bioactif
Résumé de l'arrière-plan
Inflammation dans la cavité buccale est due à une dysrégulation entre biofilms microbiens et la réponse de l'hôte. Comprendre comment les différents produits d'hygiène buccale influencent les propriétés inflammatoires est importante pour le développement de nouveaux produits. Par conséquent, la création d'une plate-forme de biofilm hôte-pathogène robuste, capable d'évaluer de nouveaux composés santé bucco-dentaire est une option attrayante. Nous avons donc conçu un modèle biofilm co-culture multi-espèces pour évaluer le resvératrol naturellement dérivé de polyphénol (RSV) et la chlorhexidine étalon-or (CHX) par rapport à l'anti-biofilm et anti-inflammatoires.
Méthodes
Un en vitro
multi-espèces biofilm contenant S. mitis, F. nucleatum, P. gingivalis
et A. actinomycetemcomitans
a été créé pour représenter un biofilm associé à la maladie et la cellule épithéliale orale dans OKF6-TERT2. Des études de cytotoxicité ont été réalisées avec le RSV et CHX. biofilms multi-espèces ont été soit traitées soit avec la molécule ou encore les cellules épithéliales ont été traitées avec celles-ci avant le biofilm co-culture. composition du biofilm a été évaluée et les réponses inflammatoires quantifiée au niveau de la transcription et de la protéine de. Résultats
CHX était toxique pour les cellules épithéliales et biofilms multi-espèces à des concentrations allant de 0,01 à 0,2%. RSV n'a pas d'effet de composition biofilm multi-espèces, mais était toxique pour les cellules épithéliales à des concentrations supérieures à 0,01%. En co-culture, biofilms CHX-traités ont donné lieu à une régulation négative de la chimiokine inflammatoire IL-8 à la fois l'ARNm et des protéines. les cellules épithéliales RSV-traités dans la co-culture ont été régulés à la baisse dans la libération d'IL-8 protéines, mais les conclusions de ne pas l'ARNm.
CHX possède des propriétés bactéricides puissants, qui peuvent avoir un impact sur les médiateurs inflammatoires en aval. RSV ne semble pas avoir des propriétés bactéricides contre biofilms multi-espèces, mais il ne semble supress les cellules épithéliales de libérer des médiateurs inflammatoires. Cette étude démontre le potentiel de comprendre les mécanismes par lesquels les différents produits d'hygiène buccale peuvent influencer l'inflammation gingivale, validant ainsi l'utilisation d'un modèle biofilm co-culture.
Mots-clés
cellule parodontale maladie biofilm épithéliale électronique matériel supplémentaire
la version en ligne de cet article (doi:. 10 1186 /1472-6831-14-80) contient du matériel supplémentaire, qui est disponible pour les utilisateurs autorisés
Contexte
la maladie parodontale se produit à partir d'une dysrégulation entre le bactérienne. biofilm à la marge de la gomme et la réponse immunitaire, ce qui entraîne une destruction irréversible des deux tissus mous et durs supportant les dents, conduisant finalement à la perte des dents. Dans la santé, les molécules immunitaires innées et adaptatives médiatisent l'équilibre entre l'hôte et les suspensions principalement Gram positives hétérogènes bactériennes dans la salive et les communautés de biofilms adhérentes sur les surfaces des tissus mous et durs tout au long de la cavité buccale. Dans la maladie parodontale le déplacement du microbiote de Gram positif à Gram espèces négatives conduit à une réponse déréglée hôte à la fois à partir de tissus locaux et des cellules immunitaires qui induit l'inflammation et crée une niche à la racine pour les espèces anaérobies pour survivre, aggravant encore la maladie [1 espèces procaryotes nombreuses de]. ont été identifiés dans la cavité buccale existante au sein des écosystèmes biofilm complexes soit comme supra- ou plaque sous-gingivale. Beaucoup sont incultes et sans nom, mais tous les rôles structurels et fonctionnels importants jouant [2]. Biopuces et de séquençage de la prochaine génération d'études du microbiote orale a permis la classification de certaines espèces de bactéries dans des complexes basés sur des associations avec la santé et de la maladie [3, 4]. Ceux-ci ont permis d'études pour étudier les espèces, telles que la maladie associée à des bactéries Porphyromonas gingivalis
