Résumé de l'arrière-plan
implants en titane dans la cavité buccale sont recouvertes d'une pellicule de salive dérivé auquel colonisant début des micro-organismes tels que Streptococcus oralis
peut se lier. Les profils protéiques des pellicules salivaires sur le titane ne sont pas bien caractérisées et les protéines d'importance pour la liaison sont donc inconnus. bactéries biofilms présentent des phénotypes différents de leurs homologues planctoniques et le contact avec des protéines salivaires peut être un facteur qui contribue à l'induction de changements dans la physiologie. Nous avons caractérisé pellicule salivaire de surfaces en titane et étudié comment le contact avec des surfaces de titane non enrobés et de salive revêtu affecte l'activité métabolique dans des cellules adhérentes de S
. oralis
.
Méthodes
pellicules salivaire sur les surfaces lisses de titane ont été désorbés et ceux-ci ainsi que la salive humaine purifiée, ont été soumis à une électrophorèse sur gel bidimensionnelle et spectrométrie de masse. Un modèle d'écoulement cellulaire plaque parallèle a été utilisé pour étudier la liaison d'un nouvel isolat de S
. oralis
aux surfaces de titane non enrobés et de salive revêtu. L'activité métabolique a été évaluée en utilisant le kit de Vitalité Lumière CTC et confocale à balayage de la microscopie laser du Bac. Des expériences ont été réalisées en triple et les résultats analysés à l'aide de Student t
-test ou ANOVA.
IgA sécrétoires, α-amylase et cystatines ont été identifiés comme des protéines dominantes de résultats dans les pellicules salivaires. l'adsorption sélective de protéines a été démontrée par l'enrichissement de la prolactine inductible par la protéine et l'absence de zinc α
2 par rapport à la salive glycoprotéine. Adhérence de S
. oralis
de titane conduit à une régulation à la hausse de l'activité métabolique dans la population au bout de 2 heures. En présence d'une pellicule salivaire, cet effet a été renforcée et soutenue sur la période de 22 heures suivant
. Conclusions
Nous avons montré que l'adhésion à des surfaces lisses en titane sous flux provoque une régulation de l'activité métabolique au début orale colonisatrice S
. oralis
, très probablement dans le cadre d'une adaptation au mode de vie de biofilm. L'effet a été renforcé par une pellicule salivaire contenant slgA, α-amylase, et cystatines protéine prolactine inductible qui a été, pour la première fois, identifié comme étant un composant abondant de la pellicule salivaire de titane. D'autres études sont nécessaires pour clarifier les mécanismes sous-jacents l'effet du contact de surface sur l'activité métabolique, ainsi que d'identifier les protéines responsables de l'amélioration de l'effet salivaires.
Mots-clés
Bactéries Microbial biofilm Implant dentaire streptocoques électronique matériel supplémentaire
La version en ligne de cet article (doi:. 10 1186 /1472-6831-13-32) contient du matériel supplémentaire, qui est disponible pour les utilisateurs autorisés
Contexte
La cavité buccale humaine abrite un grand nombre de. différentes espèces bactériennes qui se trouvent dans complexes, biofilms multi-espèces. Sur les dents, ces biofilms sont généralement connus comme la plaque dentaire. Critique à la formation et le développement de la plaque est l'adhésion des espèces pionnières telles que Streptococcus oralis
, Streptococcus mitis
et Streptococcus gordonii
ainsi que Actinomyces naeslundii
à la pellicule salivaire qui recouvre la surface de la dent [1, 2]. Une fois que la formation de biofilm a été initialisé et la surface de la dent naissante est colonisé, co-adhésion des colonisateurs ultérieures conduisant à la formation de biofilms matures par voie orale [3]. Le développement précoce de biofilms sur les implants dentaires n'a pas été bien caractérisée, mais la séquence de la colonisation microbienne est pensé pour être similaire à celle des dents dans la même cavité buccale [4, 5].
