Résumé de l'arrière-plan
Porphyromonas gingivalis
a été montré pour envahir ostéoblastes et inhiber leur différenciation et la minéralisation in vitro. Cependant, il est difficile de savoir si P. gingivalis
peuvent envahir ostéoblastes in vivo et comment cela aurait une incidence sur la dynamique alvéolaires ostéoblastes /ostéoclastes. Cette étude vise à répondre à ces questions en utilisant un modèle parodontite de la souris sous les inoculations de P. gingivalis répétitifs.
Méthodes
Pour 3-month-old souris femelles BALB /cByJ, 10
9 CFU de P. gingivalis
inoculés sur le rebord gingival des molaires maxillaires 4 fois à des intervalles de 2 jours. Après 2 semaines, un autre 4 inoculations à des intervalles de 2 jours ont été appliqués. Calcéine a été injecté 7 et 2 jours avant de sacrifier l'animal à étiqueter l'os nouvellement formé. Quatre semaines après l'inoculation finale, les souris ont été sacrifiées et maxillaires recueillies. Immunohistochimie, micro-CT et histomorphométrie osseuse ont été réalisées sur les échantillons. infection Sham avec le seul véhicule était le contrôle
. Résultats
P. gingivalis
a été trouvé pour envahir épithéliums gingival, fibroblastes du ligament parodontal, et les ostéoblastes alvéolaires. Micro-CT a montré la résorption osseuse alvéolaire et une réduction significative de la densité minérale osseuse et la teneur chez les souris infectées par rapport aux témoins. L'histomorphométrie osseuse a montré une diminution des ostéoblastes, une augmentation des ostéoclastes et la résorption osseuse, et de manière surprenante une augmentation de la formation osseuse ostéoblastique chez les souris infectées par rapport aux témoins.
Conclusions
P. gingivalis
envahit ostéoblastes alvéolaire dans la modèle de souris de la parodontite et provoquer la perte d'os alvéolaire. Bien que P. gingivalis
semble supprimer la piscine ostéoblastique et d'améliorer la résorption osseuse ostéoclastique, la capacité de formation de l'os est temporairement élevés chez les souris infectées éventuellement par l'intermédiaire des mécanismes compensational anti-microbiens,.
Mots-clés
ostéoblastes P. gingivalis matériel supplémentaire
Invasion Micro-CT os histomorphométrie électronique
La version en ligne de cet article (doi:. 10 1186 /1472-6831-14-89) contient du matériel supplémentaire, qui est disponible pour les utilisateurs autorisés <. br> Contexte
parodontite affecte jusqu'à 20% de la population mondiale [1]. Il est une indication de la mauvaise santé buccodentaire et est liée à une mauvaise santé générale et une qualité de vie compromise, en particulier dans la population gériatrique [2]. La caractéristique de la parodontite est une perte de connectivité entre la dent, les tissus parodontaux, et de l'os alvéolaire. La destruction du tissu et de la résorption osseuse des résultats de la formation de la poche parodontale, un espace sous-gingivale élargie qui constitue un habitat de protection pour les micro-organismes parodontaux. Le développement de la parodontite est un processus multifactoriel tournant autour des interactions hôte-microorganisme complexes [3]. P. gingivalis
est anaéorobe noir pigmenté Gram négatif qui colonise la crevasse sous-gingivale, et a été identifié comme l'un des principaux agents pathogènes parodontaux. Il a de multiples facteurs de virulence connus qui contribuent à sa survie dans l'environnement buccal, comme fimbriae, gingipains, lipopolysaccharides (LPS), capsule, et hémagglutinines [4].
Preuve abondante indique que plusieurs composantes de P. gingivalis
peut agir sur les ostéoblastes pour inhiber la formation de l'os alvéolaire. Les LPS de P. gingivalis, des lipides, des produits métaboliques et les extraits soniquées peuvent inhiber la différenciation et l'ostéogenèse des ostéoblastes [5-10], et moduler RANKL (activateur du récepteur du nucléaire ligand facteur-kappaB) et /OPG (ostéoprotégérine) expression ou dans les ostéoblastes pour stimuler indirectement ostéoclastogenèse [11-14]. Récemment, notre laboratoire a établi que P. gingivalis
peuvent envahir ostéoblastes et inhiber leur maturation et la minéralisation in vitro [15], et fimbriae jouer un rôle important dans la médiation du processus invasif initial [16].