, et comprendre leur rôle pour contester la réponse de l'hôte [5]. Cependant, les biofilms sont complexes et par voie orale à l'intérieur de ces structures de biofilm polymicrobiens une multitude d'interactions intimes se produisent, ce qui rend difficile de déterminer précisément les déclencheurs pour les résultats pathogènes associés à une dysrégulation immunitaire. Par conséquent, la création d'un modèle simplifié avec plusieurs de ces agents pathogènes clés est une proposition attrayante pour évaluer les interactions hôte-pathogène et actifs de test pour le potentiel de traitement
Traiter la maladie parodontale est difficile. dentistes exercent débridement sur les dents, l'administration de rince-bouche antimicrobiens pour cibler biofilms et en parodontite avancée, chirurgie. Cependant, les succès du traitement sont variables et sur une base individuelle et en suggérant la composition de biofilm peuvent influer sur le résultat du traitement [6]. collutoires antimicrobiens actuellement utilisés pour gérer les maladies buccales comprennent une variété de composés avec de la chlorhexidine (CHX) étant considéré comme le «gold standard» en raison de son propriétés bactéricides et bactériostatiques [7]. En outre, les polyphénols d'origine naturelle trouvés dans des plantes telles que les raisins sont devenues une priorité pour les traitements oraux en raison de leurs propriétés anti-inflammatoires et anti-bactériennes [8]. Resveratrol (VRS) est un polyphénol d'origine naturelle, qui a été montré comme ayant des propriétés anti-inflammatoires dans une variété de cellules cancéreuses, et récemment parodontite chez le rat [9, 10]. Les deux
CHX et RSV ont des propriétés souhaitables pour la parodontite la prévention, étant antimicrobien ou anti-inflammatoire et antimicrobien, respectivement. Le but de cette étude était donc de créer et de valider un modèle de biofilm multi-espèces à être utilisé en co-culture avec des cellules épithéliales de l'hôte afin de tester les actifs CHX et RSV afin de valider si le système de modèle pourrait être utilisé en tant que méthode sensible de délimiter leurs modes d'action de base. Nous rapportons ici que les cellules épithéliales orales produisent une réponse pro-inflammatoire reproductible à notre biofilm multi-espèces à la fois le gène et la protéine. En outre, le traitement des cellules épithéliales soit ou biofilms multi-espèces avec des actifs a donné lieu à une altération de l'inflammation dans le modèle de co-culture.
Méthodes
croissance et de la normalisation des Porphyromonas gingivalis de bactéries
ATCC 33277, Fusobacterium nucleatum
ATCC 10953, Aggregatibacter actinomycetemcomitans
ATCC 43718 et Streptococcus mitis
ATCC 12261 ont été utilisés dans le cadre de ces études. P. gingivalis
ATCC 33277 et F. nucleatum
ATCC 10596 ont été cultivées à 37 ° C dans Schaedler anaérobies bouillon (Oxoid, Cambridge, Royaume-Uni) pendant 2 jours et 1 jour, respectivement, dans une chambre anaérobie (85% N
2, 10% de CO 2 et 5% H 2, [Don Whitley Scientific Limited, Shipley, Royaume-Uni]). A. actinomycetemcomitans ATCC
ATCC 43718 et Streptococcus mitis 12261 ont été cultivées à 37 ° C dans un bouillon trypsique de soja (Sigma, Poole, Royaume-Uni) complété avec 0,8% p /v de glucose (BDH, Poole, Royaume-Uni) et 0,6 % p /v d'extrait de levure (Oxoid, Cambridge, UK) pendant 1 jour à 5% de CO 2. Les bactéries ont été lavées avec du PBS, puis normalisées à une DO 550 de 0,2, sauf pour S. mitis
, qui a été standardisé à une DO 550 de 0,5, dans un colorimètre pour obtenir environ 1 × 10 < sup> 8 ufc /ml de chaque espèce bactérienne sur leur journée d'utilisation spécifié. composés
actifs
