Constatations Résumé de l'arrière-plan de l'animal et chez l'homme ont indiqué qu'une suspension d'hydroxyde de calcium huileux (ESEO ) peut améliorer la cicatrisation précoce dans le traitement de la parodontite. L'hydroxyde de calcium comme composant principal est bien connu pour son activité antimicrobienne, mais à l'heure actuelle l'effet de ESEO sur l'influence de la plaie parodontale guérison /régénération est encore très limitée. Le but de cette étude in vitro était d'étudier l'effet de ESEO sur les bactéries parodontopathogènes ainsi que sur l'attachement et la prolifération des ostéoblastes et les fibroblastes du ligament parodontal.
Méthodes
ostéoblastes humaines alvéolaires (HAO) et ligament parodontal (PDL ) fibroblastes ont été cultivés sur 3 concentrations de ESEO (2,5, 5 et 7,5 mg). Adhésion et la prolifération ont été comptées jusqu'à 48 h, et la minéralisation a été analysée après 1 et 2 semaines. activité inhibitrice de croissance plus potentiel sur les micro-organismes associés à la maladie parodontale (par exemple, Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia
, Actinobacillus actinomycetemcomitans
), ainsi que l'influence de parodontopathogènes et ESEO sur les HAO et PDL fibroblastes compte ont été déterminées.
Résultats
une augmentation de plus de 2 fois dans les cellules adhérentes HAO a été observée à 4 h après l'application de ESEO par rapport au groupe témoin (p = 0,007 pour 2,5 mg). La prolifération des cellules HAO à 48 h a été stimulé par des concentrations modérées (2,5 mg, 5 mg) de ESJO (de chaque lt p &; 0,001), tandis qu'une concentration élevée (7,5 mg) de ESJO était inhibitrice (p = 0,009). Minéralisation n'a été observée que pour les cellules traitées avec HAO ESEO. ESEO n'a pas exercé un effet positif sur l'attachement ou la prolifération des fibroblastes PDL. Bien que ESEO n'a pas eu un effet antibactérien, il a une influence positive sur l'attachement et la prolifération des cellules HAO et les fibroblastes PDL en présence d'parodontopathogènes.
Conclusions
Les données actuelles suggèrent que ESEO favorise l'attachement des ostéoblastes, la prolifération et la minéralisation dans un concentration-dépendante manière et les résultats sont maintenus en présence d'agents pathogènes parodontaux
Mots-clés
grasses hydroxyde de calcium suspension ostéoblastes alvéolaires humaines fibroblastes ligamentaires parodontopathogènes électronique matériel supplémentaire parodontale
la version en ligne de cet article (doi:. 10. 1186 /1472-6831-14-9) contient du matériel supplémentaire, qui est disponible pour les utilisateurs autorisés.
Contexte
parodontite est une maladie inflammatoire chronique provoquée par des bactéries, et un déséquilibre du système immunitaire défense innée contribue nettement à la destruction du parodonte [1]. Un petit groupe d'anaérobie principalement Gram négatif ou des bactéries microaérophiles au sein de la plaque est associée à l'initiation et la progression de la parodontite. Les organismes fortement impliqués comme agents étiologiques de parodontite comprennent Actinobacillus actinomycetemcomitans
, Porphyromonas gingivalis
, Tannerella forsythia et Treponema
denticola
[2]. En outre, d'autres espèces telles que Campylobacter rectus
, Eubacterium nodatum
, Fusobacterium nucleatum
, Prevotella intermedia
, Parvimonas micra, Streptococcus constellatus
soutien pathogenèse de la maladie [2, 3]. Les bactéries agissent sur les cellules hôtes pour résultat l'expression de médiateurs de l'inflammation, de la transition de polynucléaires neutrophiles de la crevasse gingivale [1, 4]. réponse hôte contribue à la destruction des tissus et la résorption osseuse avec le mécanisme principal du rapport de RANKL (récepteur activateur du ligand nucléaire facteur-kB) à ostéoprotégérine [1].
