épithéliale orale
Résumé de l'arrière-plan
cellules épithéliales gingivales sont la population majeure du tissu gingival, agissant en tant que la première ligne de défense contre les intrusions microbienne et de régulation de l'homéostasie du tissu parodontal en matière de santé et de la maladie par l'intermédiaire de la famille NLR pYRINE domaine contenant 3 (NLRP3) inflammasome, qui reconnaît des modèles moléculaires et de danger-pathogène-associé (PAMP et Damps). Le but de cette étude était de déterminer si l'activation de NLRP3 inflammasome dépend de l'infection par l'agent pathogène parodontale (P. gingivalis de la
) de Porphyromonas gingivalis, ou la stimulation avec le lipopolysaccharide de P. gingivalis (LPS), et /ou extracellulaire d'adénosine triphosphate (ATP).
Méthodes
Une ligne de cellules épithéliales par voie orale a été traitée avec P. gingivalis
, les LPS de P. gingivalis et de l'ATP. L'expression du gène et de la protéine de NLRP3 composants de inflammasome ont été quantifiés en temps réel, RT-PCR et des immunotransferts. La production d'IL-1β et de l'IL-18 a été mesurée par les résultats de ELISA.
Il n'y avait pas d'augmentation de NLRP3 expression du gène inflammasome après l'infection de P. gingivalis à moins pré-stimulés par l'ATP. Conclusions des augmentations évidentes de NLRP3 expression du gène inflammasome a été observée après P. gingivalis
LPS stimulation, même pré-stimulée par l'ATP à 2 h. de
Les résultats indiquent que l'activation de l'inflammasome NLRP3 ne repose pas sur P . gingivalis
infection, à moins stimulée par les LPS de P. gingivalis et /ou ATP extracellulaire, suggérant des voies de signalisation diverses sont impliquées dans la réponse immunitaire de l'hôte.
Mots-clés
extracellulaires adénosine triphosphate (ATP) NLRP3 inflammasome Porphyromonas gingivalis
(P. gingivalis
) P. gingivalis
LPS fond
parodontite chronique, l'une des maladies les plus courantes et les plus répandues chez l'homme dans le monde [1], est définie comme une chronique de l'infection axée les maladies inflammatoires du parodonte entraînant la destruction du tissu gingival, l'absorption de l'os alvéolaire et, éventuellement, la perte des dents [2]. Lorsque l'infection se produit, le système immunitaire inné sera la première ligne de défense contre les agents pathogènes et active le système immunitaire adaptatif pour une protection durable de ces invasions [3].
Les complexes multi-protéiques intracellulaires, appelés "inflammasomes NLR" jouer un rôle central dans l'immunité innée. Parmi inflammasomes, le pyrine domaine contenant 3 (NLRP3) inflammasome est le plus étudié [4]. les cellules épithéliales gingivales expriment une inflammasome NLRP3 fonctionnelle qui peut être activé par des motifs moléculaires ou danger pathogène-associé (PAMP ou Damps) [4]. NLRP3 est assemblé avec l'ASC protéine adaptatrice (protéine de grain comme associée à l'apoptose) dans un complexe multi-protéique qui régit l'activation de la caspase-1 et la maturation ultérieure du des cytokines pro-inflammatoires interleukine (IL) -1β et /ou IL-18 dans la réponse de l'hôte à l'infection parodontale [4]. les cellules épithéliales gingivales peuvent détecter et reconnaître PAMP ou Damps [5] par la stimulation des récepteurs de reconnaissance des agents pathogènes (PRR) [1, 3], avec libération ultérieure des cytokines pro-inflammatoires IL-1ß et IL-18 [6]. Le travail fondamental par Bostanci et al. [7] ont indiqué que la première inflammasomes NLR sont impliqués dans la maladie parodontale, qui réponses à l'infection de P. gingivalis cliniques et in vitro
études.
Interleukin-1ß (IL-1β), une cytokine pro-inflammatoire appartenant à la famille IL-1, est essentiel dans la défense de l'hôte contre les infections microbiennes [5] et régule les réponses immunitaires et inflammatoires innées. L'IL-18 est une autre cytokine pro-inflammatoire de la famille de l'IL-1 [6], et il a récemment été décrit comme étant un élément important dans le système de Inflammasome qui active la caspase-1 et conduit à l'activation du processus de l'inflammation. Des données récentes ont montré que la maturation et la sécrétion d'IL-1β et de l'IL-18 sont régies par le complexe inflammasome NLRP3 qui contient l'échafaud NLRP3, caspase-1 et de la protéine de grain apoptotique contenant un domaine de recrutement de caspase C-terminal (ASC) [8 ]. Un excès d'IL-1β et IL-18 contribuent à une augmentation du nombre de réponses inflammatoires humaines [9]. Bien que l'IL-1β et IL-18 appartiennent à la même famille de cytokines, l'expression du gène et de la sécrétion sont régulés de manière différentielle dans les cellules monocytaires humaines en réponse à P. gingivalis
[10]. Par conséquent, les cytokines de la famille IL-1 peuvent participer via
différentes voies dans la pathogénie complexe de parodontite [10].