chlorhexidine (CHX [Sigma]) et le resvératrol (RSV [Sigma]) ont été utilisés tout au long de cette étude. une solution de chlorhexidine a été préparée à 0,01, 0,05 et 0,2% v /v dans du sérum de milieu exempt de kératinocyte (KSFM) et utilisé pour les tests antimicrobiens ultérieur. poudre de RSV a été solubilisé dans ddH 2O avant la préparation en KSFM à 0,01, 0,05 et 0,5% v /v et utilisé pour les études de stimulation cellulaire ultérieure du développement de. des Bactéries multi-espèces biofilms ont été normalisées (1 x 10 7 ufc /ml) dans de la salive artificielle (AS), qui contient les constituants suivants, comme décrit précédemment [11]. Cela comprenait mucine d'estomac de porc (0,25% p /v), du chlorure de sodium (0,35 p /v), du chlorure de potassium (0,02 p /v), du chlorure de calcium dihydraté (0,02 p /v), extrait de levure (0,2 p /v), poudre laboratoire Lemco (0,1 p /v), de la peptone de proteose (0,5 p /v) dans ddH 2 O (Sigma, Poole, RU). L'urée est ensuite ajoutée à indépendante à une concentration finale de 0,05% (v /v). Pour initier le développement multispécifique biofilm l'espèce pionnière du biofilm de S. mitis ont d'abord été formé pendant 24 h à 5% de CO 2 sur 13 lamelles mm de diamètre Thermanox ™ au sein de plaques à 24 puits (Corning, NY, USA). Le surnageant a ensuite été éliminé et F. nucleatum
ajouté, qui a été mis en incubation en anaérobiose à 37 ° C pendant 24 h supplémentaires. Le surnageant a été éliminé et P. gingivalis et A. actinomycetemcomitans
ajouté au biofilm espèces double, qui a été mis en incubation en anaérobiose à 37 ° C pendant 4 jours, en remplaçant le AS par jour afin de produire un mélange de quatre espèces biofilm (figure 1A). Figure 1 Développement de multi-espèces modèle biofilm co-culture. A. Multi-espèces protocole de culture de biofilm. des lamelles couvre-Thermanox ™ ont été placées dans des plaques à 24 puits pour culture de biofilm. Les bactéries ont été cultivées sur des plaques de gélose appropriées et cultivées dans un bouillon pendant 1-2 jours. Les cultures ont ensuite été lavées trois fois dans du PBS et normalisé à 1 × 109 UFC /ml, ajouté à la salive artificielle pour faire un 1 × 108 UFC /ml de volume final et ajouté au biofilm sur les jours appropriés et mis en culture dans des conditions aérobie et anaérobie. Après 7 jours de culture de la salive artificielle est retirée de biofilms matures qui sont ensuite lavées avec du PBS et stockées à -80 ° C. B. Hanging panier co-culture modèle. biofilms multi-espèces ont été cultivées sur des lamelles Thermanox ™ et décrits précédemment. les cellules epitheliales (OKF6-TERT2) ont été ensemencées dans des plaques à 24 puits à raison de 1 x 105 cellules /ml dans des milieux de culture cellulaire. Les biofilms sont attachés à l'inverse de Millipore inserts de culture cellulaire en utilisant Vaseline et placés au-dessus des puits contenant des cellules. Les cellules et les biofilms ont été co-cultivées pendant 4 h et 24 h.
Analyse quantitative de la composition du biofilm
PCR en temps réel quantitative (qPCR) a ensuite été effectuée pour énumérer la composition définitive et relative des biofilms. En bref, les biofilms bactériens ont été éliminés par traitement par ultrasons dans un bain à ultrasons à 35 kHz pendant 10 minutes, comme décrit précédemment [12]. QPCR pour le traitement par ultrasons d'un biofilm a été utilisé pour l'extraction d'ADN en utilisant le kit MasterPure Purificiation Gram positif ADN (Epicentre®, Cambridge, Royaume-Uni), en suivant les instructions du fabricant, avec la modification que la sonication a été mis en incubation pendant 4 heures pour assurer la lyse des cellules. L'ADN extrait a subi des contrôles de qualité en utilisant le NanoDrop spectrophotomètre (Fischer Scientific, Loughborough). En bref, 1 pl de l'ADN extrait a été ajouté à une mastermix contenant 12,5 pi SYBR® Greener ™, 9,5 pi UV-eau traitée RNase et 1 pl de 10 uM d'amorces avant /arrière pour chaque espèce bactérienne. Les amorces utilisées ont déjà été publiés, comme listés dans le Tableau 1. Trois répétitions indépendantes de chaque paramètre ont été analysés en triple en utilisant la machine MxProP PCR quantitative et MxProP logiciel 3000 (Stratagene, Amsterdam, Pays-Bas). Les échantillons ont été quantifiés pour calculer l'équivalent de formation de colonies (CFE) sur la base d'une courbe d'étalonnage préalablement établie de la formation de colonies bactériennes unités allant de 1 × 10 3 et 10 8 ufc /mL. Les R 2 valeurs de ces courbes standard allaient 0,956 