Pathogènes parodontales ont été montré pour empiéter sur la surface alvéolaire et d'occuper des lacunes vide chez les patients atteints de parodontite sévère [17]. On ne sait pas si P. gingivalis
peuvent envahir ostéoblastes in vivo, et si oui, comment cela pourrait influencer l'homéostasie osseuse sur les sites infectés. Les souris n'ont pas P. gingivalis
dans le cadre de leur microflore buccale endogène [18]. Cependant, la parodontite et la perte d'os alvéolaire ont été induites chez des souris avec succès par inoculation intra-orale de P. gingivalis en direct
[19-21]. L'objectif de la présente étude est d'étudier l'invasion des ostéoblastes alvéolaires par P. gingivalis
, et comment le couplage ostéoblastique-ostéoclastes est affecté par une infection bactérienne dans un modèle parodontite de la souris sous les inoculations de P. gingivalis répétitives. On a constaté que P. gingivalis
a pu envahir les cellules parodontales et de perturber l'homéostasie des ostéoblastes et les ostéoclastes, ce qui contribue finalement à perte d'os alvéolaire.
Méthodes de Bactéries et conditions de culture
P. gingivalis
souche ATCC 33277 a été cultivé en anaérobiose à 37 ° C dans une chambre anaérobie Coy sous une atmosphère de 86% d'azote: 10% de dioxyde de carbone: 4% d'hydrogène. Le milieu de culture était de Trypticase Soy Broth (TSBY) supplémenté avec 5% d'extrait de levure, le bicarbonate de sodium à 2%, 7,5 uM d'hémine et 3uM ménadione. TSB plaques de gélose au sang (BAP) ont été faites avec l'addition du sang de mouton à 5% et 1,5% d'agar. Les bactéries ont été inoculées à partir de BAP dans 5 ml de TSBY et mises en culture dans des conditions anaérobies pendant 18 à 24 heures à 37 ° C, puis on le dilue dans TSBY et cultivées jusqu'à la phase logarithmique précoce. Les cellules bactériennes ont été récoltées par centrifugation à faible vitesse, lavées et remises en suspension dans un tampon phosphate salin (PBS). La concentration des bactéries a été déterminée avec un spectrophotomètre à une densité optique de 600 nm (DO = 1 10 9P. Gingivalis
par ml). 10 9 UFC de P. gingivalis vivants
a été recueilli et sédimentées par centrifugation à faible vitesse, puis remis en suspension dans 20 ul de PBS avec 2% de carboxyméthylcellulose. La suspension bactérienne a été appliquée à la marge gingivale de molaires maxillaires de souris comme détaillé ci-dessous.
Inoculations bactériennes
Un modèle de parodontite de la souris a été établi avec une légère modification de la méthode décrite précédemment [22]. En bref, 10-12 semaines d'âge des souris femelles BALB /cByJ ont été conservés dans des agents pathogènes spécifiques environnement libre. Ils ont reçu kanamycine à 1 mg /ml dans déionisée l'eau ad libitum pendant 7 jours. Trois jours après le traitement aux antibiotiques, les souris ont été placées sous brève anesthésie à l'isoflurane et 10 9 UFC de P. gingivalis vivants
dans 20 ul de PBS avec 2% de carboxyméthylcellulose a été appliquée à la marge gingivale de molaires maxillaires de souris quatre fois, 2 jours d'intervalle. Les souris ont été retenus par les aliments et la consommation d'eau pendant 1 heure après l'inoculation. Nous avons utilisé une concentration d'inoculation de 1 x 10 9 UFC, puisque notre étude préliminaire a montré que cette concentration était suffisante pour induire l'invasion de P. gingivalis de parodonte et perte d'os alvéolaire. groupe infecté Sham a reçu 20 pi de PBS avec 2% carboxyméthylcellulose seul. Deux semaines plus tard, quatre autres doses (2 jours d'intervalle) ont été appliqués à des souris. Quatre semaines après la seconde provocation par voie orale, les souris ont été sacrifiées et des échantillons ont été prélevés maxillaires pour les micro-CT et des études de histomorphométrie osseuse. Pour P. gingivalis de l'étude de l'invasion, l'immunohistochimie a été réalisée sur des échantillons de maxilla collectés 3 jours après trois périodes de inoculations bactériennes. Dix animaux chacun ont été inclus pour les deux groupes infectés et faux pour les études susmentionnées. Toutes les expériences liées aux animaux ont été approuvés par le Centre de médecine de laboratoire et soin des animaux à l'Université du Texas Health Science Center à Houston (protocole animal approuvé HSC-AWC-10-145).