P. gingivalis
, une bactérie anaérobie à Gram négatif [11], a été confirmée être un agent pathogène parodontal prédominant [12] et produit un certain nombre de facteurs de virulence potentiels pour perturber le système de défense de l'hôte [13] et induire une réponse inflammatoire dans les maladies parodontales [14]. Cependant, l'effet de P. gingivalis
sur l'activation de l'inflammasome NLRP3 reste controversée. Lipopolysaccharide (LPS), en tant que composant de la paroi cellulaire majeur de P. gingivalis
[15], est considéré comme un facteur de virulence important de déclencher la réponse inflammatoire dans la parodontopathie [16]. Il semble être décidé à l'unanimité que le traitement LPS des phagocytes mononucléaires, [17] les macrophages [18] et les cellules épithéliales orales [19] induit de manière significative l'expression de NLRP3 et procaspase-1 à la fois au niveau des ARNm et de protéines. Des études ont montré qu'un polymorphisme fonctionnel dans LPS-récepteurs affecte le processus inflammatoire et les résultats cliniques de la maladie périodontique [20]. Les résultats décrits ci-dessus suggèrent que gingivalis entières P.
et les LPS de P. gingivalis peuvent avoir des effets différents sur l'activation du système de NLRP3 inflammasome.
Extracellulaires ATP (adénosine triphosphate), l'un des premiers activateurs décrits à induire la formation de inflammasome NLRP3, est attribué au groupe des Damps endogènes libérés par mourants ou blessés cellules [21, 22]. Sa présence est négligeable dans les tissus sains, mais peut monter à des niveaux micromolaires élevés suite aux dommages de tissu aux sites d'inflammation [23]. Des études ont montré ATP induite par la caspase-1 activation et à la suite de l'IL-1β de presse [24, 25]. En outre, Özlem et al. démontré que l'IL-1β n'a pas été sécrétée à moins LPS-traitée ou les cellules épithéliales gingivales infectées (GECS) ont ensuite été stimulés par l'ATP, et que l'ATP n'a eu aucun effet supplémentaire sur NLRP3 ou l'expression de l'ASC chez P. gingivalis
infecté GEC [26] . Ces résultats soulignent la nécessité d'évaluer davantage le rôle de l'ATP dans l'activation de l'inflammasome NLRP3.
Par conséquent, l'activation du complexe inflammasome NLRP3 dans un modèle de culture de cellules épithéliales par voie orale par l'infection de P. gingivalis, ou P. gingivalis
LPS ou stimulation ATP a été testé. Ceci a fourni une meilleure compréhension du mécanisme derrière l'inflammation du parodonte.
Méthodes
culture cellulaire epitheliale buccale The lignée de cellules épithéliales (H413) dérivée d'un carcinome humain à cellules squameuses par voie orale [27], présente une morphologie stratifiée de cellules épithéliales Culture. H413 lignées de cellules clonées ont été établis en utilisant une méthode de dilution limite comme décrit précédemment [28]. Les cellules clonées ont été cultivées dans du milieu essentiel minimum (JMEM, Joklik modification, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) Eagle, pénicilline /streptomycine (100 UI /ml, Sigma) et 10% de sérum de veau foetal (FCS, CSL Limited , Victoria, Australie) à 37 ° C dans 5% de CO
2 [29]. Les cultures ont été récoltées avec triple express (remplacement de la trypsine, Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) dans du PBS et sous-culture tous les 3 jours.
Les Porphyromonas gingivalis de culture cellulaire bactérienne
(ATCC 33277) a été cultivé dans des conditions anaérobies pendant 24 h à 37 ° C dans un bouillon trypticase-soja supplémenté avec hémine (5 mg /ml, Sigma) et la ménadione (1 mg /ml, Sigma). Le jour du traitement des cellules, les bactéries ont été centrifugées à 5000 tpm et 4 ° C pendant 15 min, lavées deux fois et remises en suspension dans du PBS froid, pH 7,3.