Dents et des implants dentaires, ainsi que les surfaces muqueuses, sont recouvertes d'une pellicule qui est un film mince de protéines adsorbées principalement dérivé de la salive. protéines pelliculaires offrent un éventail de récepteurs potentiels pour la fixation des premiers colonisateurs. Une combinaison de in vivo et in vitro
études en utilisant des approches basées sur les anticorps et la protéomique, a montré que la pellicule d'émail acquise contient une gamme de différentes protéines salivaires notamment lysozyme, histatines, statherins [6], α-amylase , cystatines, IgA sécrétoires (sIgA), la lactoferrine et les protéines riches en proline (PRPS) [7], ainsi que la grande mucine salivaire, MUC5B [8]. Pour un résumé complet des protéines détectées dans les pellicules d'émail voir Siquiera et al
., 2012 [9]. La composition d'une pellicule adhérente, ainsi que de la densité et de la conformation des protéines présentes dans lui, est généralement considérée être influencée par les propriétés physico-chimiques du substrat mais, jusqu'à présent, la composition globale des pellicules salivaires formée sur des surfaces de titane modifiées différemment ne sont pas connus. Malgré l'existence de seulement quelques études, certaines protéines salivaires y compris cystatines SIGA, α-amylase et des protéines riches en proline ont été identifiés dans la pellicule adhérente formée sur le titane in vitro en utilisant
Western blot [10, 11]. Cependant, dans toutes ces études, les méthodes utilisées pour préparer la salive pour une utilisation en tant que pellicule peut avoir un impact important sur les résultats obtenus. Par exemple, les techniques de filtrage et de centrifugation peuvent supprimer les principales populations de protéines salivaires conduisant à la formation de pellicules salivaires qui ne sont pas représentatifs de ceux qui sont présents in vivo
.
La reconnaissance du fait que les biofilms microbiens sont un facteur important associé à l'échec des implants dentaires [12] a conduit à de nombreuses enquêtes sur l'adhésion bactérienne à des surfaces de titane. In vivo
, où l'adhérence des bactéries et la formation salivaire pelliculaire se produisent en parallèle, S
. oralis
et S
. mitis
ont été parmi les premiers colonisateurs prédominantes sur les surfaces de verre revêtues de titane et les espèces de Actinomyces aucun n'a été trouvée [13]. In vitro
, la présence de la salive sur les deux surfaces lisses ou modérément rugueuses a été montré à la fois augmenter et diminuer l'adhérence du début colonisatrice, S
. oralis
, [10, 14] tandis que la liaison de A
.
naeslundii au titane n'a pas été affectée par la présence d'une pellicule salivaire [11]. Dans l'ensemble, les résultats des études de l'adhérence bactérienne au titane en présence de salive ont pas donné une image claire et tandis que certaines des différences observées peuvent attribuable à la salive utilisée, la variation des souches bactériennes et les types de surface de titane peuvent également contribuer à l'absence de consensus.
Bien que le développement de biofilms est important pour le développement de la maladie par voie orale, un facteur crucial est la physiologie et le niveau d'activité des bactéries adhérentes. l'adaptation des bactéries au mode de vie du biofilm est connue pour être associée à des changements majeurs dans la transcription et la synthèse des protéines [15]. Par exemple, dans Porphyromonas analyse comparative transcriptomique de gingivalis a révélé qu'un grand nombre de gènes sont exprimés de manière différentielle dans les cellules de biofilm par rapport à leurs homologues flottants [16]. Dans une étude chez Streptococcus mutans
, le taux relatif de synthèse d'au moins 25 protéines différentes a été améliorée dans les 2 heures de la fixation à une surface en verre. Ces protéines ont été principalement associées à catabolisme glucidique [17] suggérant que les changements dans l'activité métabolique peuvent se produire pendant l'adhérence aux surfaces. Peu de choses sont actuellement connues, cependant, sur l'état métabolique des cellules lors des interactions avec les protéines pelliculaires dans les premiers stades de la formation de biofilm. Le but de ce travail était d'étudier la façon dont l'adhésion aux surfaces de titane affecte l'activité métabolique du début du colonisateur S
. oralis
et de déterminer l'effet d'une pellicule salivaire sur ce processus. Pour faire la lumière sur laquelle les protéines salivaires peuvent influer sur l'adhésion et l'activité métabolique, les protéines prédominantes présentes dans une pellicule salivaire formés sur le titane ont été identifiés.