Il a été bien documenté que la résolution de l'inflammation et arrêter de progression de la maladie peut être prévisible obtenue avec un traitement parodontal chirurgical nonsurgical et conventionnel [5]. Le but ultime de la thérapie parodontale est cependant la régénération des structures de support de la dent perdue en raison de la maladie parodontale et devrait aboutir à la formation d'un nouveau cément, ligament parodontal et l'os [6]. Le traitement avec des membranes de barrière seuls ou en combinaison avec différents matériaux de greffage, l'utilisation de substances actives biologiques telles que les protéines de matrice d'émail ou des facteurs de croissance ont été montrés pour favoriser périodontique régénération et d'améliorer significativement les résultats cliniques attestées par sondage réduction de la profondeur, le gain d'attache clinique et le défaut de remplissage [7]. Quelques-uns des matériaux ont été décrits pour agir antimicrobiens, e.g.
, Des dérivés de matrice de l'émail inhibent la croissance de P. gingivalis
[8]. Une étude de l'analyse de l'influence des cinq différents biomatériaux utilisés pour la chirurgie parodontale régénérative contre deux actinomycetemcomitans
a montré une activité antimicrobienne de deux matériaux contre l'une des deux souches testées, la plupart des inhibiteurs est une suspension d'hydroxyde de calcium huileux [9].
Cette grasse pâte d'hydroxyde de calcium contenant (ESEO) (Osteora®, précédemment Osteoinductal®, DFS-Diamon GmbH Riedenburg, Allemagne) a été suggéré de posséder des propriétés qui peuvent avoir une incidence positive sur la cicatrisation parodontale /régénération [10-14]. Elle est basée sur l'hydroxyde de calcium (Ca (OH)
2) et utilise une substance porteuse consistant en produits synthétiquement oleum pedum porcine et la vaseline blanche. L'hydroxyde de calcium, une poudre blanche inodore ayant une faible solubilité dans l'eau, a des propriétés antibactériennes par la libération d'ions hydroxyles très réactifs dans les fluides aqueux qui endommage cytoplasmiques membranes, les protéines et l'ADN [15]. Dans le traitement endodontique, il est utilisé comme agent de coiffage pulpaire [16], en tant que désinfectant pour le traitement du canal radiculaire [17] et pour la pâte après la mort apexification [18]. Dans la pulpe, une nécrose superficielle induite par le pH élevé se produit avec une légère réaction inflammatoire et la formation de tissu dur dans l'environnement [19].
Plusieurs études animales qui ont évalué les effets de ESEO sur la régénération osseuse dans divers types de défauts les résultats cédés différents [10, 11, 20, 21]. Dans un modèle de régénération osseuse guidée à l'aide calvaria minipig, ESJO n'a pas réussi à exercer des propriétés ostéoinductives et la cicatrisation osseuse entravée lorsqu'il est utilisé en conjonction avec la régénération osseuse guidée [22]. En outre, la cicatrisation des implants intra-osseux n'a pas été améliorée lorsque ceux ont été insérés conjointement avec ESJO [21]. D'autre part, l'application de ESEO pendant la phase d'ostéotomie de distraction ostéogenèse améliorée formation d'os nouveau [10] tandis que dans les défauts parodontaux intra-osseux expérimentalement créé, l'application de ESEO en conjonction avec la chirurgie formant volet d'accès promu la régénération parodontale [11].
les résultats variant liés à la cicatrisation et la régénération ont également été trouvés dans les études cliniques. Dans une étude, ESEO améliorée tôt la cicatrisation lorsqu'il est utilisé conjointement avec une thérapie non chirurgicale [12]. Dans un autre essai clinique contrôlé évaluant la guérison des lésions intra-osseuses traités par chirurgie accès à rabat avec et sans ESEO, poche significativement plus élevée profondeurs des réductions et des gains au niveau d'attachement clinique ont été trouvés dans les défauts traités remplis de ESEO par rapport aux contrôles (c.-à-chirurgie à lambeau d'accès seul ) [13]. Au contraire, une autre étude clinique contrôlée récente utilisant une conception similaire n'a pas démontré des résultats supérieurs suite à l'application de ESEO par rapport à la chirurgie accès à rabat seul [23].
Bien que beaucoup de recherches ont été obtenues dans des modèles animaux et cliniques , la connaissance de son mode d'action et les effets sur le ligament parodontal cellules (PDL), ostéoblastes osseuses formant ainsi que les microbes oraux est encore limitée. Le but de la présente étude était double; 1) Pour déterminer une activité antimicrobienne potentielle de ESEO y compris ses composants contre les espèces bactériennes impliquées dans la pathogenèse de la parodontite et 2) pour déterminer l'effet sur l'attachement et la prolifération des cellules hôtes (fibroblastes du ligament parodontal et ostéoblastes).
