Résumé de l'arrière-plan
Krüppel-like factor 4 (KLF4) est un facteur de transcription régulant la prolifération différenciation équilibre de l'épithélium, et vers le bas régulés dans les carcinomes oraux moins différenciés et avancés. Bien que l'expression est inactivée par l'hyperméthylation de promoteur dans des cellules tumorales malignes, on ne sait pas dans les cellules de carcinome par voie orale.
Méthodes
L'ADN génomique isolé à partir de neuf lignées cellulaires de carcinome oral différentes et une ligne de kératinocyte normale a été traitée avec du bisulfite de sodium, et la méthylation au promoteur du gène de KLF4 a été déterminée par PCR analyse-séquence directe. . Les résultats de l'expression KLF4 dans des cellules cultivées avec ou sans réactif de déméthylation a été surveillée par quantitative PCR en temps réel et immunoblot
Une région 237 pb promoteur spanning - 718 et - 482 du gène KLF4 de hyperméthylés a été à l'oral des cellules de carcinome qui expriment KLF4
à un niveau bas, mais la méthylation était rare dans les cellules exprimant grande quantité de KLF4. La région en aval - 481-192 n'a pas été méthylé dans toutes les lignées cellulaires. le traitement de déméthylation des cellules régulée à la hausse l'expression à des niveaux d'ARNm et de protéines.
Conclusion
Cette étude a démontré que hypermethylation à une gamme étroite de la région du promoteur down-régule l'expression de KLF4, et suggère que la perte d'expression par le hypermethylation contribue à la progression du cancer par voie orale
Mots-clés
Gene promoteur hyperméthylation facteur oral cancer électronique matériel supplémentaire Krüppel-like
La version en ligne de cet article (doi:.. 10 1186 /s12903-016-0172- 5) contient du matériel supplémentaire, qui est disponible pour les utilisateurs autorisés.
Contexte
carcinomes oraux sont une tumeur maligne la plus fréquente de la tête et du cou, mais le pronostic des patients n'a pas été suffisamment améliorée. cellules Carcinome à l'avant invasive montrent fréquemment l'expression génique aberrante et dédifférencient dans des états analogues à des cellules mésenchymateuses dans un processus de progression de la maladie [1-3]. En outre, la prolifération soutenue est une autre caractéristique importante dans un sous-ensemble agressif de carcinomes. Prolifération et de l'équilibre de la différenciation des cellules contrôlent le développement et l'homéostasie de l'épithélium et jouent un rôle définitif dans l'état pathologique des cancers [4]. Ils sont essentiellement régies par le gène suppresseur de tumeur, et l'expression des gènes est souvent inactivés par des mécanismes épigénétiques [5]. Il est important de dévoiler une cause inactiver l'expression du gène suppresseur de tumeur de comprendre les mécanismes de la progression du cancer par voie orale.
Dans l'épithélium malpighien, y compris l'épithélium buccal, Krüppel-like factor (KLF) 4 et 5 sont exprimés dans les cellules kératinisant suprabasales post-mitotiques et proliférante cellules basales moins différenciées, respectivement. Ils contrôlent de manière critique l'équilibre prolifération différenciation de l'épithélium [6, 7]. KLFs réguler l'expression transcriptionnelle d'un gène cible par la liaison au promoteur, et des études antérieures documenté que la perte d'expression klf4 associés à dédifférenciation des cellules de carcinome oral et est fréquemment observée dans un sous-ensemble des cancers agressifs [7, 8]. Il suggère une implication de la perte d'expression dans la progression du cancer.
Depuis délétion chromosomique du locus du gène de KLF4 à 9q31.2 est un événement rare dans les carcinomes [9, 10], l'inactivation épigénétique du gène est un premier candidat responsable de la perte d'expression. Parmi les aberrations épigénétiques trouvés dans les cellules de carcinome, promoteur hyperméthylation est un agent causal le plus commun pour inactiver l'expression des gènes [11, 12]. En fait, l'hyperméthylation au promoteur du gène de l'activateur et KLF4 est documenté dans les cancers du côlon, de l'estomac, du col et du rein [13-16]. Cependant, les régions hyperméthylés sont localisées de façon variable dans les cancers de différentes origines et inconnus dans les cancers oraux. Dans cette étude, nous avons analysé l'hyperméthylation et la corrélation avec l'expression KLF4 dans les cellules de carcinome orale.