Traitement de cellules confluentes
H413 cultures de cellules (5 x 10 6 cellules en T-25 cm 2 flacons) ont été lavés trois fois avec du PBS et infectés par P. gingivalis
à une multiplicité d'infection (MOI) de 100 cellules bactériennes par une cellule épithéliale [30 ] pour 2 et 4 h [31, 32], ou stimulées avec 1 pg /ml ultrapure lipopolysaccharide (LPS) de P. gingivalis de (Invivogen, San Diego, CA, USA) dans les milieux de croissance cellulaire pour 2 et 4 h. Les cellules non infectées et non stimulées ont servi de témoins.
Des expériences ont également été effectuées après pré-incubation des cellules avec 5 mM d'adénosine triphosphate (ATP) (Invivogen) pendant 3 heures avant l'infection par P. gingivalis ou à la stimulation
avec les LPS de P. gingivalis pour 2 et 4 h. Cellules pré-incubées avec de l'ATP 5 mM pendant 3 h étaient comme témoins pour ces groupes.
L'isolement de l'ARN et quantitative en temps réel RT-PCR
Après le traitement, les cellules ont été récoltées dans 1 ml de réactif Trizol (Invitrogen) et ARN extrait selon le protocole Trizol. Pour la transcription inverse, les Premières-Strand cDNA ont été synthétisés avec oligo (dT) 12-18 (Invitrogen), 10 mM dNTP (Promega, Madison, WI, USA), 5 × premier tampon de support, RNaseOUT ™ Recombinant RNase Inhibitor (Invitrogen) et SuperScript ™ III de la transcriptase inverse (Invitrogen) selon le protocole du fabricant.
Amorces pour les gènes codant pour des composants de inflammasome (NLRP3, l'ASC et de la caspase-1) et les cytokines IL-1 et IL-18 (tableau 1) ont été conçus en utilisant le logiciel Oligo Explorer (1.1.0) et synthétisée par Integrated DNA Technologies (IDT, Coralville, IA, USA). analyses RT-PCR en temps réel ont été réalisées par des analyses basées SYBR vert en utilisant le système Stratagene MxPro-Mx3005P (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Les réactions de PCR ont été réalisées avec 2 ul d'échantillons d'ADNc dilués, 200 nM de chacun respectif avant et arrière amorce dans un mélange réactionnel de 20 ul final avec platine SYBR Green PCR quantitative SuperMix UDG-(Invitrogen). échantillons d'ADNc isolés de non-manipulées H413 clone-1 cellules ont été quantifiées par kit PicoGreen (Invitrogen), puis utilisés pour la construction de courbes standard (2-2000 pg) par référence à l'expression de la maison en gardant gène codant β-actine. Les réactions de PCR pour chaque gène ont été réalisées en triple exemplaire dans des plaques à 96 puits, et initié par l'activation à 95 ° C pendant 2 min, suivie de 40 cycles de PCR de dénaturation à 95 ° C pendant 15 s, annelage et extension à 60 ° C C pendant 30 s. Les résultats ont été analysés à l'aide MxPro 4.10 software.Table 1 Amorces utilisées pour les gènes en temps réel RT-PCR
oligos
Primers5'-3 'amplicon
attendu taille
numéros UniGene
NLRP3
F-amorce
GCTGGACCTGAGTGACAAC
151 bp
Hs.159483
R-primer
GCTGAGTACCGAGGACAAAG
ASC
F-primer
AGGCCTGCACTTTATAGACC
174 bp
Hs.499094
R-primer
GCTGGTGTGAAACTGAAGAG
caspase-1
F-primer
GAAAAGCCATGGCCGACAAG
205 bp
Hs.2490
R-primer
GCCCCTTTCGGAATAACGGA
IL-1β
F-primer
GGCCCTAAACAGATGAAGTG
90 bp
Hs.126256
R-primer
GTAGTGGTGGTCGGAGATTC
IL-18
F-primer
GCATCAACTTTGTGGCAAT
161 bp
Hs.83077
R-primer
CCGATTTCCTTGGTCAAT
β-actin
F-primer
ACTCTTCCAGCCTTCCTTC
216 bp
Hs.520640
R-amorce
GGAGCAATGATCTTGATCTTC
Immunoassay-ELISA pour quantifier les niveaux d'IL-1β et IL -18
Une norme en sandwich enzyme-linked immuno-sorbant (ELISA) a été utilisé pour mesurer la production de cytokine de l'IL-1β et de l'IL-18. En bref, les surnageants de test (traités avec P. gingivalis
, les LPS de P. gingivalis, ATP + P. gingivalis
ou ATP + P. gingivalis