à 0,994. Melting analyse de la courbe a été effectuée pour tous les ensembles d'amorces pour assurer un seul pic, ce qui est révélateur de la spécificité de l'amorce. l'architecture du biofilm a ensuite été analysé par microscopie électronique à balayage (MEB). Ce biofilm pour les échantillons ont été lavés dans du PBS, fixées dans 2% de para-formaldéhyde, 2% de glutaraldéhyde, 0,15% p /v de bleu Alcian dans 0,15 M de cacodylate de sodium (pH 7,4) [13]. Les échantillons fixés et séchés ont été enrobés par pulvérisation cathodique d'or et visualisées sous un microscope électronique à balayage Jeol JSM-6400 [14] .Tableau 1 Amorces utilisées pour la PCR quantitative dans cette étude
Gene
Forward 5'-3 'de
antisens 5'-3'
Référence
Cytokine
IL-8
CAGAGACAGCAGAGCACACAA
TTAGCACTCCTTGGCAAAAC
[15]
GAPDH
CAAGGCTGAGAACGGGAAG
GGTGGTGAAGACGCCAGT
[15]
Les espèces bactériennes
S. mitis
GATACATAGCCGACCTGAG
CCATTGCCGAAGATTCC
[16]
F. nucleatum
GGATTTATTGGGCGTAAAGC
GGCATTCCTACAAATATCTACGAA
[17]
P. gingivalis
GCGCTCAACGTTCAGCC
CACGAATTCGCCTGC
[18]
A. actinomycetemcomitans
GAACCTTACCTACTCTTGACATCCGAA
TGCAGCACCTGTCTCAAAGC
[19]
développement d'un modèle de co-culture biofilm cellules épithéliales
OKF6-TERT2 (type cadeau du laboratoire Rheinwald, Hôpital Brigham and Woman , Boston) sont une ligne immortalisée orale humaine de cellules kératinocytes [20] a été utilisé tout au long de ces enquêtes. OKF6 cellules ont été cultivées dans un milieu sans sérum des kératinocytes (KSFM) comme décrit précédemment [21]. A 90% de confluence, les cellules sont trypsinisées, lavées dans Hanks solution saline équilibrée puis re-ensemencées à environ 1 × 10 5 cellules /ml et ensemencées sur une lamelle Thermanox ™ dans une plaque de culture cellulaire 24 (Corning, NY, ETATS-UNIS). Les cellules épithéliales ont été lavées et ensuite soumis à contester avec biofilms inversées, fixés à l'aide de Vaseline pour pendre des inserts de culture cellulaire (Millipore, MA, USA) comme illustré sur la figure 1B. Les biofilms sur les disques Thermanox ™ ont été séparés des cellules épithéliales sur le fond du puits par un petit espace de & lt; 0,5 mm, représentatif d'une crevasse gingivale. Multispécifiques biofilms ont été incubés dans le modèle de co-culture pour 4 et 24 h et la viabilité des cellules épithéliales ± traitements actifs (CHX et RSV) évaluée en utilisant un test métabolique de 10% v /v alamarBlue®, selon les instructions du fabricant ( Life Technologies, Paisley, Royaume-Uni). Après 4 heures d'incubation de l'absorbance a été lue à 570 nm et la longueur d'onde de référence à 600 nm, et la réduction du pourcentage de biofilm viabilité calculée en utilisant la formule du fabricant.
Évaluation des changements inflammatoires au cours de surnageants de biofilm co-culture et les lysats cellulaires ont été collectées à partir de OKF6 /TERT2 cellules stimulées avec différentes biofilms multispécifiques, qui ont été utilisés pour les protéines et l'analyse de la transcription, respectivement, pour évaluer la réglementation des médiateurs pro-inflammatoires. L'analyse initiale de l'expression des gènes a été réalisée à l'aide d'une mesure conçue RT Réseau 2 Profiler PCR (Qiagen, Crawley, Royaume-Uni). RT 2 tableaux de Profiler sont en temps réel SYBR® Greener ™ basée sur la PCR qui permettent la détection de plusieurs gènes d'intérêt, en même temps. En bref, l'ARN a été extrait à partir de lysats cellulaires (Qiagen, Crawley, UK) et 55 ng /pl de l'ADNc synthétisé en utilisant la RT 2 du premier brin d'ADNc kit de synthèse (Qiagen, Crawley, UK) selon les instructions du fabricant. En bref, 24 ul d'une mastermix contenant SYBR® Greener ™, l'ADNc synthétisé en utilisant la RT 2 kit First Strand (Qiagen) et de l'eau sans RNase a été ajouté à chaque puits de la RT 2 plaque de Profiler, qui a déjà contenait les amorces avant et arrière pour les gènes d'intérêt (IL-1alpha, IL-1ß, IL-6, TNF, CSF2, CSF3, IL-8, CXCL1, CXCL3, CXCL5, CCL1 et GAPDH), sur la base d'une gingivite expérimentale modèle [22]. Deux répétitions de chaque condition ont été utilisés dans la RT 2 Profiler, qui a été réalisée en deux occasions distinctes.