Immunohistochimie
Souris spécimens maxillaires étaient isolé, fixé dans 10% de formaline tamponnée neutre, décalcifiés dans du formiate de sodium 3,4% /acide formique à 15% et inclus dans de la paraffine. La récupération d'antigène a été effectuée en utilisant du HCl 4N pendant 10 min à 37 ° C. l'activité peroxydase endogène a été bloquée par incubation de 10 min avec 3% de H 2O 2. des protéines non spécifiques ont été bloqués avec DAKO bloc de protéines (Dako, Carpinteria, CA) pendant 30 min à température ambiante (TA). Les coupes ont été mises en incubation à température ambiante pendant 1 h avec 1: 4000 de lapin anti-anticorps polyclonale de P. gingivalis. L'anticorps secondaire et le substrat de coloration ont été réalisées avec le kit DAKO LSAB + et DAB + liquide système substrat-chromogène (Dako). Les lames ont été contre-colorées avec de l'hématoxyline. Le nombre d'ostéoblastes avec l'invasion bactérienne a été compté manuellement. Pour les groupes infectés par et de contrôle à la fois P. gingivalis, 10 échantillons ont été analysés. Le nombre total des ostéoblastes qui tapissent la surface de l'os alvéolaire sur la section a été compté. La formule pour cacluate pourcentage de coloration positive était: (nombre d'ostéoblastes brun teinté /nombre total de ostéoblastes compté) × 100
Micro-CT
Quatre semaines après l'inoculation finale, maxillaires de souris ont été recueillies et imagée avec. un Scanco micro-CT 40 (Scanco médicale, Brüttisellen, Suisse) à une résolution de 12 microns. Les images micro-CT ont été acquises au Baylor College of Medicine Facility micro-CT de base et reconstruites en utilisant une méthode Feldkamp modifiée [23]. Les données d'image ont été analysées semblable à ce qui a été décrit par Park et al. [24]. En bref, toutes les images ont été réorientées de telle sorte que le ciment-jonction émail (JAC) et apex de la racine (RA) apparaissent dans la même tranche. La région d'intérêt (ROI) a été établi manuellement sur les plans axiaux entre la surface de la racine médiane de la première molaire et la surface de la racine distale de la troisième molaire. Les contours ont été dessinés en continu toutes les 5 plans de données du toit de la furcation tout le chemin vers le sommet de la racine, jusqu'à trois dimensions (3D) ROI est généré (Figure 1). Tous les volumes de racines ont été exclus du retour sur investissement pour calculer le volume total (TV). Les paramètres analysés pour chaque échantillon inclus fraction volumique osseuse (BVF = BV /TV), la densité minérale osseuse (DMO, normalisée à un fantôme hydroxyapatite) et la teneur minérale osseuse (BMC = BMDX BV). Figure 1 Méthodes de génération 3D ROI (région d'intérêt) utilisés dans l'analyse micro-CT de l'os alvéolaire. contours à deux dimensions ont été établis manuellement tous les cinq plans de données sur la vue axiale, depuis le toit de la furcation à l'apex de la racine. Racine de surface a été exclue de la surface osseuse sur chaque plan de mesure. Un ROI 3D a été créé après que tous les contours 2D ont été tirées. le volume de l'os alvéolaire a été calculé en tant que volume total ROI moins racine. Quatre semaines
os histomorphométrie après l'inoculation finale, maxillaires de souris ont été prélevés et coupés en deux moitiés pour l'analyse histomorphométrique statiques et dynamiques, respectivement. Pour histomorphométrie dynamique, les souris ont reçu 10 mg /kg de poids corporel de calcéine dans 2% de NaHCO3 intraperitoneale 7 et 2 jours avant de sacrifier pour marquer l'os nouvellement formé. Maxilla ont été disséquée des tissus et des couronnes de dents souples ont été amputés long de la surface de l'os alvéolaire. Les spécimens ont été fixés dans 70% d'éthanol pendant 3-5 jours, déshydratées dans des concentrations d'éthanol, une compensation dans le xylène croissante et noyées décalcifié dans du méthacrylate de méthyle. Cinq sections épaisses micrométriques ont été découpées parallèlement à l'axe longitudinal des molaires et des sections près du centre de la chambre pulpaire ont été montées pour une visualisation non colorée de la surface minéralisant sous la lumière UV avec un filtre I3. Pour une mesure statique, maxillaire supérieur a été fixé à 4% de paraformaldehyde dans du PBS, pH 7,4, à 4 ° C pendant 2-5 jours. Les os ont été décalcifiés