Résumé de l'arrière-plan
Cette étude a examiné la prévalence de Enterococcus faecalis
, ses facteurs de virulence putatifs et la sensibilité aux antimicrobiens chez les individus avec et sans maladies dentaires. Un total de 159 échantillons de rinçage oral ont été recueillies chez des patients (n = 109) souffrant de maladies dentaires et des contrôles sains (n = 50).: Résultats
E. faecalis
a été détectée en utilisant uniquement la culture dans 8 /109 (7,3%) des patients atteints de divers types de maladies dentaires, alors qu'aucun E. faecalis
a été trouvé dans les contrôles sains Météo utilisant à la fois la culture et la PCR. caractérisations phénotypiques du 8 E. faecalis
isolats ont indiqué que 25% des isolats produits hémolysine et 37,5% gélatinase produit. La plupart des gènes de virulence importants; obligatoire collagène protéine (ace
) et l'endocardite antigène (EFAA
) étaient présents dans tous les 8 E. faecalis
isolats, tandis que gène activateur hémolysine (CYLA
) n'a été détectée que dans 25% des isolats, et tous les isolats étaient négatifs pour esp
gène. Tous E. faecalis
isolats étaient 100% sensibles à l'ampicilline, le chloramphénicol, la ciprofloxacine, la vancomycine et la teicoplanine, et dans une moindre mesure à l'érythromycine (62,5%).
Conclusion
Cette étude montre que tous les E. faecalis
isolats ont été récupérés seulement à des patients souffrant de maladies dentaires pulpes en particulier nécrotiques, et tous les isolats réalisés à la fois des gènes de protéines et d'antigènes endocardite contraignant et très sensibles collagène fréquemment utilisées médicaments antimicrobiens en Jordanie.
matériel supplémentaire électronique
en ligne version de cet article (doi:. 10 1186 /1472-6831-8-17) contient du matériel supplémentaire, qui est disponible pour les utilisateurs autorisés
Contexte de nombreuses études
démontré que E. faecalis
est. fréquemment observée chez les patients souffrant d'infections buccales comme la gingivite, la parodontite, les dents avec endodontique échoué, ainsi que des lésions carieuses acides associés aux canaux radiculaires infectés de manière persistante. [1-4] D'autres études ont démontré la présence fréquente de E. faecalis
en association avec une grande variété d'espèces bactériennes aérobies et anaérobies impliqués dans diverses maladies endodontiques et parodontite apicale chronique [4-7].
Facteurs Virulent de E. faecalis
comprennent l'adhésion à accueillir les tissus, l'invasion et la formation d'abcès, la modulation des réponses inflammatoires de l'hôte, la sécrétion de divers produits qui améliore la formation de biofilm [8-10]. Les données sur la prévalence orale de E. faecalis
et ses facteurs de virulence varient d'une étude à l'autre [1, 6, 7]. Par conséquent, une enquête plus approfondie sur les facteurs potentiels de virulence de E. faecalis
serait utile dans la compréhension de leur rôle dans les infections dentaires. De plus, les isolats cliniques de E. faecalis
récupérés des infections du canal radiculaire peuvent exprimer la résistance aux antimicrobiens des schémas thérapeutiques classiques recommandées pour les procédures dentaires [11-13].