Méthodes
les substances d'essai
ESEO (Osteora®, DFS-DIAMON GmbH, Riedenburg, Allemagne) a été utilisé. Selon les informations du fabricant, il est composé de 20% p /p Ca (OH) 2, 40% pedum oléum et 40% la vaseline blanche. Dans la conception expérimentale l'utilisation de ESEO lui-même ainsi que Ca (OH) 2 et oleum pedum ont été utilisés comme substances d'essai.
Détermination de l'efficacité antimicrobienne de grasse suspension d'hydroxyde de calcium
Les espèces suivantes ont été testées dans les essais antimicrobiens: F. nucleatum
ATCC 25586, P. intermedia
ATCC 25611, P. gingivalis de (ATCC 33277 et trois isolats cliniques), T. forsythia
ATCC 43037, A. actinomycetemcomitans
(Y4 et trois isolats cliniques), C. rectus
ATCC 33238, Eikenella corrodens
ATCC 23834, E. nodatum
ATCC 33099, P. micra
ATCC 33270, et Capnocytophaga gingivalis
ATCC 33624. Toutes les souches ont été précultivées à 37 ° C dans des conditions appropriées (anaérobie sauf pour A. actinomycetemcomitans
- 5% de CO 2) 42 h avant les expériences. agar trypticase soja modifié [24] a été utilisé comme milieu de culture.
abord, la technique de dilution micro-bouillon a été utilisé pour déterminer les CMI. Après subculture des souches bactériennes, un inoculum définie (McFarland 0,5) a été ajouté dans un rapport de 1: 9 à un bouillon contenant les substances d'essai. Oléum-pedum (solubilisé avec du Tween 20 dans un rapport 1: 1) a été testée à une concentration de 0,625% - 20%, Ca (OH) 2 en une concentration de 3,13 mg /ml - 100 mg /ml, adapté pour la concentration disponible dans ESJO. Dans les essais d'expériences oleum pedum, chaque tube d'essai contenait 20% de Tween 20. Après un temps d'incubation de 42 h (18 h) aérobies, la croissance des microbes a été analysée par un contrôle visuel de la turbidité et repiquages. Pour ESEO agents comme solvant DMSO, Tween 20 et différentes huiles ont été prouvés, mais il était impossible de solubiliser ESEO. Par conséquent, les méthodes standard pour la détermination de l'activité antimicrobienne contre les anaérobies et d'autres micro-organismes à croissance lente (microdilution-dilution, agardilution) ne sont pas applicables. Enfin, une méthode de diffusion sur gélose modifiée a été utilisée comme suit: Cent pi de suspension bactérienne (0,5 MacFarland) ont été étalées sur des plaques de gélose (gélose de Wilkins-Chalgren supplémenté avec 5% de sang). Ensuite, chacun deux lacunes ont été préparées en utilisant un perce-bouchon (7 mm de diamètre). Après cela, l'écart a été rempli avec 100 pl de gélose suivie par la substance d'essai (50 mg et 100 mg de ESJO). Après incubation à 37 ° C dans l'atmosphère anaérobie pendant 42 h, les zones d'inhibition ont été mesurés.
Pour exclure un effet de ESEO favorisant la croissance, des suspensions de souches bactériennes sélectionnées (P. gingivalis
ATCC 33277, P. gingivalis de M5-1-2, A. actinomycetemcomitans
Y4 et F. nucleatum
ATCC 255866) ont été ajoutés à 200 ul de bouillon additionné de 50 mg de substance nutritive ESJO (20% p /v). Tubes avaient été incubé pendant 24 h en anaérobiose. Immédiatement avant de retirer 25 ul de mélange, les suspensions ont été mélangées par tourbillonnement et courte centrifugation à 400 g
. On a éliminé le 25 ul ont été dilués en série et chaque 100 pi ont été étalées sur des plaques d'agar. Le nombre de bactéries viables ont été déterminées par comptage de la unités formant colonie (ufc).