Méthodes
Les bactéries et les conditions de culture
Un isolat clinique frais de S
. oralis
(89C) a été obtenu à partir d'un patient atteint d'une infection en cours péri-implantaire après approbation éthique a été obtenue à partir de la Faculté d'Odontologie [14]. Les bactéries ont été cultivées pendant une nuit sur gélose au sang dans une atmosphère de 5% de CO 2 dans l'air à 37 ° C. Les colonies ont été mises en suspension dans 120 ml du tampon phosphate salin [0,15M NaCl, 10 mM de NaH 2PO 4, pH 7,4 (PBS)] pour donner une DO 600nm = 0,6. Pour les expériences de flux de cellules, un volume égal de PBS ont été ajoutés pour réduire de moitié la concentration des cellules, avant la formation de biofilm, alors que pour les expériences planctoniques la suspension bactérienne d'origine a été mélangée avec un volume égal de PBS, ou la totalité de 50% de la salive humaine donner une concentration finale de 25% de la salive.
Collection et préparation de Whole salive de la salive recueillie sur la glace pendant 1 heure à partir de dix personnes en bonne santé a été mis en commun et préparé comme décrit précédemment [18], après l'approbation éthique avait été obtenu à partir de la Faculté d'Odontologie. En bref, l'échantillon a été mélangé avec un volume égal de PBS, on a agité doucement pendant une nuit à 4 ° C et on centrifuge dans une centrifugeuse Beckman Coulter Avanti JE (JA Beekman 20 rotor, Beckman Coulter, Brea, CA) (20 minutes, 30 000 g
, 4 ° C). Le surnageant a été ensuite soumis à une centrifugation isopycnique en gradient de densité de CsCl /NaCl 0,1 M dans un Beckman Coulter Optima LE-80K Ultracentrifugeuse (Ti rotor Beekman 50.2, à partir de densité 1,45 g ml -1) à 36 000 tours par minute pendant 90 heures à 15 ° C. Les fractions contenant les bactéries ont été rejetées et ceux qui restent ont été réunies, dialysées contre PBS et stockées à -. 20 ° C
surfaces de titane
Les surfaces de titane utilisés dans cette étude étaient des commercialement pur titane grade IV, qui était lisse, avec une rugosité de surface moyenne (S a) de 0,1 um [14]. Les plaques (99 x 25 x 0,8 mm) ont été transformés, nettoyé avec un détergent, rincés à l'eau distillée et on stérilise par irradiation γ (DPDS Pinol A /S).
Caractérisation de deux plaques de titane de salive pellicules séparées par une entretoise en caoutchouc avec une épaisseur de 1,6 mm, ont été montés dans un flux de cellules et les surfaces revêtues avec toute 50% durant la nuit de la salive humaine. Après ce temps, les cellules d'écoulement ont été vidés et les surfaces lavées (2 x 2 minutes) avec du PBS sur un plateau à bascule. Pour éliminer les pellicules associées à la surface, un mélange de Tween 80 (0,006% v /v) et du Triton X-100 (0,012% v /v) a été introduit et l'ensemble du flux de cellules placées dans un bain à ultrasons pendant 1 heure. Le contenu est ensuite égoutté et collectés avant de répéter cette étape pour une période supplémentaire de 15 minutes. desorbates protéiques recueillies après chaque lavage ont été rassemblées et la concentration des protéines déterminées à l'aide d'un kit 2D Quantum (GE Healthcare Life Sciences). Un volume correspondant à 20 pg de protéine a été soumise à 2DE. En bref, la désorption a été dilué avec un tampon de réhydratation et placée dans une cassette de re-gonflement avec 18 cm de pH IPG 4-7 bandes linéaires (GE Healthcare Life Sciences) sur le dessus. La réhydratation a été effectuée à la température ambiante pendant 30 heures sous de l'huile silicone. La focalisation isoélectrique a été réalisée à l'aide d'un Multiphor II (GE Healthcare Life Sciences) avec de l'eau de refroidissement à 15 ° C, fourni par Pharmacia Multitemp II. La focalisation a été lancé à 150 V pendant 1 heure et a continué à 300 V pendant 3 heures, 600 V pendant 3 heures, 1200 V pendant 12 heures et enfin 3500 V pendant 20 heures. Après mise au point, les bandes IPG ont été stockés à -80 ° C. Avant d'exécuter dans la seconde dimension, les bandes IPG ont été équilibrées d'abord dans du tampon Tris 50 mM, pH 6,8 contenant 2% de SDS, 26% de glycerol et DTT 16 pendant 15 minutes, puis dans du tampon Tris 50 mM, pH 6,8 contenant 2% de SDS, 26 % de glycérol, 250 mM d'iodoacétamide et 0,005% de bleu de bromophénol pendant encore 15 minutes. Les bandes IPG ont été équilibrées noyées au-dessus de 14% de gels de polyacrylamide (20 x 20 x 0,1 cm) en utilisant 0,5% (p /v) d'agarose fondu. SDS-PAGE a été réalisée à un courant constant de 15 mA gel -1, 10 ° C, pendant une nuit dans une cellule xi PROTEAN II (Bio-Rad) avec les normes de masse moléculaire arc-en-haut de gamme (GE Healthcare Life Sciences) run sur le côté acide des bandes IPG. Les gels ont été colorés avec du bleu brillant Coomassie ou argent selon les protocoles de GE Healthcare Life Sciences.