Une vérification a été effectuée en utilisant l'IL-8 l'expression des gènes analysés en utilisant la base SYBR® verte qPCR (Invitrogen), en utilisant GAPDH comme un gène de ménage. Les séquences des amorces et des sources de référence sont énumérés dans le tableau 1. Toutes les amorces ont été testées contre chaque espèce bactérienne pour assurer la spécificité, ce qui est le cas (données non présentées). L'ARN a été synthétisé en ADNc ensuite ajouté à une mastermix contenant 12,5 pi SYBR® Greener ™, l'eau RNase 10,5 pi UV-traitée et 0,5 pi de l'avant amorces /arrière. Trois répliques indépendantes de chaque paramètre ont été analysés en double en utilisant la machine MxProP PCR quantitative et MxProP logiciel 3000 (Stratagene, Amsterdam, Pays-Bas) et l'expression génique normalisée à l'GAPDH de gène de ménage selon la 2 -ΔΔCT
méthode [23 ]. IL-8 libération dans les surnageants de culture cellulaire a été évaluée par ELISA (Invitrogen, Paisley, UK) selon les instructions du fabricant. Les résultats ont été calculés en utilisant un ajustement de courbe à 4 paramètres, quantifier les changements colorimétrique à 630 nm (BMG-Labtech, Ortenberg, Allemagne).
Analyse statistique
production graphique, la distribution des données et des analyses statistiques ont été effectuées en utilisant GraphPad Prism (version 4, La Jolla, CA, USA). Après avoir évalué si les données conformes à une distribution normale par avant et après les transformations de données, analyse unidirectionnelle de la variance (ANOVA) et t
essais ont été utilisés pour étudier les différences significatives entre les groupes indépendants de données qui estimés à une distribution gaussienne. Une correction de Bonferroni a été appliquée à la valeur p pour tenir compte des comparaisons multiples des données. Les données non-paramétriques ont été analysées en utilisant le test U de Mann-Whitney pour évaluer les différences entre les deux groupes d'échantillons indépendants. t-tests de Student ont été utilisés pour mesurer les différences statistiques entre les valeurs Δ
Ct des deux groupes indépendants évalués dans les études d'expression génique, bien que les données peuvent être représentées en pourcentage ou plier le changement dans les chiffres. La signification statistique a été atteint si P & lt; 0,05
Résultats
.
Analyse quantitative d'un parodontale modèle multi-espèces de biofilm
soniqué biofilms multi-espèces ont été quantifiées par qPCR (figure 2A). Il a été montré que quantitativement que S. mitis
était l'espèce dominante au sein du biofilm mature (1,36 × 10 7 CFE /mL; 83,24%), suivi par
F. nucleatum
(2,28 × 10 6; 15,16%), P. gingivalis
(3,53 × 10 4; 1,01%) et A. actinomycetemcomitans
(1,13 × 10 5; 0,58%). La composition de biofilm a ensuite été examinée en utilisant l'analyse SEM. Biofilm a été montré pour être un complexe dense des différents morphotypes dominées par F. nucleatum
(figure 2B et C). Figure 2 Analyse des biofilms multi-espèces dans des conditions anaérobies et aérobies. biofilm multi-espèces ont été cultivées sur des lamelles couvre Thermanox ™ dans des plaques de 24 puits pendant 6 jours, comme décrit précédemment. Après la maturation de l'ADN a été extrait en utilisant un kit de purification d'ADN Masterpure ™ Gram positif pour la quantification de chaque espèce en utilisant SYBR® Greener ™ à base de qPCR (A). Morphologie biofilm a été analysé par MEB à 2000x (B) et 5000x (C). Les échantillons ont été traitées et visualisées sur un microscope électronique à balayage Jeol JSM-6400 et des images assemblées à l'aide du logiciel Photoshop. Les biofilms peuvent être considérés comme complexes (B). A grossissements supérieurs différentes morphologies peuvent être identifiés avec S. mitis
et F. nucleatum
qui composent la majorité du biofilm (C). biofilms matures ont également été cultivées dans des milieux de culture cellulaire dans 5% de CO2 pendant 4 et 24 heures avant l'extraction de l'ADN et la quantification de chaque espèce en utilisant en utilisant SYBR ™ Greener basé qPCR (D). Tous les échantillons ont été analysés en triple à trois reprises. Les données sont la moyenne ± SD.