Effet de l'hydroxyde de calcium huileux suspension sur les ostéoblastes et les fibroblastes du ligament parodontal
Dans la deuxième partie de l'étude, les ostéoblastes alvéolaires humaines (HAO) comme ainsi que les fibroblastes humains PDL ont été utilisés. deux types de cellules ont été obtenus à partir de trois patients au parodonte sain pendant la chirurgie (extraction de dents pour des raisons orthodontiques). les fragments d'os humains ont été cultivés à partir d'un modèle d'expiant comme décrit précédemment [25, 26]. Après digestion de collagénase, les cellules ont été étalées dans HAO flacons T-75 contenant un milieu de culture cellulaire (DMEM, Invitrogen, Carlsbad, CA) complété avec 10% de sérum fœtal bovin (FBS, Invitrogen). PDL cellules ont été récoltées à partir de la troisième partie du milieu de la dent et placées dans des flacons T-25 de culture de cellules jusqu'à la confluence cellulaire [27]. Le milieu de culture est du DMEM complété avec 10% de FBS. Pour les expériences, les deux types cellulaires ont été utilisés à partir des passages 4-6. L'identité des cellules a été confirmée récemment décrit [26, 27]. En utilisant le tissu à des fins de recherche a été approuvé par la commission d'éthique du canton de Berne. Tous les patients ont donné leur consentement.
Dans les expériences, les lames ont été placées dans des plaques à 24 puits et recouvertes avec des substances d'essai. Les substances d'essai ont été ESJO à trois concentrations différentes (U 1, U 2, 3 U). 1 U représenté 2,5 mg de matière totale (ce qui signifie 2 U est équivalent à 5 mg et 3 U à 7,5 mg). En outre, l'hydroxyde de calcium en solution aqueuse (1,5 mg correspondant à 3 U ESJO) et d'oléum pedum substance (3 mg correspondant à 3 U ESJO) ont été utilisées. diapositives non couvertes ont servi de contrôles négatifs. Immédiatement après, les cellules ont été ajoutées HAO à une densité de 10.000 cellules /puits et les puits ont été incubées à 37 ° C avec 5% de CO 2. Les cellules ont été fixées et colorées pour les expériences d'adhésion et la prolifération à 2 h, 4 h, 24 h et 48 en utilisant la coloration DAPI. La différenciation cellulaire a été analysée par détermination de l'activité de la phosphatase alcaline et de la minéralisation en utilisant 2% alizarine S coloration 1 et 2 semaines après le semis. Chaque 10 champs de 1 mm 2 ont été comptés. Les champs ont été choisis également distribués à partir de la diapositive entière. Une grille de comptage a été utilisé et chaque sous-champ (50 pm x 50 pm) avec une coloration positive pour noduli de calcium a été prise en compte par rapport au nombre total des sous-zones; la moyenne a été utilisée comme une valeur unique pour l'analyse. La minéralisation a été mesurée 1 et 2 semaines après le début des expériences. Faire en sorte que seule la minéralisation des cellules a été compté, ESJO sans cellules a été utilisé comme témoin négatif.
De même pour les cellules HAO, les effets sur les fibroblastes PDL ont été déterminés. Les diapositives qui ont été placées dans des plaques à 24 puits ont été recouvertes avec des substances d'essai. PDL fibroblastes ont été ajoutés à une densité de 10.000 cellules /puits. Les cellules ont été fixées et colorées pour l'adhérence et pour les expériences de prolifération à 2 h, 4 h, 24 h et 48 h en utilisant la coloration DAPI comme décrit pour les cellules HAO.
Détermination de l'effet des huileux suspension d'hydroxyde de calcium sur PDL les fibroblastes et les ostéoblastes interactions avec des microorganismes
la concentration de 2 U (5 mg) a été ESEO
cellules HAO et les fibroblastes PDL sélectionné et placé sur chaque puits d'une plaque de 24 puits pour des expériences axées sur l'interaction des cellules hôtes avec des souches bactériennes. respectivement ont été ensemencées sur les lames avec et sans couverture de 2 U de ESEO. A. actinomycetemcomitans
Y4 ainsi que la combinaison de P. gingivalis
ATCC 33277, T. forsythia
ATCC 43037 et T. denticola
ATCC 35405 ont été ajoutés. La charge bactérienne était toujours 10 6 par puits. Les cellules HAO et les fibroblastes PDL respectivement ont été fixées et colorées à 4 h.