Identification des protéines sur des gels 2D par les taches de LC-MS /MS d'intérêt ont été excisés manuellement à partir de bleu de Coomassie brillant gels 2DE tachées de la salive entière et soumis à une LC-MS /MS comme décrit précédemment [19]. En bref, les protéines ont été réduites avec du DTT (60 ° C, 20 minutes), alkylée par l'iodoacétamide (25 ° C, 10 minutes) puis digéré par la trypsine (37 ° C, 8 heures). peptides tryptiques ont été séparés et soumis à MS. pics peptidiques ont été déconvolution automatiquement et listes de masse sous la forme de fichiers Mascot générique utilisé comme entrée pour les recherches Mascot MS /MS Ions de la base de données NCBInr utilisant le serveur web Matrice Science (http:.. //www matrixscience com) .
Détermination de la couverture de surface et de la viabilité
viabilité de cellules en suspension dans du PBS ou la totalité de 25% de la salive a été évaluée par coloration d'une goutte de la suspension avec live /Dead Bac
kit de coloration Light (Life Technologies, Stockholm , Suède) au départ (temps 0), après 2 heures et 24 heures et l'affichage avec un confocal à balayage laser microscope inversé (CSLM) (Eclipse TE2000, Nikon Corp.). Le système d'écoulement de cellules en forme de plaque verticale parallèle utilisée a été décrite précédemment (14). En bref, S
. Les cellules ont été passées Oralis de plus de deux surfaces de titane (99,25 x 25,25 x 0,8 mm), séparés par une entretoise en caoutchouc de 1,6 mm, ce qui étaient soit non enrobés ou avait été revêtue avec de la salive pendant une nuit. Toutes les expériences ont été effectuées à 37 ° C et un écoulement laminaire de 42 ml h -1 a été utilisé pour modéliser le flux de salive par jour sur les surfaces buccales. ont été introduites toutes les solutions à travers l'entrée inférieure et la sortie se sont produits à travers la valve supérieure. Dans un premier temps, les surfaces sont rincées avec du PBS pendant 30 minutes. La même suspension bactérienne a été ensuite introduit dans deux cellules à écoulement; une contenant deux surfaces non revêtues et l'autre contenant deux surfaces de salive revêtues pendant 2 ou 24 heures à 37 ° C. Après ce temps, les cellules ont été lavées avec de l'écoulement du PBS (comme ci-dessus) pendant 30 minutes pour éliminer les bactéries faiblement fixées sur les surfaces. couverture de la surface et la viabilité des cellules associées à la surface ont été évaluées sur l'une des plaques de titane dans chaque cuve à flux continu en utilisant Vivant /Mort Bac
coloration à la lumière. Des expériences ont été réalisées trois fois en utilisant des cultures bactériennes indépendantes.