Cette étude visait à examiner la présence de E. faecalis
, ses facteurs de virulence et la sensibilité aux antimicrobiens en association avec et sans certaines maladies dentaires dans une population jordanienne
âge des patients variait de 14 à 75 ans (moyenne; 36,4 années), et les personnes de contrôle étaient entre 20 et 69 ans (moyenne; 28,3 ans). La prévalence de E. faecalis
isole dans des échantillons de rinçage oral des patients atteints de maladies dentaires a été 8/109 (7,3%) en utilisant à la fois la culture et les tests PCR, alors que tous les échantillons de rinçage oral obtenus à partir des 50 personnes témoins en bonne santé ont été négatifs pour E . faecalis
utilisant les deux méthodes. Tout l'ADN extrait de 8 E. faecalis
isolats ont été révélés être positifs pour E. faecalis
16s gène ARNr spécifique. La différence entre les résultats des deux groupes est statistiquement significative (valeur p = 0,031). En outre, il y avait 2 E. avium
isolats (Tableau 1). Le modèle de croissance de E. faecalis
isolé de cas positifs variait de quelques-uns à de nombreuses colonies (2-50 x 10
3 colonies /ml). La distribution de 8 E. faecalis
isole chez les patients en association de sexe, le tabagisme, l'hygiène buccale et les maladies dentaires est représenté sur (tableau 2). Détection des gènes de facteurs de virulence putatifs parmi les huit isolats de E. faecalis
utilisant la PCR étaient les suivantes; deux as
et les gènes EFAA de étaient présents dans tous les isolats (100%), tandis que le gène CYLA de a été détectée seulement dans 2 isolats, et tous les isolats étaient négatifs pour esp
gène (tableau 3, figure 1). Tous les 8 E. faecalis
isolats étaient 100% sensibles à l'ampicilline, le chloramphénicol, la ciprofloxacine, la teicoplanine et la vancomycine, tandis que 62,5% et 12,5% des isolats étaient sensibles à l'érythromycine, l'imipénème, respectivement, et tous étaient résistants à la gentamicine, clindamycine et OxacillinTable 1 Détection de Enterococcus espèces
chez les patients et les contrôles
Caractéristiques
109 patients atteints de maladies dentaires No. (%)
50 personnes Controls No. (%)
Age moyen (années)
36,4 ± 13,98
28,3 ± 12,59
Sex
|
Homme
39 (36)
24 (48)
Femme
70 (64)
26 (52)
E. faecalis
8 (7.3)
0
E. avium
2 (1.8)
0
Tableau 2 Répartition des 8 E. faecalis
isole en association de sexe, le tabagisme, l'hygiène buccale et les maladies dentaires chez les 109 patients
Caractéristiques
positif E. faecalis
*
négatif E. faecalis
*
total No.
P-value***
Female
7
63
70
0.134
Male
1
38
39
|
Nonsmoker
7
83
90
0.228
Smoker
1
18
19
|
Une mauvaise hygiène bucco-dentaire
7
68
75
0,222
Une bonne hygiène bucco-dentaire
1
33
34
|
gingivite + ve
7
64
71
0,161
gingivite -ve
1
37
38
|
pulpes nécrotiques
8 **
101
109
0
caries + ve
4 **
77
81
0.115
caries -ve
4
24
28
|
* nombre de colonies:. 2 - 50 × 103colonies /ml
** chacun patient a été traité avec des antibiotiques au cours du dernier mois.
*** Non significatif entre E. faecalis positif
et chaque sexe, le tabagisme, l'hygiène bucco-dentaire, la gingivite, caries mais significative avec puples nécrotiques.
Tableau 3 Présence de gène ARNr 16S et la prévalence des esp, CYLA, as, les gènes EFAA de parmi les 8 E. faecalis orale
isolats détecté par PCR.
Isoler No.
ARNr 16S
esp
CYLA
*
ace
EFAA
3
+
-
-
+
+
44
+
-
-
+
+
1
+
-
-
+
+
2
+
-
+
+
+
6
+
-
-
+
+
12
+
-
-
+
+
18
+
-
-
+
+
59
+
-
+
+
+
Total souches No. (%)
8 (100%)
0 (0.0%)
2 (25%)
8 (100%)
8 (100%)
* Deux isolats ont exprimé une activité hémolytique in vitro
Figure 1 Répartition du gène EFAA parmi les 8 E. faecalis orale isolats. M, marqueur d'ADN de 100 pb; Lane 1, EFAA
(688 pb); contrôle positif (E. faecalis
ATCC 29212); Lane 2, EFAA
contrôle négatif; Lanes 3 à 10, positive à EFAA
chez E. faecalis orale
Méthodes d'isolats.