dans de l'EDTA /NH 3OH pendant encore 2-5 jours et déshydratées dans des concentrations d'éthanol, une compensation dans le xylène augmentant, et inclus dans la paraffine. Les os ont été coupés incorporés parallèlement à l'axe longitudinal des molaires et des sections près du centre de la chambre pulpaire ont été montées. sections consécutives ont été colorées avec du bleu de toluidine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ou la phosphatase acide résistant aux tartrates (TRAP, Sigma-Aldrich) pour la visualisation des ostéoblastes et les ostéoclastes, respectivement. Les types de cellules ont ensuite été validés par leur morphologie caractéristique, par exemple de forme parallélépipédique pour les ostéoblastes et les ostéoclastes multinucléés pour. Tous les ostéoblastes et les ostéoclastes sur l'ensemble de la section ont été comptés, afin d'éviter les variations spatiales dans leurs distributions. mesures histomorphométriques ont été faites d'une manière non biaisée en aveugle, et la terminologie et les unités utilisées étaient celles recommandées par le Comité de la nomenclature histomorphométrie de l'American Society for Bone and Mineral Research [25]. Toutes les analyses de histomorphométrie osseuse a été réalisée à l'Université du Texas MD Anderson Facility Cancer Center Os histomorphométrie de base en utilisant le système Bioquant Ostéo II d'image informatisée d'analyse (BIOQUANT Image Analysis Corporation, Nashville, TN) interfacé avec un Leica DM 1000 microscope (Leica Microsystems, Wetzlar Statistiques, Allemagne).
P. gingivalis
infecté par des groupes fictifs ont chacun 10 animaux pour toutes les expériences. L'analyse statistique a été réalisée par le test t de Student pour déterminer la signification entre les groupes (p & lt; 0,05).: Résultats
P. gingivalis
envahit les cellules épithéliales gingivales, ligament parodontal (PDL) de cellules, et les ostéoblastes alvéolaires dans le parodontite souris modèle
trois jours après trois périodes de provocation par voie orale avec P. gingivalis
, immunohistochimie a montré une coloration positive pour P. gingivalis
dans les cellules épithéliales gingivales, les fibroblastes PDL, les ostéoblastes qui tapissent la surface alvéolaire et ostéocytes intégré dans la matrice osseuse dans le groupe infecté, mais aucune coloration n'a été détectée dans le groupe témoin fictif infectées (Figure 2). Environ 17,6 ± 2,1% des ostéoblastes alvéolaires avait l'invasion de P. gingivalis basée sur le comptage manuel. Positivement teinté (brun) fibroblastes parodontales ont été distribués de manière homogène dans le tissu conjonctif. Ce résultat démontre que P. gingivalis
envahit avec succès profonde parodonte dans notre modèle parodontite animale. La figure 2 P. gingivalis envahissent les tissus mous et durs parodontales après des inoculations répétées comme indiqué par immunohistochimie. L'immunohistochimie a été réalisée trois jours après trois fois des inoculations de P. gingivalis. contrôle A. Sham-infecté. Anti-P. l'anticorps primaire a été appliquée gingivalis dans l'essai. Le bleu est hématoxyline contre-coloration. Notez qu'il n'y a pas une coloration positive brun pour P. gingivalis
dans le parodonte. B. P. gingivalis
animaux infectés, avec anti-P. anticorps primaire de gingivalis exclu de l'essai, qui ne présente pas une coloration positive dans le parodonte. Cela a démontré qu'il n'y avait pas de coloration non spécifique de l'anticorps secondaire et /ou du substrat. C. P. gingivalis
animaux infectés, avec anti-P. l'anticorps primaire gingivalis inclus dans l'essai. coloration étendue pour P. gingivalis
a été remarqué dans les cellules épithéliales gingivales, les fibroblastes PDL, et les ostéoblastes alvéolaires. D. Vue agrandie dans la coloration positive C. P. gingivalis a été détectée dans des fibroblastes (désigné par les flèches rouges) dans l'espace du ligament parodontal, ostéoblastes qui tapissent la surface de l'os alvéolaire (dénotés par des flèches noires), et un ostéocytes noyé dans la matrice de l'os alvéolaire (désigné par la tête de flèche noire). Abréviations: CT, contrôle, sham-infectés; PG, P. gingivalis
infecté; Ab, anticorps; R, la racine; E, les cellules épithéliales gingivale; PDL, ligament parodontal; B, l'os alvéolaire; barre d'échelle = 20 um.