Détermination de l'activité métabolique
Pour étudier l'activité métabolique des cellules planctoniques, une aliquote a été retirée de la même suspension bactérienne utilisée pour les mesures de viabilité, placées dans un ibidi accréditive chambre de cellule et les cellules incubées avec le Light Kit CTC Vitalité du Bac (Life Technologies, Stockholm, Suède) dans une chambre humide à 37 ° C pendant 2 heures. Les lames ont ensuite été visualisés à l'aide d'un CSLM. Afin d'étudier l'activité métabolique des cellules adhérentes, la seconde plaque de titane dans chaque flux de cellules, a été mis en incubation avec le kit de vitalité de lumière CTC de Bac comme ci-dessus et les cellules sont ensuite contre-colorées avec 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole ( DAPI, Life Technologies, Stockholm, Suède). Les cellules colorées ont été visualisées en utilisant un CSLM.
analyse d'image et des statistiques
Pour les échantillons colorés avec Live /Dead Bac
kit de coloration légère, dix images aléatoires chacune avec une superficie de 127,3 um 2 ont été prises pour l'analyse de l'image. Les images ont été analysées en utilisant le
_L
logiciel BioImage pour quantifier la couverture de surface moyenne, ainsi que la proportion de direct (vert) et mortes (rouges), les cellules [20]. Pour les échantillons colorés avec le kit de vitalité de lumière CTC du Bac pour évaluer l'activité métabolique, l'analyse des images a été réalisée par observation d'au moins 1000 cellules et en comptant le nombre de cellules métaboliquement actives (rouge /rose) et des cellules non actives (non colorées dans la des échantillons de suspension ou bleu contre-coloration sur les surfaces de titane). Les résultats obtenus ont été évalués à l'aide de t
-test de Student pour comparer les deux groupes ou une ANOVA à une voie avec le post-test de Bonferroni pour comparer trois groupes. Résultats d'un intervalle de confiance de 95% a été choisi et p des valeurs inférieures à 0,05 ont été considérées comme significatives.
formation d'un biofilm sur le titane dans les cellules flux
La capacité de S
biofilm formation. oralis
a été étudiée dans un système d'écoulement cellule contenant deux surfaces de titane non enrobés. Des colonies bactériennes dispersées dans du PBS ont été introduits dans des cellules-débit et autorisés à adhérer pendant 2 ou 24 heures. Au bout de 24 heures, la couverture de surface moyenne a été réduite de 60% par rapport à celle au bout de 2 heures, ce qui suggère que certaines des cellules qui ont adhéré initialement détachés au cours du temps (figure 1). Dans la suspension cellulaire initiale, le niveau de viabilité a été élevé comme révélé par coloration avec le Light Live de Bac /kit mort. Au bout de 2 heures et 24 heures, la viabilité des populations adhérentes n'a pas été significativement différente de celle de la suspension d'origine, ce qui indique que la liaison au titane n'a aucun effet néfaste sur les cellules. Etant donné que les surfaces de la cavité buccale sont recouvertes d'une pellicule salivaire, nous avons étudié l'effet de la salive sur l'adhérence et la viabilité de S
. oralis
. Sur les surfaces revêtues de 25% de la salive, la couverture moyenne de surface après 2 heures (178 ± 103 pm 2) n'a pas été significativement différente de celle observée sur les surfaces non revêtues (p = 0,67) (données non présentées). En ce qui concerne les surfaces non revêtues, après 24 heures de la couverture de surface moyenne sur le manteau de la salive a diminué (24,6 ± 7,4 um 2), ce qui démontre que les cellules bactériennes également détachés de ces surfaces au fil du temps. Le niveau de la viabilité des cellules sur la surface de la salive revêtue n'a pas été significativement différente de celle sur la surface non revêtue au même point temporel. Figure 1 Images montrant la formation de biofilm par S. oralis sur des surfaces de titane non enrobés. Les bactéries en suspension dans du PBS ont été autorisés à former des biofilms sur des surfaces de titane dans un système d'écoulement de cellule à plaques parallèles pendant 2 et 24 heures. La viabilité des cellules a été évaluée par Live coloration Lumière /Dead Bac
et la visualisation avec CSLM. la couverture de surface sur les plaques de titane a été évaluée à partir de dix images aléatoires en utilisant le logiciel du BioImage
_L. Les barres d'échelle représentent 10 um et les inserts montrent des cellules en double élargissement.