Analyse statistique
Sauf pour les essais antimicrobiens (réplicats indépendants) au moins six expériences indépendantes ont été faites par groupe. Plus de deux groupes indépendants ont été comparés par une analyse de variance suivie par analyse post hoc de LSD pour la comparaison avec les contrôles (activité de ESEO et ses composants sur les cellules HAO et les fibroblastes PDL). L'analyse statistique a été faite en utilisant le test t de Student pour deux échantillons indépendants (effet de ESEO sur les cellules HAO d'interaction »et les fibroblastes PDL de l'interaction avec les bactéries).: Résultats
Grasses suspension d'hydroxyde de calcium n'agit pas
antibactérien les valeurs de CMI de oleum pedum et de l'hydroxyde de calcium (les principales composantes de ESEO) sont présentés dans le tableau 1. Alors que pedum oleum n'a pas exercé un effet antibactérien, Ca (OH) 2 était inhibitrice; les valeurs de CIM étaient dans la gamme de 6,25 à 25 mg /1 ml.Table concentrations minimales inhibitrices des composants de ESJO (porcin pedum oléum et de l'hydroxyde de calcium), déterminé par la technique de dilution en micro-bouillon
-oleum pedum Porcine
Ca (OH) 2
F. nucleatum
ATCC 25586
& gt; 20%
6,25 mg /ml
P. intermedia
ATCC 25611
& gt; 20%
6,25 mg /ml
P. gingivalis
ATCC 33277
& gt; 20%
12,5 mg /ml
P. gingivalis
M5-1-2
& gt; 20%
12,5 mg /ml
P. gingivalis
J430-1
& gt; 20%
25 mg /ml
P. gingivalis
Marl
& gt; 20%
25 mg /ml
T. forsythia
ATCC 43037
& gt; 20%
12,5 mg /ml
A. actinomycetemcomitans
Y4
& gt; 20%
12,5 mg /ml
A. actinomycetemcomitans
J1
& gt; 20%
12,5 mg /ml
A. actinomycetemcomitans
J2
& gt; 20%
12,5 mg /ml
A. actinomycetemcomitans
J7
& gt; 20%
25 mg /ml
C. rectus
ATCC 33238
& gt; 20%
12,5 mg /ml
E. corrodens
ATCC 23834
& gt; 20%
50 mg /ml
E. nodatum
ATCC 33099
& gt; 20%
12,5 mg /ml
P. micra
ATCC 33270
& gt; 20%
25 mg /ml
C. gingivalis
ATCC 33624
& gt; 20%
12,5 mg /ml
Comme mentionné dans les matériaux et les méthodes, en raison de l'insolubilité de ESEO, une technique de diffusion sur gélose modifiée a été utilisée pour déterminer un éventuel effet antimicrobien ESEO. Ces expériences ont toutefois révélé aucune zone d'inhibition par ESEO dans les deux concentrations testées. Les dernières expériences cultivant des suspensions bactériennes dans un bouillon nutritif souligné que ESEO n'a aucune influence sur la croissance de parodontopathogènes en aucune façon. Ni la croissance ni suppression des effets favorisant la croissance étaient visibles; les différences de contrôles étaient toujours en dessous de 0,2 log 10 ufc (données non présentées). Il convient de noter qu'en raison de l'insolubilité du Ochs, les tubes contenaient deux couches; un des ESEO et l'un de bouillon. Ainsi, seuls les composés d'interface libérés de ESEO peuvent interférer avec les bactéries.