P. gingivalis
infection provoque une perte de volume de l'os alvéolaire et de la densité
Quatre semaines après l'inoculation par voie orale finale avec P. gingivalis
, les spécimens de maxilla de souris ont été recueillies et imagés avec scanner micro-CT. Les images Micro-CT montrent une diminution hauteur de l'os alvéolaire et furcation résorption des molaires de souris (figure 3A), et une diminution de la densité minérale de l'os alvéolaire en particulier à la marge gingivale chez les souris infectées par rapport au témoin factice (figure 3B). La quantification des résultats micro-CT démontre une réduction significative de la fraction de volume alvéolaire osseuse, la densité minérale osseuse et la teneur minérale des os d'animaux infectés par rapport aux témoins (figure 3C-E). Figure 3 infection par P. gingivalis provoque une perte de volume de l'os alvéolaire et de densité tel que démontré par micro-CT. Analyse Micro-CT a été effectuée quatre semaines après un total de huit inoculations bactériennes. Diminution de la hauteur de l'os alvéolaire et la participation de la furcation (A) et une diminution de la densité minérale à la surface alvéolaire (B) a été remarqué chez les animaux infectés. Dans le panneau A, flèches rouges indiquent l'implication de furcation. Dans le panneau B, la couleur rouge-violet foncé indique les régions de la densité minérale inférieure. La quantification des micro-CT données montrent que l'infection de P. gingivalis répétitives a provoqué une réduction significative de la fraction alvéolaire osseuse (C), la densité minérale osseuse (D) et la teneur minérale de l'os (E), par rapport aux témoins. Abréviations: CT, contrôle, sham-infectés; PG, P. gingivalis
infecté; BV /TV%, le volume restant de l'os alvéolaire sur volume total; BMD, la densité minérale osseuse (normalisé à fantôme hydroxyapatite); BMC, la teneur minérale osseuse (DMO = X BV); *, Indique P & lt; 0,05 par rapport aux témoins.
P. gingivalis
infection se traduit par une augmentation de la résorption osseuse ostéoclastique et une augmentation de compensational dans la formation osseuse ostéoblastique
Pour évaluer comment le couplage ostéoblastes /ostéoclastes a été affectée par P. gingivalis
, l'analyse histomorphométrique de l'os a été réalisée sur les échantillons de maxillaire supérieur. l'infection bactérienne a provoqué une diminution du nombre d'ostéoblastes (figure 4A, D et E), une augmentation du nombre d'ostéoclastes (Figure 4B, D et E) et une élévation de la résorption de l'os alvéolaire (figure 4F). Unexpected, la formation osseuse ostéoblastique a été stimulée par P. gingivalis
, tel que démontré par MS significativement plus élevés /BS% (pourcentage de surface minéralisant de surface osseuse totale mesurée, la figure 4C et F), MAR (taux d'affrontement minéral, la figure 4C et G), et BFR /BS (taux de formation osseuse, la figure 4C et G) dans le groupe infecté par rapport aux témoins. La figure 4 P. L'infection gingivalis dans une résorption osseuse accrue des ostéoclastes et une augmentation de la formation osseuse ostéoblastique, comme indiqué par l'analyse histomorphométrique de l'os. histomorphométrie osseuse a été effectuée quatre semaines après un total de huit inoculations bactériennes. A. Toluidine coloration bleu pour les ostéoblastes. Les flèches