatif
Selenomonas dianae
43527
négatif
Selenomonas flueggei
43531
négatif
Selenomonas infelix
43532
négatif
Selenomonas noxia
43541
positive
Selenomonas noxia
51893
positive
Selenomonas noxia
700.225
positive
Selenomonas sputigena
négatif
Staphylococcus aureus 35185
25923
Negative
Streptococcus mutans
25175
inhibition de la PCR négative
Le gène cible a été amplifié dans toutes les concentrations d'ADN testé de trois S. noxia
souches. Toutefois, la PCR IPC a révélé la présence d'inhibition de la PCR, et les extraits d'ADN a nécessité une dilution (10 -4-10 -5) pour éliminer les inhibiteurs (tableau 5) .Tableau 5 résultats montrant l'inhibition de la PCR S . noxia
échantillons
résultats
PCR (valeurs Ct)
Sample
dilution
échantillon
IPC
S. noxia
(ATCC 43541)
100
14,60
15.01
40.00
40.00
10-1
17,76
17,94
40.00
40.00
10-2
21.30
21.23
40.00
40.00
10-3
24,79
24,71
40.00
31.21
10-4
28.13
28.01
28.08
28.11
S. noxia
( ATCC 51893)
100
13,36
13,24
40.00
40.00
10-1
15,34
15,45
40.00
40.00
10-2
19,59
19,26
40.00
40.00
10-3
22,54
23.05
40.00
40.00
10-4
28.29
28.23
40.00
40.00
10-5
30,80
30,77
28.08
28,93
S. noxia
(ATCC 700225)
100
20.90
20.00
40.00
40.00
10-1
ND1
ND1
ND1
ND1
10-2
22,92
23.00
40.00
40.00
10-3
26,68
26,48
40.00
40.00
10-4
29,95
30.11
28,53
28.22
10-5
33.53
33.53
27.73
28.06
Non contrôle de modèle
40.00
40.00
28.40
28.12
1Non déterminé
dilutions (10 -1 à 10 -6) étaient nécessaires pour éliminer les inhibiteurs dans les extraits d'ADN non-cibles (tableau 6). En l'absence d'inhibition, l'ADN IPC (à savoir, pas de contrôle de modèle) amplifié avec une valeur Ct moyenne de 29,4 ± 0,3 (erreur standard; S.E.). Il était nécessaire de diluer l'ensemble des échantillons d'ADN, cible et non-cible, pour éliminer les inhibiteurs. Tous les extraits d'ADN non-cibles ont donné des résultats négatifs (Ct = 40) pour le S. noxia
test PCR, même lorsque les inhibiteurs de PCR ont été éliminés par dilution de l'échantillon. Ces échantillons négatifs non-cibles de PCR contenaient de l'ADN comme démontré par spectrophotométrie avec l'accessoire NanoCell (données non présentées) .Table 6 données montrant la dilution à laquelle l'inhibition a été résolu (n = 2 pour tous les échantillons, sauf ceux en gras qui se composait de quatre répétitions)
résultats de la PCR (moyenne de la valeur Ct)
Sample
dilution
IPC
Bacillus cereus
1.00E + 00
40.00
1.00E-02
40.00
1.00E-04
40.00
1.00E-05
31.43
1.00E-06
29,48
Candida albicans
1.00E + 00
40.00
1,00E-01
30,76
Centipeda periodontii
1.00E + 00
40.00
1,00E-02
40.00
1,00E-03
40.00
1,00E-04
29.01
Klebsiella pneumonie
1.00E + 00
40.00
1,00E-01
30,42
Lactobacillus acidophilus
1.00E + 00
40.00
1,00E-01
40.00
1,00E-02
40.00
1,00E-03
29,84
Pseudomonas aeruginosa
1.00E + 00
40.00
1,00E-01
30,47
Pectinatus cerevisiiphilus
1.00E + 00
40.00
1,00E-01
40.00
1,00E-02
40.00
1,00E-03
28.70
Staphylococcus aureus
1.00E + 00
40.00
1,00E-02
40.00
1.00E- 29,73
Selenomonas artemidis
1.00E + 00
40.00
1.00E de 03
-01
40.00
1,00E-02
40.00
1,00E-03
28,72
Selenomonas dianae
1.00E + 00
40.00
1,00E-01
40.00
1,00E-02
40.00
1,00E-03
28.22
Selenomonas flueggeii
1.00E + 00
40.00
1,00E-01
40.00
1.00E-02
40.00
1,00E-03
28.82
Selenomonas infelix
1.00E + 00
40.00
1,00E-01
40.00
1,00E-02
29.32
Streptococcus mutans
1.00E + 00
40.00
1,00E-01
< Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.