L'activité métabolique par rapport au contact avec des surfaces non revêtues et de salive enduit
activité métabolique du S
. Les cellules Oralis de a été évaluée à l'aide du Kit de Vitalité Lumière CTC du Bac, où les cellules métaboliquement actives réduisent le sel de tétrazolium incolore à un produit formazan insoluble provoquant leur apparaissent en rouge (ou rose en présence du DAPI de contraste bleu). Des cellules prélevées sur une gélose au sang au temps 0 et dispersés dans du PBS ont montré un niveau d'activité métabolique endogène (6 ± 1,5%) (figure 2) faible. l'incubation continue des cellules dans du PBS n'a pas d'effet significatif sur le niveau d'activité métabolique après 2 heures (4 ± 0,5%) ou 24 heures (2 ± 0,1%). Cependant, au bout de 2 heures dans le modèle de flux de cellules, la population adhérente contient une proportion nettement plus élevée de globules rouges, indiquant que l'activité métabolique a été stimulée par le contact avec une surface. Au bout de 24 heures, le niveau d'activité métabolique au sein de la population adhérente a diminué mais reste nettement supérieure à celle de la suspension du PBS d'origine (p & lt; 0,01). Figure 2 Images montrant l'activité métabolique de S. oralis en suspension et adhéré aux surfaces de titane non enrobés. Les bactéries en suspension dans du PBS ont été autorisés à former des biofilms sur des surfaces de titane dans un système d'écoulement de cellule à plaques parallèles pendant 2 et 24 heures. L'activité métabolique des cellules a été évaluée à l'aide du kit de vitalité de lumière CTC du Bac. Pour les cellules adhérentes, DAPI a été utilisé comme contre-colorant. Les cellules ont été vus avec des cellules évaluées par comptage manuel au moins 1000 cellules CSLM et la proportion de métaboliquement active (rouge /rose). Les barres d'échelle représentent 10 um et les inserts présentent des cellules dans un double élargissement.
Les effets de la salive revêtement sur l'activité métabolique des bactéries adhérentes ont ensuite été étudiées. Ceci a révélé que les taux étaient significativement plus élevés pour les cellules associées à la surface de la salive revêtue au bout de 2 heures et 24 heures par rapport à ceux de la suspension du PBS d'origine (p & lt; 0,001) (figure 3). L'incubation des bactéries avec 25% de la salive en suspension n'a causé aucun changement significatif dans l'activité métabolique pendant 2 heures (4 ± 0,5%) ou 24 heures (3 ± 0,6%), suggérant que l'effet était spécifique aux protéines salivaires qui adhèrent à une surface. Ces données ainsi montrent que adsorbées protéines salivaires ont la capacité d'induire une réponse métabolique qui ne se voit pas lorsque les protéines sont présentes en solution. Figure 3 Images montrant l'activité métabolique de S. oralis adhéré aux surfaces de titane salive revêtu. Les bactéries en suspension dans du PBS ont été autorisés à former des biofilms sur des surfaces de titane enrobées de salive dans un système d'écoulement de cellule à plaques parallèles pendant 2 et 24 heures. L'activité métabolique des cellules a été évaluée à l'aide du kit de Vitalité Lumière CTC du Bac avec DAPI comme contre. Les cellules ont été vus avec des cellules évaluées par comptage manuel au moins 1000 cellules CSLM et la proportion de métaboliquement active (rouge /rose). Les barres d'échelle représentent 10 um et les inserts présentent des cellules dans un double élargissement. Etant donné que ce membre ne devraient pas les cellules non viables sur les surfaces présentent une activité métabolique, pour étudier le niveau d'activité métabolique en fonction du nombre de cellules viables , un rapport a été calculé pour chaque point de temps (tableau 1). Ceci a révélé que les cellules en suspension dans du PBS ou de la salive, tandis que la viabilité a été maintenue, il n'y avait aucun changement significatif dans l'activité métabolique au cours du temps. L'adhérence à une surface non revêtue a provoqué la proportion des cellules viables qui sont métaboliquement actives pour atteindre 