indiquent les ostéoblastes en contact avec la surface de l'os alvéolaire. B. TRAP coloration pour les ostéoclastes, qui sont des cellules multinucléées rouges tachées. C. calcéine étiquetage doubler pour montrer l'os nouvellement formé. La zone située entre les lignes doubles vert clair est où le nouvel os est formé. D-G, les données de histomorphométrie osseuse quantifiées. Une diminution significative du nombre d'ostéoblastes (D et E), augmentation du nombre d'ostéoclastes (D et E), et une augmentation de la résorption osseuse ostéoclastique (F) n'a été observée chez les animaux infectés. De manière surprenante, la formation osseuse ostéoblastique a été très élevée dans les ostéoblastes restants (F et G). Abréviations: CT, contrôle, sham-infectés; PG, P. gingivalis
infecté; B, l'os alvéolaire; R, la racine; PDL, ligament parodontal; Ob.S /BS%, la surface de l'os pour cent bordée ostéoblastes; Oc.S /BS%, la surface de l'os pour cent recouvert d'ostéoclastes; N.Ob /B. Pm, nombre d'ostéoblastes par périmètre de l'os; N. Oc /B. Pm, nombre d'ostéoclastes par périmètre de l'os; MS /BS%, pour cent de surface minéralisant de la surface totale de l'os mesuré; ES /BS%, la surface de l'os pour cent érodé par les ostéoclastes; MAR, le taux d'affrontement minéral; RFB /BS, le taux de formation de l'os; *, Indique P & lt; 0,05 par rapport aux témoins. Barre d'échelle = 20 pm Discussion de
. Dans cette étude, nous avons étudié l'invasion du parodonte par P. gingivalis
et comment l'infection bactérienne influence la dynamique de l'os alvéolaire en utilisant un modèle de souris parodontite. Les modèles murins ont été largement utilisés pour explorer la pathogenèse des maladies parodontales et de développer des modalités de traitement, parce que l'anatomie parodontale et histopathologie des lésions parodontales chez les souris sont semblables à ceux trouvés chez l'homme [26]. En outre, à faible coût, facilité de manipulation, la génétique connue, un système immunitaire bien défini, et la microflore orale contrôlables favorisent murin sur les autres espèces animales dans les études parodontales [27, 28]. Différentes méthodes ont été présentées dans la littérature pour délivrer des agents pathogènes parodontaux dans la cavité buccale des animaux expérimentaux, tels que le régime alimentaire, les bactéries imbibés ligatures, gavage, ou l'application directe de la suspension bactérienne à gingival [18, 21, 26, 29, 30 ]. Pour parvenir à une infection spécifique au site et éviter d'endommager gingival de ligatures, nous avons suspendu P. gingivalis en direct
en solution légèrement visqueuse (2% de carboxyméthylcellulose dans du PBS) et appliqué directement sur la marge gingivale de molaires maxillaires de souris.
Notre modèle parodontite de la souris est une simulation très simplifiée de la parodontite cliniques observés dans la population de patients. Nous avons utilisé l'infection P. gingivalis simples de principalement pour voir si elles peuvent envahir parodonte in vivo et causer la perte osseuse parodontale. Depuis sulcus gingival humain est un habitant de microflore très diversifiées par voie orale [31], d'autres études avec parodontite polymicrobienne modèles animaux seraient fournir des informations supplémentaires sur le mécanisme pathogène de la maladie parodontale.