Méthodes
lignées cellulaires
lignées cellulaires de carcinome Oral (Ca9.22, Ho-1-u-1, HOC313, HCS2 , HSC3, KOSC3, OSC19, SCCKN, TSU) et une lignée de kératinocyte normale immortalisée mais pas transformées HaCaT [17], ont une analyse de séquence bisulfite modifiée de culture dans 10% de fœtus bovin sérum contenant du milieu. de KLF4
méthylation du promoteur états du promoteur région au gène KLF4 de ont été analysées selon une étude précédente [18]. L'ADN génomique isolé à partir des cellules ont été traitées avec du bisulfite de sodium et appliquée pour l'amplification par PCR de la région promotrice enjambant - 718 et 192 (le site de début de transcription a été définie comme 1) pour l'analyse de séquence directe. Les séquences d'amorces utilisées pour l'analyse sont les suivants: 5 '-
-736GTATGTTAGTAGGGGTG-3' (avant), 5 '- -442GAGTTTGTTGATTTAGTTGT-3' (avant), 5 '- -331AAGGAAGTTATAAGTAAGGAA- 3 '(avant), 5' - -72AATAAAACTAACTACC-3 '(inverse), et 5' - + 213AAACCCAAAACCCCAAATTAA-3 '(inverse). Nous avons parlé des données de séquences d'ADN de KLF4 de gène déposée à GenBank (DQ658241.1).
Quantitative PCR en temps réel de l'ARN total des cellules de forme isolée avec ou sans 5 uM 5-aza-2-deoxycitidine ( 5-aza) le traitement a été transcrit de manière inverse en ADNc par la transcriptase inverse MultiScribe (Applied Biosystems) et soumis à quantitative PCR en temps réel en utilisant le système PCR en temps réel StepOne (Applied Biosystems). Les conditions de PCR étaient 95 ° C pendant 20 s, suivie par 40 cycles de 95 ° C pendant 1 s et 60 ° C pendant 20 s. Les sondes TaqMan spécifiques à KLF4
(Hs00358836_m1, Applied Biosystems) a été utilisé. Les niveaux d'expression normalisée par rapport à ACTB
(TaqMan Endogène contrôle ACTB humain, Applied Biosystems) ont été calculées par la méthode de la courbe standard (2 -ΔΔCt). À analyser par rapport fois des changements de l'expression, l'expression après le traitement à la 5-aza a été divisé par l'absence de traitement.
Immunotransfert
Total des lysats cellulaires dans un tampon d'échantillon SDS contenant 1 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle et cocktail inhibiteur de protease ( Roche diagnostic GmbH) a été appliqué sur des gels de polyacrylamide-SDS dans les conditions de réduction et électrotransféré sur des membranes PVDF. Les membranes ont été sondées avec des anticorps dirigés contre KLF4 (Santa Cruz Biotechnology) ou de β-actine (Sigma-Aldrich), suivie par des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort. Expression des résultats de Les signaux ont été détectés en utilisant Chemi-Lumi Un super (Nakarai Tesque) et capturés sur Ez-Capture MG (de ATTO). de KLF4 dans les cellules de carcinome orale Expression de l'ARNm de KLF4 d'été quantifiés par la PCR en temps réel (Fig. 1). Parmi les lignées cellulaires de carcinome, il a été fortement exprimé dans les kératinocytes normaux HaCaT. Il a été détecté à un niveau relativement élevé dans KOSC2 cellules et HOC313 cellules, faible dans les cellules HCS2, Ho-1-u-1 et des cellules Ca9.22, et indétectable dans OSC19 cellules. Figue. 1 L'expression de l'ARNm de KLF4 dans des lignées cellulaires de carcinome oral et des kératinocytes normaux (HaCaT). KLF4 de l'expression a été quantitativement examiné par la PCR en temps réel. Expression relative a été normalisé par l'expression d'ACTB
dans chaque échantillon (n = 4
) et comparée à l'expression dans des cellules HaCaT promoteur de l'hyperméthylation dans Méthylation de carcinome des cellules au promoteur du gène de KLF4 de - 718-192 a été examiné par le PCR analyse-séquence directe de bisulfite modifié. Le promoteur inclus 109 méthylation sensible cytosines (fichier additionnel 1: Figure S1), et nous avons décrit l'état de méthylation de chaque cytosine comme U (méthylé), M (méthylé) ou U /M (mélange de méthylation et de la méthylation) dans cette étude. Contrairement à l'absence de méthylation dans les cellules HaCaT, toutes les lignées cellulaires de carcinome contenaient des cytosines M et /ou U /M et la fréquence de M cytosine était largement différente (Fig 2 et complémentaires fichier 1:. Tableau S1). La méthylation a été confiné dans une région enjambant 237 pb - 718 et - 482 qui contient 39 cytosine méthylation sensibles désignés # 1 à # 39, et les cytosines dans la région de 673 pb en aval du n ° 39 cytosine (# 40- # 109 ) n'a pas été méthylé. analyse computationnelle a indiqué que la région 237 pb contient cytosines de méthylation sensibles sur quatre sites Sp1 contraignant (n ° 5, 6, 23, 34 et 38 cytosines) et le site d'un PU.1 liaison (# 19 cytosine). Les N ° 5, 6, 19 et 23 cytosines étaient fréquemment méthylés dans les cellules qui expriment KLF4