Afin de tester les biofilms multi-espèces en co-culture avec des cellules épithéliales, nous avons examiné l'impact de déplacer le biofilm des conditions anaérobies dans les AS à 5% de CO 2 en KSFM. Pour ce faire, nous avons évalué la composition de biofilm comme décrit ci-dessus. Aucune différence significative n'a été observée dans la composition et la quantité des 4 espèces au sein du CO 2 biofilm à 4 et 24 h (figure 2D). Il n'y avait pas de différence significative entre 24 h biofilms formés dans des conditions anaérobies et celles qui étaient alors placés dans CO 2 pour 24 heures supplémentaires. Ces biofilms ont ensuite été utilisés dans un système de co-culture pour étudier les propriétés biologiques des deux agents bioactifs différents.
Étudier les effets des agents bioactifs dans plusieurs espèces de modèle de co-culture de cellules épithéliales biofilm
d'abord, afin d'optimiser les concentrations de RSV et CHX à tester dans ce modèle nous avons entrepris des tests de cytotoxicité sur les cellules épithéliales et sur les cellules épithéliales biofilms.Oral été traités pendant 30 minutes avec trois concentration du CHX actif antimicrobien (0,01, 0,05, 0,2% v /v ) et RSV actif anti-inflammatoire (0,01, 0,05, 0,5% p /v) avant le lavage avec du PBS et mis à incuber pendant 4 à 24 heures avant que la viabilité cellulaire a été mesurée évaluée en utilisant un dosage AlamarBlue®. Les données ont montré une diminution significative (p & lt; 0,001) de la viabilité cellulaire par rapport aux témoins non traités, les médias lorsque les cellules épithéliales sont mises en incubation avec CHX à toute concentration pour les 4 à 24 heures (figure 3A). Lorsque les cellules épithéliales ont été co-cultivées avec RSV diminution significative de la viabilité cellulaire par rapport au contrôle des supports ont été observés en utilisant de 0,05 à 0,5% en poids /concentration c de RSV à la fois 4 (p & lt; 0,001) et 24 h (p & lt; 0,01), avec une diminution d'environ 50% de la viabilité cellulaire à chaque fois (figure 3B) .Next, à partir de ces données les concentrations prises en avant pour le reste de l'étude était de 0,2% v /v CHX et 0,01% p /v de RSV. biofilms multi-espèces ont été traitées avec les concentrations de substances actives choisies pendant 30 min et la viabilité biofilm mesurée en utilisant un dosage AlamarBlue® (figure 3C). Traitement du biofilm multispécifique avec le VRS n'a pas affecté significativement la viabilité biofilm par rapport au témoin non traité d'un biofilm. Cependant, le traitement avec CHX a montré une réduction significative (p & lt; 0,001) de 75% dans la viabilité des bactéries par rapport à la biofilm.To non traitée de déterminer si le traitement avec ces actifs modifié la composition des espèces du biofilm, ils ont été traités pendant 30 min, puis l'ADN extraction et la quantification de chaque espèce effectuées par qPCR (figure 3D). Les données montrent aucun changement significatif dans la composition après un traitement de 30 minutes avec CHX ou RSV par rapport au biofilm non traité. Pour étudier plus cet effet une analyse SEM a été réalisée pour examiner l'impact de chaque actif sur l'architecture des biofilms post-traitement (Figure 3E-J). CHX a semblé déstabiliser le biofilm, la complexité du biofilm a été réduite, alors que le RSV semble avoir aucun effet visuel sur l'architecture. Figure 3 Effet direct des actifs sur les cellules épithéliales orales et biofilms multi-espèces. La lignée cellulaire épithéliale orale OKF6-TERT2 a été ensemencée à 1 x 105 cellules /ml dans des plaques de 24 puits pour les études de toxicité. Les cellules ont été traitées avec des concentrations de chlorhexidine (0,01, 0,05, 0,2% v /v) (A) et le RSV (0,01, 0,05, 0,5% p /v) (B) pendant 30 minutes avant lavage avec du PBS. La viabilité cellulaire a été évaluée en utilisant le test Alamarblue® avec absorbance a été lue à 570 nm et 600 nm. Suite à cette concentrations choisies pour le reste de l'étude ont été CHX 0,2% (v /v) et RSV 0,01% (p /v). Pour étudier le rôle des actifs dans biofilm biofilms de traitement ont été cultivées sur des lamelles en plaques de 24 puits pendant 6 jours, comme décrit précédemment. biofilms matures ont été traitées