Des études in vitro ont montré que P. gingivalis
peut infiltrer poche multicouche cellules épithéliales [32-35] humain transformé et les cellules épithéliales gingivales primaires ainsi que. En utilisant un modèle de la muqueuse buccale humaine conçue composée de cellules normales humaines épithéliales et les fibroblastes et un modèle de membrane basale reconstituée (matrigel), P. gingivalis
a été montré pour infiltrer les cellules épithéliales à couches multiples, migrent à travers la membrane basale et atteindre le sous-jacent tissu conjonctif [36]. Les études in vivo ont démontré l'invasion de gingival humain et les cellules épithéliales buccales [37-39], et l'invasion des tissus de biopsies gingivales par P. gingivalis
[40, 41]. Ces résultats suggèrent que les agents pathogènes parodontales peuvent pénétrer dans les tissus parodontaux profonds in vivo. Notre étude immunohistochimique montre l'invasion des cellules épithéliales gingivales, les fibroblastes, les ostéoblastes alvéolaires de revêtement de l'os, et ostéocytes embarqués par P. gingivalis
sur les sites infectés 3 jours après plusieurs inoculations orales. Cette étude est la première à démontrer que ce pathogène parodontale est capable d'envahir les ostéoblastes alvéolaires in vivo. facteurs de virulence multiples de P. gingivalis
, en particulier fimbriae et gingipains, peuvent jouer un rôle important dans la facilitation de l'invasion intracellulaire et extracellulaire ventilation et, en fin de compte, la progression et de l'expansion des dommages parodontales [4, 42, 43]. Notre étude in vitro précédente démontre que les fimbriae sont essentiels pour l'invasion initiale de P. gingivalis
en ostéoblastes, mais peut-être pas si critique pour la persistance de bactéries à l'intérieur des cellules hôtes [16].
Pour démontrer la colonisation initiale /infection de P. gingivalis
dans la cavité buccale de la souris, une étude immunohistochimique à court terme a été réalisée pour évaluer l'invasion des cellules parodontales par P. gingivalis de trois jours après trois périodes de inoculations bactériennes. Cette première phase a été choisie parce que nous voulions démontrer que la présence de P. gingivalis
l'intérieur des cellules parodontales était principalement due à l'invasion au lieu de la multiplication intracellulaire des bactéries. Coloration immunohistochimique entrée démontrée de P. gingivalis
en différentes cellules parodontales. Toutefois, dans ce laps de temps court, aucune migration apicale appréciable de l'épithélium et la poche formation jonctionnelle a été remarqué. Apparente perte de l'os alvéolaire n'a pas été détecté jusqu'à ce que beaucoup plus tard, ce qui était de 4 semaines après un total de 8 inoculations. Aucun signe évident histologiques d'inflammation tels que l'infiltration des maladies inflammatoires (leucocytes polynucléaires, lymphocytes) des cellules dans le tissu conjonctif, a été démontrée dans notre étude immunohistochimique de phase précoce. Cela est probablement dû à la faible capacité intrinsèque de P. gingivalis
de stimuler des réponses inflammatoires immunitaires /hôtes [44-47]. extraits de la paroi cellulaire et les composants cellulaires purifiés de P. gingivalis
ont relativement faible activité immunostimulante hôte [44-47]. P. gingivalis
peut activement inhiber la sécrétion de PNN interleukine (IL) -8, IL-1β et IL-18 [48, 49]. Peut-être, la suppression de l'hôte immunitaire innée & amp; réponses inflammatoires par P. gingivalis
pourrait faciliter le maintien de l'état chronique de l'infection au cours des maladies parodontales. Les bactéries autres que P. gingivalis
dans la flore buccale polymicrobienne semblent être en mesure de servir de médiateur hôte très robuste immunitaire & amp; réponses inflammatoires [30, 49]. Nos résultats ont montré que l'invasion directe de P. gingivalis
en ostéoblastes supprimés piscine ostéoblastes et perturbés ostéoblastes /ostéoclastes hémostase entraînant une perte osseuse nette. Cependant, la destruction de l'os alvéolaire en raison d'accueillir la réaction inflammatoire à P. gingivalis
ne peut pas être exclue.
P. gingivalis de l'invasion des cellules parodontales a été démontré une coloration brune intracellulaire spécifique pour les bactéries, qui était absente dans les groupes témoins. La coloration au bleu de toluidine sur des coupes de tissus consécutifs confirme que les cellules cubiques en forme sur la surface de l'os alvéolaire étaient vraiment ostéoblastes (données non présentées). Avec la puissance de microscope optique que nous avons utilisé pour capturer les images, d'une bactérie individuelle ne peut être résolu. Au lieu de cela, les cellules avec l'invasion bactérienne démontrée ponctuent ou diffuse une coloration cytoplasmique brun. Future étude en microscopie électronique à transmission peut en outre préciser la localisation subcellulaire des bactéries.