Un total de 159 sujets qui assistaient à la clinique dentaire /Jordan University Hospital (JUH), Amman, Jordanie ont été examinés pour la présence de maladies dentaires par deux dentistes (N. Dar-Odeh & amp; O. Abu Hammad) pendant la période de 2005. les sujets de l'étude ont été divisés en deux groupes en fonction de la présence ou l'absence de maladies dentaires. Le groupe témoin était composé de 50 personnes en bonne santé qui n'ont pas de maladie dentaire évidente. Les maladies dentaires étudiés incluent: la carie dentaire, la gingivite induite par la plaque, et les maladies du canal radiculaire. Les données personnelles, les antécédents de tabagisme, la présence ou l'absence de maladie dentaire clinique, hygiène bucco-dentaire et un traitement antibiotique au cours du dernier mois ont été enregistrées pour chaque personne interrogée. La carie dentaire et la gingivite ont été enregistrées comme présent /absent. Racine maladie canal inclus: pulpite irréversible, pulpe nécrosée seulement, et la parodontite périapicale. L'hygiène buccale a été considérée comme pauvres ou bien selon l'indice de plaque. Tous les patients et les personnes de contrôle avaient donné leur consentement écrit pour être inclus dans l'étude. On a demandé à tous les patients et les contrôles pour se rincer la bouche pendant 60 secondes avec 10 ml d'eau distillée stérile et retourné le rinçage oral à un récipient stérile traitement des échantillons de.
Tous les échantillons ont été transférés immédiatement au laboratoire de recherche Microbiologie /Faculté de Médecine /Université de Jordanie. échantillons de rinçage oraux ont été versés dans le tube stérile et centrifugé pendant 10 min à 10000 g. Le surnageant a été rejeté et les pastilles restantes ont été remises en suspension par vortex dans un ml de solution saline normale stérile à 0,9% [14].
Isolement d'Enterococcus
Une boucle complète des granules en suspension (0,01 ml) a été cultivée sur bile-esculine plaques de gélose pour détecter et compter la présence de gris pour des colonies noires d'espèces Enterococcus
. Le reste des échantillons en suspension ont été conservés à -70 ° C pour de plus amples investigations. Au moins trois colonies cultivées sur des plaques de bile-esculine ont été repiquées dans des plaques de gélose au sang pour isoler les espèces d'Enterococcus
(Oxoid, Angleterre). Toutes les cultures réalisées à travers l'étude ont été incubés dans un pot de bougie (5% de CO 2) pendant 24-48 heures à 37 ° C. croissance pure obtenue à partir de plaques de gélose au sang a de nouveau été inoculé sur Lactose Cystéine Electrolyte Déficient (CLED) des plaques d'agar (Oxoid, Angleterre), une solution 6,5% de NaCl et un tube d'agar de bile-esculine. Chaque montrant la croissance des cocci à Gram positif, la bile-esculine positif, des tests positifs 6,5% de NaCl, catalase négatif et apparaissant comme jaune, petite /moyenne taille sur gélose CLED (Oxoid, Angleterre) ont été enregistrés provisoirement comme Enterococcus
isolats. E. faecalis
ATCC 29212 a été incluse comme un contrôle positif à travers l'étude.
Détection biochimique de E. faecalis isole
les isolats de All provisoire Enterococcus ont été repiqués sur le cœur du cerveau des plaques de gélose de perfusion (Oxoid, Angleterre) et testé à l'aide biochimique système Remel (système RapID ™ STR, USA) pour confirmer leur identité en tant que E. faecalis
. hémolysine et activités de gélatinase
E. faecalis
isolats ont été évalués pour l'activité hémolytique sur gélose à base de sang (Oxoid, Angleterre) supplémenté avec 5% (v /v) de sang humain. Une seule colonie a été cultivée sur des plaques de gélose au sang et son activité hémolytique a été déterminée par la présence de la zone libre autour des colonies (ß hémolyse) tel que rapporté par Creti et al
. [15]. L'activité gélatinase a été évaluée par inoculation de colonies isolées de chaque isolat en tant que forme de tache sur 12% de gélatine plaques (DEFICO, États-Unis). Les plaques ont été incubées à température ambiante pendant 48 heures. L'activité gélatinase était manifeste par la présence de la zone liquéfiée autour des colonies. mercenses Serratia
ATCC 13880 a été utilisé comme témoin positif pour le test de production de gélatinase.