avec 0,2% v /v CHX et 0,01% p /v de RSV pendant 30 minutes avant lavage avec du PBS. Biofilm viabilité a été mesurée à l'aide Alamarblue® lue à 570 nm et 600 nm (C). L'ADN bactérien a été extrait et chaque espèce quantifiée en utilisant qPCR SYBR Greener ™ à base (D). Biofilms ont également été analysés par MEB à la fois 2000x (E, G, I) et 5000 x (F, H, J). Les échantillons ont été traitées et visualisées sur un microscope électronique à balayage Jeol JSM-6400 et des images assemblées à l'aide du logiciel Photoshop. biofilms non traitées (E, F) ont été comparés avec les biofilms traités avec 0,2% (v /v) CHX (G, H) et 0,01% (p /v) de RSV (I, J). Les échantillons ont été analysés en triple à trois reprises et des données séparées sont la moyenne ± SD (** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001).
Ensuite, nous avons évalué les effets de la non traitée biofilm multi-espèces stimulée OKF6 des cellules pour assurer le biofilm induite par des médiateurs inflammatoires. En utilisant la RT 2 nous avons comparé les profils biofilm aux cellules stimulées par des cellules de contrôle de médias après 4 h pour déterminer les caractéristiques inflammatoires du modèle (tableau 2). Des augmentations significatives ont été observées pour tous les gènes sur la RT 2 profileur choisis selon leur expression au cours de la gingivite expérimentale induite chez des sujets humains, allant de 4,39 fois le changement (CCL1) à 249,8 facteur de changement (IL-8), avec une moyenne fold change de 60 par rapport au contrôle des médias non stimulées. Ces données ont été vérifiées en examinant l'IL-8 en utilisant des amorces spécifiques au sein d'une transcriptase inverse (RT) qPCR essai (figure 4B). Une importante augmentation a été observée d'un changement 15,57 fois (p & lt; 0,001) après 4 h et 312,88 fois le changement (p & lt; 0,001) après 24 h par rapport au contrôle des médias (tableau 2). Finalement, nous avons évalué les surnageants cellulaires pour la libération d'IL-8 au sein de ce système, où il a été montré que, après 4 h (535 ng) et 24 h (450 ng) que l'IL-8 libération a augmenté significativement (p & lt; 0,001 ) par rapport aux commandes multimédias non traitées (figure 4C). Sur la base de ces données collectives, nous avons démontré que le biofilm 4-espèces a des propriétés inflammatoires reproductibles au sein d'une co-culture épithéliales model.Table 2 Réponse Pro-inflammatoire à biofilms non traitées
Gene
augmentation de pliage moyenne
SD (±)
importance
IL-1
10.820
8,918
p & lt ; 0,05
IL-1B
12,662
1.161
p & lt; 0,05
IL-6
31,876
2.366
p & lt; 0,001
TNF
48,821
24,623
p & lt; 0,001
CSF-2
59.200
28,294
p & lt; 0,001
Le CSF-3
43.331
37.126
P & lt; 0,001
IL-8
249,805
189,93
p & lt; 0,001
CXCL1
121,892
56,676
p & lt; 0,001
CXCL3
63,843
26,213
p & lt; 0.001
CXCL5
14.435
14.474
n/s
CCL1
4.397
4.629
n/s
La figure 4 CHX et RSV immunomodulate les réponses des cellules epitheliales à multispécifique biofilm co-culture in vitro. La lignée cellulaire épithéliale orale OKF6-TERT2 a été ensemencée à 1 x 105 cellules /ml dans des plaques de 24 puits pour co-culture avec des biofilms multi-espèces. Biofilm ont été préalablement traitées avec 0,2% (v /v) CHX ou des cellules ont été traitées avec 0,01% (p /v) de RSV pendant 30 minutes avant lavage avec du PBS, puis co-cultivées avec des biofilms ou des cellules non traitées, respectivement 4 et 24 heures. le contrôle non traité co-culture ont également été inclus. L'ARN a été extrait à partir des lysats de cellules à 4 h, l'ADNc a été synthétisé et l'expression des gènes pro-inflammatoires quantifiée sur une plaque profileur RT2 (A). Des échantillons en double de trois expériences indépendantes ont été utilisées et les données sont la moyenne ± SD par rapport au contrôle des médias. Des échantillons ont également été testés pour l'IL-8 par rapport à l'entretien ménager gène GAPDH à 4 et 24 h en utilisant en utilisant SYBR® Greener ™ à base de qPCR (B). Les surnageants ont été analysés pour l'IL-8 exogène, mesurée par ELISA (C). Les échantillons ont été dosés en triple exemplaire à partir de trois expériences indépendantes, les données sont la moyenne ± SD (** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001).