à bas niveau (Fig 3 et complémentaires fichier 1:. Tableau S1). Figue. 2 méthylation du promoteur du gène de KLF4. une position de cytosines de méthylation sensible dans le promoteur est indiquée en bleu (ligne
supérieure) et les cytosines sont numériquement numérotés de # 1 à # 109. lignes inférieures montrent cytosines qui ont été entièrement méthylés (de
noir) ou non méthylé (
blanc) et mélange de méthylation et méthylation (gris
). M% et U /M% indiquent le pourcentage de cytosines méthylées et le mélange dans 39 cytosines, respectivement. b données de séquence sur # 10 et # 11 cytosines. Quatre lignées cellulaires de carcinome contenant méthylé (M) et non méthylés (U) et le mélange cytosines (U /M), ont été présentés à titre d'exemple
Fig. les sites de liaison de facteur de transcription 3 dans la région 237 pb. les sites de méthylation-sensibles sont marquées par le rouge, et les sites de Sp1 liaison (flèches bleues) et
site PU.1 liaison (ligne verte
) sont indiqués
KLF4 de l'expression après la déméthylation
Pour examiner une implication de la méthylation dans l'expression KLF4, les cellules ont été traitées avec un réactif de déméthylation 5-aza, et l'expression a été analysée au niveau de l'ARNm et des protéines. Le traitement a fortement augmenté l'expression d'ARNm dans les cellules TSU et en particulier HCS2 cellules (Fig. 4a), dans laquelle le promoteur a été largement hyperméthylé. D'autres lignées cellulaires a augmenté l'expression de diverses façons, ce qui exclut les cellules qui expriment l'ARNm OSC19 inférieur à un niveau détectable. KLF4 expression de la protéine était presque identique à l'expression de l'ARNm. Il était indétectable dans les cellules HCS2, les cellules HSC3, Ho-1-u-1, les cellules TSU et OSC19 cellules. Après le traitement de déméthylation, hyperméthylé HSC2 et les cellules TSU fortement régulée à la hausse l'expression de la protéine (Fig. 4b), et Ho-1-u-1 des cellules, HOC313 et les cellules Ca9.22 qui ne contenait pas de M cytosine n'a pas augmenté le expression. cellules OSC19 n'expriment la protéine comme l'ARNm. Parmi les trois lignées cellulaires contenant M et U /M cytosines dans divers taux, les cellules et les cellules HSC3 KOSC2 apparemment augmenté l'expression, mais une autre (cellules SCCKN) ne l'ont pas. Figue. 4 Expression de KLF4 après la déméthylation. un pli relative de l'ARNm L'expression de KLF4 dans les cellules traitées avec la 5-aza réactif de déméthylation, divisé par l'expression sans traitement 5-aza (n
= 4). b KLF4 l'expression des protéines dans les cellules avec (+) et sans (-) 5-aza traitement ont été examinés par immunoblot. β-actine a été utilisé comme le rapport de contrôle interne
cellules Carcinome acquièrent des comportements agressifs dans un processus de progression en activant et en inactivant l'expression du gène associé à une tumeur. KLF4 expression est réduite dans de nombreux types de cancers à un stade avancé et la perte d'expression initie transition épithélio-mésenchymateuse des cellules de cancer qui stimule fortement la progression [19]. En fait KLF4 est régulée à la baisse dans les carcinomes oraux moins différenciés et avancés et supprime la dédifférenciation des cellules [7]. Bien que l'hyperméthylation de promoteur est considérée comme une cause de la perte d'expression [13-16], on ne sait pas dans les cancers oraux. Cette étude montre que l'expression est en corrélation étroite avec les Etats hyperméthylation à un pb-région 239 dans le promoteur