50% au bout de 2 heures, tandis que la liaison à une pellicule de salive ont augmenté de manière significative à ce niveau de 98% des cellules viables (p & lt; 0,001). Ainsi, alors que le contact initial avec une surface provoque une augmentation de l'activité métabolique au sein de la population, il a été grandement améliorée par la présence d'une pellicule salivaire. Au bout de 24 heures, la proportion de cellules métaboliquement actives sur la surface du titane non revêtu avait diminué à 25%, alors que sur la surface de la salive revêtue niveau est maintenu à 96%. Cela suggère que, en plus d'améliorer la réponse initiale à la surface de contact, la présence de protéines salivaires soutenu l'augmentation de l'activité métabolique plus de 24 hours.Table 1 Proportion de bactéries viables dans la population présentant une activité métabolique dans l'environnement de différentes conditions
% des cellules vivantes avec une activité métabolique
0 h
2 h
24 h
Les cellules en suspension dans du PBS
6 ± 1,5
4 ± 0,5
2 ± 0,03
cellules adhérentes aux surfaces non enrobées dans du PBS
-
50 ± 4,5
25 ± 2,6
cellules en suspension dans 25% de la salive
-
4 ± 0,8
3 ± 0,6
cellules adhèrent à des surfaces recouvertes de 25% de la salive
-
98 ± 4,3
96 ± 6,3
Caractérisation de salive revêtement sur des surfaces de titane
pour identifier les principaux composants protéiques dans la préparation de salive exempt de bactéries, le matériau a été soumis à 2DE et protéines visualisées par coloration avec bleu brillant de Coomassie (figure 4a). Cela a révélé la présence de plus de 100 points, dont la majorité (70) ont été prélevées, et 68 d'entre eux ont pu être identifiés par LC-MS /MS (tableau 2). Presque toutes les protéines présentes se sont révélés être d'origine salivaire, avec IgA sécrétoires, zinc-α 2-glycoprotéine, les membres de la famille de la cystatine, α-amylase et la protéine induite par la prolactine (PIP) comme l'espèce dominante dans la préparation. En outre, la kallicréine, la protéine de liaison aux acides gras et la protéine de von Ebner ont été identifiés. Figure 4 2DE gels de salive entier et la pellicule salivaire désorbé de surfaces de titane. salive humaine entière mis en commun (A) et des pellicules salivaire désorbées surfaces en titane à l'aide de détergent (B) ont été soumis à une focalisation isoélectrique sur des bandes IPG pH 4-7 suivi par SDS-PAGE sur des gels à 14%. Les gels ont été colorés avec du bleu de Coomassie (A) ou d'argent (B). Spots d'intérêt ont été choisis à partir du gel Coomassie, identifiés par LC-MS /MS et repérer les identités transférées au gel d'argent. Une explication des étiquettes est donnée dans le tableau 2. Tableau 2
Identités de protéines de la salive tout ou pellicules salivaires désorbés à partir de surfaces de titane en utilisant un détergent obtenus en utilisant LC-MS /MS de spots de gels 2DE.
Protein identité
nom spot
couverture
% de séquence
détectée sur la surface
amylase
amy
45- 55
Oui
Calgranulin
cal
49
Non
cystatine
S
cysS
77
Yes
SA
cysSA
37–73
Yes
D
cysD
31
Yes
la protéine de liaison d'acide gras
51
Oui
Immunoglobulin A
J chaîne
fab
IgA /J
37-63
Oui
chaîne lourde
IgA /h
18- 36
Oui
chaîne lourde région C
IgA /c
21
Non
sécrétoire component
sec
32–36
Yes
Bur
Bur
11–15
No
Immunoglobulin
chaîne légère (kappa)
Ig /κ
38-59
Oui
kallicréine
kal
10
Non
protéine prolactine-inductible
pip
63-67 protéines glande
Oui
Von s 'Ebners (lipocaline)
VEB
27
No
zinc-α 2-glycoprotéine
ZnGP
23-45
No
Pour identifier les protéines présentes dans le salivaire pelliculaire formée sur le titane, les surfaces ont été incubées pendant une nuit avec de la salive et, après lavage, les protéines adhérentes ont été désorbées avec un détergent et on les soumet à 2DE (figure 4b). Coloration à l'argent des gels révélé environ 50 points de laquelle tous ont été vus dans le Coomassie gel coloré salive. IgA sécrétoires, les protéines de cystatine, α-amylase et PIP sont présentes, mais le zinc-α 2-glycoprotéine était absente, indiquant que cette protéine n'a pas adhéré à la surface du titane. L'intensité relative des taches de PIP dans la pellicule est supérieure à celle de la préparation initiale de salive ce qui suggère que cette protéine pourrait être enrichie sur la surface de titane. Early colonisateurs de la discussion comme S