Notre étude micro-CT démontre une diminution significative de la densité du volume osseux et minéral alvéolaire résiduelle chez les animaux infectés par des P. gingivalis par rapport à la sham-infectés contrôles, ce qui concorde avec les rapports précédents [30, 50]. La densité de l'os alvéolaire a semblé diminuer plus à la marge gingivale que le reste de la zone dans les animaux infectés (figure 3B), probablement en raison de la proximité de la bactérie et de leurs facteurs de virulence sécrétés à ces surfaces.
L'analyse histomorphométrie osseuse révélé nombre élevé d'ostéoclastes et la résorption osseuse ostéoclastique chez les animaux infectés par rapport aux témoins, ce qui est similaire à d'autres conclusions [50]. Il est intéressant, pour les paramètres d'ostéoblastes, a diminué de manière significative le nombre d'ostéoblastes, mais a augmenté de manière significative l'activité de la formation osseuse a été observée chez les animaux infectés. Notre étude in vitro précédente démontre que P. gingivalis
initialement supprime, mais favorise l'apoptose des ostéoblastes plus tard sur inoculations répétitives [51]. Compte tenu de l'évolution temporelle de l'étude in vivo, le nombre d'ostéoblastes diminution pourrait être due à une augmentation de l'apoptose et /ou l'inhibition de ostéoblastogenèse par les bactéries. Au point de temps examiné, bien que le nombre total des ostéoblastes a été réduit, il est apparu qu'une plus grande fraction des ostéoblastes résiduelles a été stimulé pour mettre activement les os par rapport aux témoins, possibles en raison de certains mécanismes compensational en réponse à la provocation bactérienne. Cependant, l'augmentation de la formation osseuse a été compensée par l'augmentation de la résorption osseuse, par conséquent, une perte osseuse nette a été observée chez les animaux infectés. Il semble que la réaction de l'os alvéolaire à ce pathogène parodontale est compliquée, et l'analyse histomorphométrique plus osseuse longitudinale serait utile pour mieux élucider le mécanisme de la maladie.
En termes de ce que sont les effets intracellulaires réels de P. gingivalis
dans les ostéoblastes /ostéoclastes, notre étude in vitro précédente démontre que l'invasion de P. gingivalis
n'a pas d'effet sur la prolifération des ostéoblastes, mais inhibe leur différenciation et la minéralisation, en partie par l'intermédiaire d'une inhibition de la transcription de régulation de la différenciation des facteurs Cbfa-1 et osterix [15 ]. Une autre étude in vitro constate que la liaison entre les fimbriae et ostéoblastes intégrines alph5beta1 résultats de P. gingivalis dans la périphérie de la condensation de l'actine et de l'activation de la voie JNK dans les ostéoblastes infectés [51]. Notre étude préliminaire de coculture ostéoblastes-ostéoclastes démontre augmenté RANKL et une diminution des concentrations d'OPG chez P. gingivalis
cocultures infectés par rapport au témoin, résultant en une beaucoup plus ration RANKL /OPG qui peut stimuler la ostéoclastogenèse et la résorption osseuse subséquente (données non publiées). Apparemment, des études plus approfondies sont nécessaires pour identifier des molécules interactives supplémentaires hôtes-pathogènes (les adhésines, les cytokines, et al.) Dans la parodontite, afin de faciliter le développement de nouvelles cibles thérapeutiques pour prévenir perte osseuse parodontale et /ou pour stimuler la régénération de l'os alvéolaire.
Conclusions
en résumé, les données présentées ici démontrent que P. gingivalis
peuvent envahir les ostéoblastes alvéolaires, provoquer une diminution dans les ostéoblastes, une augmentation des ostéoclastes et la résorption osseuse et une augmentation inattendue de la formation osseuse dans le les souris infectées par rapport aux témoins. La résorption osseuse l'emporte sur la formation d'os par conséquent, les souris infectées montrent une diminution du volume de l'os alvéolaire globale et de la densité. Avoir une meilleure compréhension des mécanismes pathogènes de la parodontite peut mener au développement de nouvelles stratégies préventives ou thérapeutiques contre cette maladie réfractaire
abréviations
P. gingivalis
:.
Porphyromonas gingivalis
UFC:
unité formant colonie
LPS:
lipopolysaccharides
< dfn> RANKL:
activateur du récepteur du nucléaire ligand facteur-kappaB
OPG:
Osteoprotegerin
TSBY:
Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.