Grasses suspension d'hydroxyde de calcium peut favoriser l'adhésion des ostéoblastes et la minéralisation, mais ne pas affecter l'adhérence et la prolifération des fibroblastes Addition de PDL de ESEO promu la fixation des cellules HAO . Après 2 h, 11,00 ± 4,90 cellules /mm 2 adhéré à une surface couverte de 2 U de ESEO. Utilisation de 3 U la valeur était 11,67 ± 2,89 cellules /mm 2. Ces différences étaient significatives par rapport à la commande, où 6,57 ± 3,55 cellules HAO ont été trouvés par mm 2 sur la surface. Après 4 h, 20,33 ± 14,13 HAO cellules /mm 2 ont été comptées après la couverture avec 1 U de ESEO et 18,11 ± 6,66 HAO cellules /mm 2 lorsque 3 U de ESEO ont été utilisés étant significativement différents des contrôles ( 8,67 ± 3,50 cellules HAO /mm 2). prolifération Stimulé a été trouvé 48 h après le début des expériences et de la couverture avec 1 U et 2 U de ESEO (1 U: 46.00 ± 13.11 HAO cellules /mm 2, 2 U: 46.67 ± 18.23 cellules HAO /mm 2 par rapport à contrôler: 26.89 ± 7.25 cellules HAO /mm 2). Contrairement au 1 U et 2 U de ESEO, la forte concentration de 3 U inhibé de manière significative la prolifération des cellules HAO (13,44 ± 5,20 HAO cellules /mm 2). Une influence de la Ca utilisé (OH) 2 concentration n'a pas été enregistrée. Avec de l'oléum couverture pedum a été suivie par une diminution du nombre de cellules 24 h après l'addition des cellules. Les résultats, y compris des valeurs significatives sont présentées dans la figure 1. Figure 1 jointe et la prolifération des A) cellules HAO et B) des fibroblastes PDL (moyenne et SD) chaque après couverture avec différentes quantités de suspension d'hydroxyde de calcium huileux (ESEO), ainsi que 1,5 mg Ca (OH) 2 et 3,0 mg oleum pedum (valeurs de p en comparaison avec les contrôles ont été déterminées par analyse post-hoc LSD après ANOVA).
La différenciation et la minéralisation des cellules HAO ont également été analysées. Dans toutes les expériences que les cellules HAO positivement colorées pour la phosphatase alcaline ont été trouvés. Sans ajout de ESEO, aucune minéralisation était présent à la surface. Lorsque la surface a été recouverte d'ESEO, la minéralisation extracellulaire de HAO était détectable après une semaine (5,57 ± 1,97% de la zone tachée; Figure 2). La quantité n'a pas changé de façon significative après deux semaines (4.12 ± 1.59%). Figure 2 Cellule minéralisation tachée de rouge alizarine une semaine après l'ensemencement des cellules HAO. La minéralisation est visible par la couleur rose (→), A) Les cellules HAO non traitées, B) cellules HAO ensemencées sur ESEO.
Ajout de ESEO n'a pas eu d'influence significative sur l'attachement des fibroblastes PDL. prolifération réduite a été trouvé 48 h après le début des expériences et de la couverture avec 3 U de ESEO (13.22 ± 4.12 PDL fibroblastes /mm 2) en comparaison avec les contrôles (33,89 ± 17,48 PDL fibroblastes /mm 2). En revanche, Ca (OH) 2 stimule la prolifération des fibroblastes PDL (53,44 ± 15,22 PDL fibroblastes /mm 2 par rapport aux valeurs de contrôle au 48 h point de temps (Figure 1).
Les résultats a suggéré un effet cytotoxique possible. par conséquent, les cellules HAO et les fibroblastes PDL ont été ensemencées sur des lames recouvertes de substances d'essai comme décrit ci-dessus. les cellules ont été mises en incubation pendant 4 h et 48 h. Ensuite, le pourcentage de cellules viables a été déterminé par trypan test d'exclusion au bleu. Le plus un pourcentage de cellules mortes remarquable plus élevée a toujours été trouvée après un prétraitement avec 1,5 mg de Ca (OH) 2 en comparaison avec les témoins (chaque p & lt; 0,001). La viabilité des cellules déterminée par test d'exclusion au trypan modifié légèrement après prétraitement avec ESEO, la différence aux témoins non traités a été significative pour les fibroblastes PDL 4 h après le début des expériences (Figure 3). Figure 3 Pourcentage de A viable) cellules HAO et B) des fibroblastes PDL (moyenne et SD) après couverture avec différentes quantités de huileux suspension d'hydroxyde de calcium (ESJO), ainsi que 1,5 mg de Ca (OH) 2 et 3,0 mg oleum pedum déterminé par test d'exclusion au trypan (p-valeurs par rapport aux témoins ont été déterminées par analyse post-hoc LSD après ANOVA).