LPS) et des cultures de cellules de contrôle ont été prélevés à chaque heure ( 1, 2, 3, 4, 5, 6 h), puis les particules enlevées par centrifugation et analysées immédiatement ou aliquotés et congelés à -20 ° C. IL-1β et de l'IL-18 monoclonal spécifique avec des anticorps polyclonaux (1 pg /ml) ont été pré-enduit sur des plaques à 96 puits (Corning Incorporated, USA) élevée de liaison dans un tampon de carbonate (pH 9,0) à 4 ° C pendant une nuit. Après avoir enlevé la solution de revêtement et en lavant la plaque trois fois avec 200 ul de PBS /puits, la plaque a été bloquée avec du sérum bovin à 3% d'albumine (BSA, Sigma) à 4 ° C pendant une nuit. Les échantillons d'essai ont été ajoutés à des puits en triple pendant 90 min à température ambiante, et suivi d'un lavage avec 0,05% de Tween 20 /PBS (TPBS) trois fois; puis incubées avec l'anticorps secondaire (chèvre anti-souris /IgG de lapin (DAKO, Glostrup, Danemark) conjugué à la phosphatase alcaline (AP)) dilué à 1: 1500 dans TPBS pendant 2 h à température ambiante, puis on l'a lavé avec du tampon TPBS 3 fois. conjugués liés ont été détectés par pNPP (p-nitrophényl-phosphate) et l'absorbance mesurée à 405 nm dans un lecteur de microplaques (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) après 15-30 minutes d'incubation à la température ambiante. Les réactions ont été stoppées par addition d'un volume égal de NaOH 1,00. L'IL-1β humaine et l'IL-18 concentration des échantillons ont été interprétés à partir d'une courbe standard.
Immunotransferts pour NLRP3, ASC et caspase-1 protéines
Pour mesurer l'expression des protéines inflammasome, 2 et 4 h cultures de les différentes conditions (traitées avec P. gingivalis
, les LPS de P. gingivalis, ATP 3 h + P. gingivalis
ou ATP 3 h + P. gingivalis
LPS) ont été extraites dans un tampon échantillon SDS et séparées par PAGE en utilisant un gradient de 5 à 12% des mini-gels, transférés sur des membranes de nitrocellulose (Bio-Rad) et bloquées pendant une nuit avec 3% de BSA (Sigma) dans 0,1 M de Tris tamponnée solution de sels à pH 7,4 (TBS). antigènes Blotted ont été incubées avec des anticorps anti-humains de lapin polyclonaux CIAS1 /NALP3, TMS1 /ASC, Caspase-1 (1 pg /ml, Abcam, Cambridge, Royaume-Uni), et β-actine (0,1 pg /ml, Gentex, Zeeland, MI , Etats-Unis) en tant que témoin de chargement de 0,05% de Tween 20 /TBS pendant 4 heures, lavées trois fois et ensuite mis en incubation avec de la phosphatase alcaline (AP) conjugué à l'anticorps secondaire (chèvre-anti-lapin IgG DAKO) dilué 1: 1500 dans du Tween 20 /TBS pendant 2 h. L'anticorps lié a été visualisé avec AP substrat (Bio-Rad) après le développement de la réactivité pour les protéines de l'anticorps témoin.
analyse statistique
Toutes les données ont été analysées par appariés t
-test (moyenne ± SD, deux tailed , 95% CI) à partir d'au moins trois expériences consécutives pour en temps réel RT-PCR et ELISA. Pour la quantification Western blot, l'analyse densitométrique a été effectuée sur l'intensité de niveau de gris des bandes de cible par rapport à contrôler les bandes ß-actine dérivées à partir de films numérisés, transformés en utilisant Gene outil logiciel d'analyse de l'image (GeneToos version 4,02; Syngene, Cambridge, Royaume-Uni) [33]. P
& lt; 0,05 a été considérée comme statistiquement significative.
Inflammasome (NLRP3, ASC et de la caspase-1) Résultats de l'expression en réponse à P. gingivalis
, les LPS et de l'ATP de P. gingivalis, plus P. gingivalis
/P. gingivalis, le LPS
Dans toutes les expériences, il n'y avait aucune différence significative dans l'expression génique entre les groupes témoins non stimulées et des groupes témoins prétraités avec ATP.