test de sensibilité aux antimicrobiens
Susceptibilité de E. faecalis
isolats 9 agents antimicrobiens a été déterminée en utilisant la méthode de diffusion de disque selon NCCLS ( maintenant CLSI) des lignes directrices [16] de. la détection de E. faecalis dans l'échantillon de rinçage oral par l'extraction de l'ADN de PCR a été réalisée en utilisant l'Assistant Genomic Purification Kit ADN (Promega, USA), selon les instructions du fabricant. Les extractions d'ADN ont été utilisés pour la détection 16S spécifiques de gènes ARNr de E. faecalis
dans des échantillons de rinçage oral [17]. Les conditions de PCR ont été réalisées par un thermocycleur (MJ cheurs Inc, USA) et ont été les suivantes: 15 min étape d'activation d'enzyme initiale /dénaturation d'ADN à 95 ° C, suivie de 35 cycles successifs à 94 ° C pendant 20 s; 68 ° C pendant 45 s; 72 ° C pendant 15 secondes. Les produits de PCR ont été analysés par électrophorèse en utilisant 2% de gel d'agarose (Promega, USA) contenant du bromure d'éthidium dans 1 tampon × TBE, et courir pendant 1 heure avec 70V, et visualisés par UV Trans-illuminateur (UVP) Système de documentation et Gel (UVP) . La réaction même PCR a été testé avec chaque souche de contrôle unique de E. faecium
et S. mutans
qui ont été isolées à partir d'autres échantillons cliniques à JUH, et en utilisant E. faecalis
ATCC 29212.
Le test PCR utilisé, a donné un résultat négatif avec de l'ADN extrait de E. faecium
et S. mutans
. En outre, l'extraction d'ADN récupéré et identifié E. faecalis
isolats ont été confirmés en utilisant la même extraction de l'ADN et de la procédure PCR dans les mêmes conditions que celles utilisées pour les échantillons oraux de rinçage (tableau 4) .Table 4 sensibilité aux antimicrobiens de 8 E. faecalis
par la méthode de diffusion sur disque
Les agents antimicrobiens
No. (%) Des isolats sensibles
ampicilline
8 (100)
chloramphénicol
8 (100)
8 (100)
téicoplanine de ciprofloxacine
8 (100)
vancomycine
8 (100)
érythromycine
5 (62.5)*
Gentamycin
Null
Clindamycin
Null
Oxacillin
Null
Nourrissais seulement ace
, les gènes EFAA de de. La détection de E. faecalis gènes de virulence putatifs
ADN de E. faecalis
a été préparé en mettant en suspension une boucle complète de colonies de croissance durant la nuit cultivé sur le sang des isolats agar-agar dans un tube contenant 500 ul d'eau distillée stérile, puis en faisant bouillir pendant 10 min, puis on centrifuge à 12 000 g pendant 6 min. Une partie aliquote du surnageant (5 pi) a été utilisé comme matrice dans un volume final de 25 ul de mélange de PCR [15]. L'amplification par PCR pour les gènes suivants: protéine de liaison de collagène (ace
), endocardite antigène (EFAA
), activateur de hémolysine (CYLA
), et une protéine de surface (en particulier
) ont été préparés comme dans uniplex un volume réactionnel final de 25 ul. Le tableau 5 montre les amorces utilisées dans l'étude [15, 17, 18] .table 5 E. faecalis
amorces utilisées dans l'étude
Gene
séquence
taille du produit (pb)
référence
E. faecalis
ARNr 16S
Ef16SF 5 '- CCGAGTGCTTGCACTCAATTGG - 3'
138
17
Ef16SR 5 '- CTCTTATGCCATGCGGCATAAAC - 3'
|
|
Esp
5'-TTGCTAATGCTAGTCCACGACC-3 '
932
18
|
5'-GCGTCAACACTTGCATTGCCGA-3 '
|
|
CYLA
5'-GACTCGGGGATTGATAGGC-3 '
688
15
|
5'-GCTGCTAAAGCTGCGCTTAC-3'
|
|
ace
5'-GGAATGACCGAGAACGATGGC-3 '
616
15
|
5'-GCTTGATGTTGGCCTGCTTCCG-3 '
|
|
EFAA
5' -GCCAATTGGGACAGACCCTC-3 '
688
15
|
5'-CGCCTTCTGTTCCTTCTTTGGC-3'
|
|
échantillons ont été amplifiés dans un cycleur thermique PCR (MJ cheurs INC, États-Unis), par chauffage pendant 5 min à 95 ° C, suivi de 30 cycles de 95 ° C pendant 60 s , 58 ° C pendant 60 s (63 ° C esp
) et 72 ° C pendant 60 s, et une étape finale de 72 ° C pendant 10 min. Les produits de PCR ont été analysés dans 0,8% électrophorèse sur gel d'agarose (contenant 0,5% de bromure d'éthidium dans 1 x tampon TBE) qui fonctionnent pendant 50 minutes par 80 des tensions en utilisant un appareil d'électrophorèse horizontale et visualisés par un système de gel de documentation (UVP, USA). E. faecalis
ATCC 29212 a été utilisé comme témoin positif dans chaque série PCR pour détecter CYLA
, as
, les gènes EFAA de, et de tester l'ADN préparé à partir de certains E. faecalis
souches (EFS121, EFS87, EFS16, EFS27B, EFSU85 et EFS118) qui ont été obtenus par le Dr Roberta Creti (Dipartimeno di Malattie Infecttive, Parassitarie ED Immunomediate, Istituto Superiore di Sanità, Viale Regina Elena, 299-00161 Rome, Italie). Ces préparations d'ADN ont été utilisés comme un contrôle positif pour esp
gène avec 1 Kb /100 marqueur pb de contacts (Promega, USA).