. oralis
initier la formation de biofilm en interagissant directement avec la pellicule salivaire qui est présent sur les surfaces buccales. Dans cette étude, nous avons utilisé des pellicules de salive préparée par centrifugation en gradient de densité dans des conditions non dénaturantes. L'avantage de cette technique est que les bactéries salivaires qui sont culottées, peuvent être séparés de grandes macromolécules permettant la préparation de exempt de bactéries, de la salive «indigène» dans laquelle même les grandes protéines salivaires sont présents. Nous avons précédemment identifié les deux grands mucine salivaire (MUC5B et MUC7) ainsi que gp340, le lysozyme, la lactoferrine, α-amylase, IgA sécrétoires et statherin dans cette préparation en utilisant ELISA [21]. Dans cette étude, nous avons effectué 2DE en combinaison avec la LC-MS /MS pour identifier les protéines salivaires poids moléculaires inférieurs (figure 4a). IgA sécrétoire est la protéine la plus abondante révélée par la présence de plusieurs fragments (composant sécrétoire, de la chaîne lourde, κ chaîne et chaîne J). En accord avec les analyses de la salive humaine par d'autres groupes en utilisant la protéomique approches [7, 22], nous avons également été en mesure d'identifier α-amylase, protéines de la famille de la cystatine, le zinc-α 2-glycoprotéine et PIP. l'acide gras de liaison aux protéines, la kallicréine et von Ebners protéine de la glande (de lipocaline) étaient présents en quantités mineures. Dans cette étude, nous avons appliqué la méthodologie pour examiner les pellicules salivaires formés sur le titane. Ceci a montré que IgAs et α-amylase sont les protéines les plus abondantes dans la pelliculaire en plus des membres de la famille de protéines de la cystatine et les PIP (figure 4b). Des études précédentes utilisant une SDS-PAGE combinée à une analyse Western Blot avec des anticorps spécifiques dirigés contre les protéines salivaires, ont montré que l'α-amylase, et slgA Prps se lient au titane [10, 11]. Zinc-α 2-glycoprotéine était absent du désorbat pelliculaire suggérant que cette protéine ne se conforme pas au titane tandis que l'abondance relative supérieure de PIP dans la désorption que dans la préparation de salive initiale indique que la protéine est enrichie sur la surface. bactéries orales telles que S
. salivarius
, S
. parasanguinis
et S
. oralis
peut interagir avec PIP [23, 24], ce qui suggère que cette protéine pourrait jouer un rôle important dans la modulation de la colonisation bactérienne des surfaces par voie orale. À notre connaissance, ceci est la première fois que le PIP a été identifiée comme une protéine abondante dans les pellicules sur le titane. Une protéine de 20 kDa correspondant à la PIP [25] a déjà été mis en évidence pour se lier à l'hydroxyapatite mais n'a pas été enrichi de la même manière trouvée ici [26]. Une limitation de cette étude est cependant qu'il est actuellement inconnu si les résultats sont applicables à d'autres surfaces de titane avec différentes topographies de surface ou des modifications de surface.
Dans le modèle de débit cellulaire, S
. oralis
adhère bien aux surfaces de salive revêtu après 2 heures - en accord avec d'autres études sur les colonisateurs primaires tels que Streptococcus anginosus
, Streptococcus gordonii
et Streptococcus sanguinis
[10] et Actinomyces naeslundii
[11]. En tant que groupe, les streptocoques oraux sont connus pour exprimer adhésines qui ont une affinité pour une gamme de protéines présentes dans la salive [27]. Dans une étude précédente, nous avons identifié un amino-acide contenant, protéine LPXTG liée 1060 exprimée dans des souches de S
. oralis
qui liait bien pellicules salivaires et in silico
analyse du S
. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.