Nous avons ensuite déterminé comment le traitement CHX du biofilm affecté l'inflammation. Le modèle de co-culture a été utilisée avec les biofilms traités avec 0,2% CHX pendant 30 min. Après co-culture des lysats de cellules épithéliales et les surnageants ont été retirés pour être testés pour une augmentation gènes et des marqueurs inflammatoires de protéines. Un film biologique non traité et les cellules épithéliales non en co-culture avec le biofilm multi-espèces ont été utilisées comme témoins. Après 4 h co-stimulation avec les biofilms CHX traités, nous avons montré aucune différence significative dans l'expression des gènes en utilisant la RT 2 profileur, bien que l'IL-8 et CXCL1 ont notamment diminué (figure 4A). Une analyse plus poussée de l'IL-8 en utilisant qPCR à nouveau montré aucune différence significative dans l'expression à 4 h, tandis qu'à 24 h une diminution significative de 5,65 fois a été observée dans la CHX cellules traitées biofilm stimulées (p & gt; 0,001) (figure 4B). IL-8 expression de la protéine a également été mesurée à 4 et 24 h par ELISA. Une réduction significative (p & lt; 0,001). De l'IL-8 de protéine a été observée à 4 h (10 fois) et à 24 h (13 fois) par rapport aux témoins non traités (figure 4C)
Finalement, nous avons évalué la effet de RSV traité les cellules épithéliales dans le modèle de co-culture. Les cellules epitheliales ont été traitées pendant 30 min avec le VRS, lavées et co-incubées avec des biofilms non traités pendant 4 h et 24 h. RT 2 profileur n'a montré aucune différence significative dans l'expression du gène au bout de 4 h par rapport aux biofilms non traités (figure 4A). Une analyse plus poussée de l'IL-8 à 4 et 24 h a également montré aucune différence significative dans les niveaux d'expression (figure 4B). Cependant, une diminution significative de l'IL-8, les taux de protéines à 4 h (25 pliage; p & lt; 0,001) et 24 h (13 pliage; p & lt; 0,01) ont été observées par rapport au modèle de co-culture d'un biofilm non traitée (figure 4C Rapport
Utilisation expérimentale in vitro
modèles de biofilm pour étudier les interactions entre les biofilms et héberger les cellules épithéliales) de. Il est essentiel de comprendre les mécanismes de la pathologie de la maladie et comment actifs peuvent influencer la réponse de l'hôte. En utilisant ce modèle de biofilm multi-espèces sur mesure, nous avons démontré que la réponse inflammatoire épithéliale à biofilms multi-espèces peut être modifiée en présence de composés antimicrobiens et anti-inflammatoires.
Le spectacle de données co-culture de cellules épithéliales et non traitée à plusieurs -species biofilms produisent une augmentation significative dans les deux gènes et l'expression protéique à 4 et 24 h. les niveaux d'IL-8 protéines ont été significativement augmentés à 4 et 24 h en co-culture de cellules épithéliales et non traitées biofilms multi-espèces par rapport aux cellules ne contrôle. En outre, l'augmentation de l'expression des gènes d'une variété de chimiokines pro-inflammatoires et de cytokines, notamment l'IL-6, IL-8, le TNF, le CSF-2, et CXCL1 CXCL3 à 4 heures par rapport aux cellules de contrôle ont été observées uniquement. Ces changements dynamiques de médiateurs pro-inflammatoires démontrent qu'il y a interaction entre le complexe biofilm et les cellules épithéliales. Toutefois.