Analyse statistique
test Z a été utilisé pour comparer la prévalence de E. faecalis
chez les patients et un groupe de contrôle, selon l'équation suivante:
Z = P 1 - P 2 /√P (1-P) (1 /n 1 + 1 /n 2). P & lt; . Rapport de 0,05
a été considérée comme statistiquement significative
La présente étude montre que E. faecalis
isolats ont été récupérés chez des patients jordaniens en association avec un ou plusieurs des maladies dentaires suivants; les caries, la gingivite, la plaque, la gingivite induite et l'infection endodontique, et un taux significatif (7,3%, p = 0,031) par rapport aux personnes témoins en bonne santé (zéro). Malgré le fait que, généralement, la PCR est plus sensible que la méthode de la culture dans la détection de bactéries dans des échantillons cliniques, cette étude n'a détecté aucun E. faecalis positif
en utilisant des échantillons directs de rinçage oral. Sedgley CM et al., 2005 (19) a constaté que la PCR a-de quantitative en temps réel a rapporté une incidence plus élevée de E. faecalis
dans des échantillons de rinçage oral que les techniques de culture et a donné une plus grande sensibilité. L'étude a révélé que mauvaise hygiène buccale, la gingivite et pulpes nécrotiques semblent être des facteurs prédisposants importants pour l'infection avec E. faecalis
(tableau 2). Une étude similaire récente des Etats-Unis a isolé E. faecalis
de 11% des échantillons de rinçage oral de patients recevant un traitement endodontique, mais seulement 1% de E. faecalis
a été récupéré par les étudiants dentaires sans antécédents de traitement endodontique [ ,,,0],14]. Les entérocoques sont capables de coloniser la cavité buccale, en particulier chez les patients atteints de parodontite ou des infections du canal radiculaire associés à des lésions de la muqueuse buccale et chez les patients immunodéprimés [20, 21]. En outre, E. faecalis
est l'espèce la plus couramment isolées de canaux radiculaires échantillons avec l'échec endodontique [2, 21, 22]. E. faecalis
a souvent été isolés en culture pure ou comme organisme prédominant dans les dents préalablement remplies avec des porte-greffes ou des lésions périapicales parodontite apicale chroniques [3, 19, 23, 24]. En outre, il a été constaté que cet organisme continuellement infecté canal où les médicaments de l'hydroxyde de calcium est inefficace [25].
Cette étude montre que la production d'hémolysine et gélatinase en tant que déterminants de virulence putatifs ne sont pas toujours exprimée par E. faecalis
isolats en association avec les maladies dentaires, puisque seulement 25% des E. faecalis
isolats activité gélatinase hémolysine et 37,5% exprimé in vitro, respectivement. Deux études réalisées par Sedgley et al
. [14, 23] ont rapporté des résultats différents avec la production d'hémolysine, première étude a démontré que 36% des E. faecalis
souches récupéré des patients endodontie produit hémolysine, tandis que le second n'a pas détecté la production d'hémolysine dans tous les entérocoques isole de endodontique les cas. Aussi, Sedgley et al
. [22] a révélé que le gène de la gélatinase (gelE) a été détectée dans tous les isolats radiculaires de E. faecalis
alors exprimé l'activité de gélatinase a été observée chez les deux tiers des isolats. Ces études ont conclu que la preuve des facteurs de virulence potentiels ont été identifiés dans endodontique Enterococcus.