Les bactéries ne nuisent pas à l'effet de la suspension huileuse de l'hydroxyde de calcium sur l'adhésion et la prolifération des ostéoblastes et les fibroblastes PDL
L'ajout de bactéries n'a pas changé de manière significative le nombre de cellules HAO adhérées lorsque les lames ont été recouvertes de 2 U de ESEO. Si A. actinomycetemcomitans
Y4 était présent, une augmentation des cellules HAO avec 2 U de ESEO (25,08 ± 10,04 HAO cellules /mm 2) était encore importante en comparaison avec ceux sans ESEO (contrôles). Étonnamment, l'ajout de bactéries amélioré le nombre de cellules HAO attachées (A. actinomycetemcomitans
Y4: 16.00 ± 4.44 cellules HAO /mm 2, P. gingivalis
, T. forsythia
, T. denticola
dans le mélange: 14.56 ± 4.07 cellules HAO /mm 2) étant sensiblement plus élevé que les contrôles (10,87 ± 8,43 HAO cellules /mm 2). Le contact avec des bactéries n'a pas influencé de façon significative le nombre de fibroblastes PDL attachés (figure 4). Figure 4 Fixation de A) cellules et B HAO) fibroblastes PDL (moyenne et SD) 4 h après la couverture avec et sans gras suspension d'hydroxyde de calcium (ESEO) et l'ajout de A. actinomycetemcomitans Y4 ainsi que la combinaison de P. gingivalis ATCC 33277 , T. forsythia ATCC 43037, T. denticola ATCC 35405 (valeurs p en comparaison avec les contrôles et sans ESEO respectivement chacune ont été déterminées par le test t de Student).
Discussion et conclusions
ESEO est une suspension huileuse qui contient Ca (OH) 2 en tant que constituant actif. D'autres composants sont les tauri oleum pedum produits synthétiquement, un matériau de support contenant des triglycérides, y compris l'acide d'huile, l'acide palmitine, l'acide hexadécén et la vaseline blanche.
Un effet antibactérien par ESEO n'a pas été observée même dans des concentrations extrêmement élevées en effectuant une modification agar diffusion tester. Une seule étude précédente a rapporté sur les effets de ESEO sur parodontopathogènes. Dans cette étude, ESEO agi inhibitrice sur A. actinomycetemcomitans
souche ATCC 33384 (sérotype c), mais aucun effet antibactérien a été observée après culture de A. actinomycetemcomitans
souche ATCC 43718 (sérotype b) avec ESEO [9]. Nous avons également inclus dans notre étude d'un isolat clinique appartenant au sérotype c. En contraste avec les résultats décrits précédemment [9], on n'a pas observé d'effet antibactérien après application avec ESEO dans la présente étude soit sur les souches testées de A. actinomycetemcomitans
.
En raison de l'insolubilité de la matière, nous étaient seulement capables de déterminer les concentrations minimales inhibitrices des composants individuels de ESJO par une technique de dilution en micro-bouillon. On a observé que, bien que l'oléum pedum n'a eu aucune propriété antibactérienne, l'utilisation d'hydroxyde de calcium à des concentrations élevées telles que celles présentes dans ESJO agi comme inhibiteur de croissance. L'hydroxyde de calcium est largement utilisé dans le traitement endodontique et preuves in vitro démontre qu'il supprime la croissance de Candida albicans
[28] et certains autres bactéries qui se développent en anaérobiose [29], bien que l'efficacité antimicrobienne limitée a traduit in vivo suite à l'analyse des canaux radiculaires après -Traitement [30, 31]. Dans nos essais in vitro, à la différence de l'hydroxyde de calcium, ESJO n'a pas eu d'effet anti-bactérien qui peut suggérer un effet antagoniste des autres composants du ESJO à l'hydroxyde de calcium. En raison de la nature de la thérapie parodontale, la bactérie associée à la périodontite doivent être éliminés ou réduits dans toute modalité de traitement. L'activité antimicrobienne manquante ESJO suggère l'utilisation additionnelle d'un agent antimicrobien tel que la chlorhexidine. Pour ces raisons, plus de 0,4% CHX à une pâte d'hydroxyde de calcium n'a pas d'incidence sur la biologie cellulaire ostéoblastique in vivo [32].