. Hyperméthylation responsable de l'inactivation du gène est fréquemment observée dans les îlots CpG de gènes suppresseurs de tumeur [11, 12], et il a été montré dans KLF4 du gène dans cette étude, ce qui suggère que cette région est importante pour réguler l'expression KLF4 dans les cellules de carcinome par voie orale. Ceci est supporté par ce traitement de déméthylation régulés à la hausse KLF4 ARNm et de protéine dans les cellules hyperméthylés, mais pas les cellules sans hyperméthylation. cellules Ca9.22, Ho-1-u-1 cellules et OSC19 cellules qui ne sont pas hyperméthylés a failli ne pas augmenter l'expression. Il suggère une présence de facteurs supplémentaires pour activer l'expression. Hyperméthylation de Toutefois, il est clair que l'hyperméthylation est responsable de KLF4 régulation à la baisse, et que le pb-région 237 peut jouer un rôle important dans l'expression. Du gène KLF4 de est passé à enhancer du gène dans des cellules tumorales malignes humaines; -2128 -1770 ~ Région dans les cellules de médulloblastome [20] et - 1,852 ~ -1658 région dans les cellules de carcinome du col [15]. Bien que nous ne sommes pas penchés sur la méthylation de l'activateur dans cette étude, la méthylation à la région de promoteur est plus directement en tant que plate-forme pour réguler l'expression des gènes en général [11, 12]. Hyperméthylation au promoteur du gène de KLF4 a été observée dans les cellules de carcinome gastrique (-130 ~ -13 région; ref 14.) Et dans les cellules de carcinome colorectal (+79 ~ +355 de la région; ref 13.), Mais le - 481 ~ la région 192 n'a pas été méthylé dans cette étude. Elle indique que l'hyperméthylation limité à une région de 237 pb à partir de - 718 à - 482 est important pour la régulation négative dans les cellules de carcinome par voie orale. preuves récentes ont établi que l'hyperméthylation a lieu à différentes régions du gène promoteur /activateur dans différents types de cellules de carcinome et l'hyperméthylation de promoteur est plus désignée pour la cellule de la lignée et la spécification d'un type cellulaire [11, 12]. Il est plausible que les sites sensibles hyperméthylation dans des cellules de carcinome oral localisent à part d'autres types de cellules de carcinome.
La région de 237 pb codant pour les sites de liaison Sp1 et PU.1 qui sont nécessaires pour l'expression [21, 22] . Sp1 joue un rôle essentiel dans le développement épithéliale [23, 24], et Klf4
- /-
souris développent des carcinomes oraux [8, 25]. Par conséquent, hypermethylation à la région 237 pb semble avoir un rôle important dans la régulation KLF4. Depuis la perte d'expression KLF4 associe étroitement à la progression du cancer par voie orale, la restauration de l'expression peut être une stratégie intéressante pour traiter les patients.
Conclusions
Cette étude a démontré que le promoteur du gène de KLF4 a été hyperméthylés dans des cellules de carcinome orales lors d'une région différente des autres types de cellules de carcinome, et qu'il est associé à l'expression KLF4. Etant donné que KLF4 est suppressive de tumeur, son inactivation par le hypermthylation promoteur peut être un mécanisme de progression du carcinome buccal dans des lignées cellulaires de carcinome analysés dans cette étude
Les abréviations
5-aza.
5-aza -2-deoxycitidine
KLF:
facteur Krüppel-like
M cytosine:
cytosine méthylé
U cytosine:
cytosine non méthylée
U /M cytosine:
Mélange de cytosines non méthylés et méthylés
Déclarations
Accusé
Cette étude a été soutenue par JSPS KAKENHI Nombre Grant 26462859, et réalisées en vertu d'un programme de recherche pour la science dentaire La vie à l'école de la vie de dentisterie de Tokyo, l'Université dentaire Nippon.
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supplémentaires. déposer
fichiers supplémentaires 1: Figure S1. Méthylation des sites sensibles à KLF4 de gène et le promoteur. séquence d'ADN analysés dans cette étude est montré (la séquence dans l'exon 1 est en majuscule). Cytosines potentiellement sensibles à la méthylation et leur nombre numérique ont été mis en évidence en rouge, et un hyperméthylé région 237-bps a été soulignée. Tableau S1. Un résumé de la méthylation indique à chaque méthylation cytosine sensibles. (PDF 160 ko) Intérêts concurrents
Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun conflit d'intérêts. La contribution de
Auteurs
AY, KK, AT, AS, HA, TH, DU, KY et TC terminé toutes les expériences. TC et KI conçu l'étude, et KI a écrit le manuscrit. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.