, En particulier la production de la gélatinase et la réponse aux phéromones. D'autres études ont montré que l'expression du gène de la gélatinase a contribué à la diffusion accrue de E. faecalis
dans des environnements à haute densité et a été associée à une augmentation de l'adhérence de E. faecalis
à la dentine in vitro
[26, 27] .
La présente étude a montré que les deux as
et les gènes EFAA de étaient présents dans tous les E. faecalis
isolats, tandis que le gène CYLA de n'a été détectée que dans deux isolats, et tous les isolats étaient négatif pour esp
gène qui se trouve principalement dans E. faecalis
souches isolées d'infections des voies urinaires [18].
Une étude moléculaire basée récente a montré que la virulence déterminants EFAA
et as
gènes ont été trouvés dans tous les E. faecalis
isolats de canal radiculaire des patients endodontie, alors esp
gène était présent dans (58%) et CYLA de gène dans (19,4%) des isolats [11] . Ces résultats sont en accord avec nos résultats, sauf esp
gène. En général, l'expression de l'hémolysine et la gélatinase activité ou leurs gènes ainsi que l'apparition d'autres gènes de virulence (esp
, CYLA
, as
, efa A
) dans E. faecalis
souches variaient considérablement d'une étude à l'autre et probablement en raison de la différence de leurs origines cliniques et géographiques [5, 9, 11, 26-29]. En outre, ni esp ni gélatinase semblait être nécessaire pour la formation du biofilm; à la fois de E. faecalis et E. faecium
n'a pas montré une corrélation entre la présence de l'une ou l'autre électrofiltre ou la production de la gélatinase et la formation de biofilm [30]. Il apparaît que de nombreux facteurs environnementaux et génétiques peuvent être associés à la production de biofilm de E. faecalis
[31].
Ces dernières années, les entérocoques ont reçu une attention croissante en raison de l'apparition d'une résistance à plusieurs médicaments antimicrobiens et sa prévalence courante dans les infections nosocomiales. entérocoques résistant à la vancomycine (ERV) représentent probablement actuellement le défi le plus grave parmi les nombreux microbes avec des infections humaines causant la résistance aux antibiotiques [32]. Nos résultats ont montré que tous les E. faecalis
isolats étaient sensibles au chloramphénicol, ampicilline, vancomycine, ciprofloxacine et teicoplanine, mais les isolats étaient beaucoup moins sensibles à l'érythromycine. Une étude réalisée par Pinheiro et. al
. [12] ont montré que E. faecalis
isole des échantillons oraux étaient complètement sensibles in vitro
à l'amoxicilline, amoxicilline-acide clavulanique, la vancomycine et dans une moindre mesure sensibles à l'érythromycine, la moxifloxacine, le chloramphénicol, la tétracycline, la doxycycline et la ciprofloxacine . Le résultat de la sensibilité de notre nombre limité de E. faecalis
isolats a indiqué une fréquence plus élevée des taux de résistance que ceux rapportés dans les études récentes en provenance des pays occidentaux [11-13]. De plus, notre résultat de sensibilité corrélation avec la prévalence élevée de la résistance chez clinique et communautaire Staphylococcus aureus
isole en Jordanie [33].
En conclusion, cette étude montre que tous les E. faecalis
isolats sont associés à pulpes diverses maladies dentaires en particulier chez les patients nécrotiques et ils portaient tous deux gènes d'antigènes protéiques et endocardite liaison collagène
. Déclarations de Remerciements
Cette étude a été partiellement financée par la subvention de la Faculté des études supérieures, Université de Jordanie, Amman , en Jordanie. Les auteurs remercient le Dr Roberta Creti (Laboratoire de Bactériologie, Institut d'hygiène spécial, Université de La Sapienza, Rome, Italie) pour l'envoi de l'ADN préparé à partir de certains E. faecalis
souches qui a été utilisé comme témoin positif pour esp
gène.
auteurs fichiers originaux soumis pour les images
Voici les liens vers les auteurs originaux soumis fichiers pour les images. 12903_2007_92_MOESM1_ESM.pdf Auteurs fichier d'origine pour la figure 1 Intérêts concurrents
Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun conflit d'intérêts.
Auteurs contributions
AAS et ND-O ont contribué à la conception de toutes les expériences et l'écriture du manuscrit . ND-O et OAH examiné tous les patients et les personnes de contrôle et ont recueilli les échantillons oraux. RS effectué tous les tests de laboratoire et co-écrit le manuscrit.
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