Dans la présente étude, nous avons étudié les effets de ESEO sur HAO sur l'attachement et la prolifération cellulaire. Nos résultats ont démontré un comportement accru cellulaire après culture avec ESEO et la sensibilité de la concentration démontrée. Faible à modérée des concentrations de ESEO ont agi clairement stimulatrice, alors que l'application avec une concentration de 3U (7,5 mg) a démontré en partie des résultats négatifs. Pour retarder la libération de Ca (OH) 2, ESEO contient un pourcentage élevé de oleum pedum. Nous avons étudié HAO compte cultivées en présence d'oléum pedum et trouvé une réduction du comportement cellulaire follwing son application. Oleum pedum semble neutraliser l'activité de stimulation de Ca (OH) 2. Dans un modèle animal en utilisant des capsules ouvertes en téflon, ESJO a inhibé la formation de l'os et une résorption active de ESJO n'a pas été observée [20]. Il peut être suggéré que les propriétés dégradables manquantes sont certainement de la pedum oleum et un effet plus prononcé semble être observée avec des concentrations croissantes. Une deuxième explication logique pourrait être due à la cytotoxicité de ESEO. Bien que oleum pedum empêche la cytotoxicité de Ca (OH) 2, les effets toxiques à un certain degré ont été observés lorsque ESEO a été utilisé à des concentrations élevées. Cette sensibilité évidente de la concentration utilisée pourrait expliquer en partie les différents résultats rapportés dans les études cliniques et animales. En conséquence, après nos premiers résultats séries d'expériences, une concentration modérée a été choisi pour des expériences en cours en fonction de ses résultats positifs. Grâce à cette concentration, une augmentation des ostéoblastes minéralisation a été trouvée 1 - 2 semaines après l'ensemencement avec des milieux de culture contenant ESEO. Récemment, il a été démontré que Ca (OH) 2 est capable de stimuler l'expression de l'ARNm de la sialoprotéine osseuse et Runx2 [33]. Runx2 est un facteur de transcription essentiel dans la différenciation ostéoblastique [34] et la sialoprotéine osseuse est un marqueur tardif de la différenciation ostéoblastique trouvée au cours du processus de minéralisation des ostéoblastes [35].
Malgré les effets stimulateurs de ESEO sur les ostéoblastes, ESEO n'a exercé aucune effet positif sur l'attachement ou la prolifération des fibroblastes PDL. De même à nos expériences HAO, la concentration utilisée le plus élevé de ESEO a également réduit la prolifération des fibroblastes PDL après 48 h. Prolifération des fibroblastes PDL a été induite par Ca (OH) 2 comme décrit récemment; mais contrairement à nos résultats, ESEO a également eu un effet stimulant sur la prolifération dans cette étude [36]. Dans une étude similaire [14] ces auteurs ont trouvé haute attachement des fibroblastes PDL sur les surfaces radiculaires ESEO traitées. Les recherches futures afin de déterminer les mécanismes qui influent sur la fixation des cellules par l'intermédiaire de l'intégrine ses mécanismes moléculaires en aval dans des cellules hôtes de liaison et (par exemple
. voies cellulaires) devrait étudier.
Après des essais expérimentaux de ESEO avec des cellules du parodonte, un co système -culture a été conçu pour déterminer l'influence de ESJO sur les cellules exposées à des agents pathogènes parodontaux simultanément pour simuler un environnement clinique. L'exposition des cellules HAO et les fibroblastes PDL à parodontopathogènes bactéries n'a pas influencé négativement l'effet de promouvoir la ESEO sur l'attachement et la prolifération de ces cellules. Par conséquent, les résultats de cette expérience démontrent l'utilisation potentielle de ESEO, même en présence d'agents pathogènes parodontaux sans affecter le bénéfice potentiel de ESEO. De manière surprenante, l'addition de bactéries amélioré le nombre de cellules attachées HAO. Ce résultat doit être pris avec prudence et pourrait être associée à des conditions de culture in vitro. L'effet a été particulièrement prononcé lorsque A. actinomycetemcomitans
a été utilisé. Le potentiel cytotoxique de parodontopathogènes est bien connu. Gingipains sont responsables de la majorité de l'activité protéolytique de P. gingivalis
[37] et sont capables d'inhiber la prolifération des ostéoblastes en provoquant un arrêt précoce G1 du cycle cellulaire [38]. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.