Comme le montre la Fig. 1a, il y avait la régulation de l'expression génique NLRP3 après l'infection de P. gingivalis à 2 et 4 h par rapport au groupe témoin. En revanche, il a été l'expression du gène de NLRP3 augmenté à 2 h avec P. gingivalis
LPS stimulation. En outre, NLRP3 était significativement régulée à la hausse après une pré-incubation avec de l'ATP pendant 3 h, puis l'infection par P. gingivalis et
stimulation avec LPS de P. gingivalis pendant 2 heures, mais il a été régulée à la baisse à 4 h. Au niveau de la protéine (Fig. 2), tandis que les cellules ont été incubées pendant 2 h et 4 avec P. gingivalis et
P. gingivalis
stimulation par le LPS ou le prétraitement avec de l'ATP pendant 3 h, les tendances de la protéolyse de NLRP3 des bandes correspond à celle de l'expression génique. Ceci indique que l'activation du NLRP3 dépendait de LPS et /ou de l'ATP de P. gingivalis, mais pas l'infection de P. gingivalis. Figue. 1 Gene expressions de NLRP3, ASC et de la caspase-1. Des changements significatifs dans les gènes codant pour inflammasome NLRP3 (a), la protéine adaptatrice associée (ASC) (b) et de la caspase-1 (c) avec les différents traitements de l'infection de P. gingivalis, P. gingivalis de LPS aux stimuli, et ATP ainsi que P. gingivalis
ou les LPS de P. gingivalis dans les cellules épithéliales H413. * P
& lt; 0,05, ** P
& lt; 0,01, t apparié
-test
Fig. 2 Western blot montrant NLRP3 expression des protéines dans les cellules épithéliales H413 traitées avec des conditions différentes (P. gingivalis de
, les LPS de P. gingivalis et ATP ainsi que P. gingivalis
ou P. gingivalis
LPS). Les tendances des bandes de NLRP3 mesurées correspondent à l'expression du gène NLRP3. * P
& lt; 0,05, t apparié
-test
En Fig.1b, au cours du temps de l'infection de P. gingivalis, il y avait une diminution significative des niveaux d'ARNm ASC (2 et 4 h) par rapport au groupe de contrôle, et une augmentation significative des niveaux d'ARNm ASC ont été observées à 2 h stimulation par les LPS de P. gingivalis. Pour ATP, plus l'infection de P. gingivalis, il y avait une régulation de l'ASC à 2 h, suivie d'une régulation à 4 h par rapport au groupe de pré-traitement ATP. Pour ATP, plus P. gingivalis
LPS stimulation, il y avait une réduction marquée de l'ASC à 4 h par rapport au groupe de pré-traitement ATP. Ces résultats suggèrent que les changements ASC d'ARNm sont critiques dans les LPS de P. gingivalis et ATP induite par l'activation de l'inflammasome NLRP3. Au niveau des protéines, des changements similaires dans la protéine ASC ont été mesurées (données non représentées). Le plus outre, comme le montre la Fig. 1c, les données ont montré qu'il n'y avait pas d'augmentation de la caspase-1 l'expression des gènes dans les deux P. gingivalis
infectés et P. gingivalis
LPS stimulés groupes. Après que les cellules ont été pré-incubées avec de l'ATP pendant 3 h, le niveau de la caspase-1 dans les deux P. gingivalis
infection (2 h) et de P. gingivalis
stimulation par le LPS (2 et 4 h) les groupes était significative amont régulé par rapport au groupe de pré-traitement de l'ATP. Ces résultats indiquent que l'activation de la caspase-1 dépend de la stimulation par l'ATP dans P. gingivalis
infectés ou LPS de P. gingivalis cellules traitées. Il n'y avait aucun changement sur la caspase-1 niveau protéique par immunoblots (données non présentées). Expression
IL-1β en réponse à P. gingivalis
, les LPS de P. gingivalis et de l'ATP ainsi que P. gingivalis
/P. gingivalis de LPS
De même, pour déterminer les changements dans l'expression de l'IL-1β par des composants inflammasome activation, l'expression du gène de l'IL-1β a été mesurée en temps réel RT-PCR (Fig. 3a). Au cours du temps de l'infection de P. gingivalis, une augmentation significative des taux d'ARNm pro-IL-1β a été mesurée à 2 h par rapport au groupe témoin, qui a ensuite diminué au niveau de commande à 4 h. les niveaux d'ARNm pro-IL-1ß accrus ont également été observées après que les cellules pré-traitées avec de l'ATP pendant 3 h puis infectés par P. gingivalis
à 2 et 4 h. Il n'y avait pas de changement avec des cellules stimulées par les LPS de P. gingivalis et ATP ainsi que P. gingivalis
LPS. Dans les surnageants de culture cellulaire (Fig. 3b), il y avait une forte concentration de maturité IL-1β à 2 h dans le groupe de l'infection des P. gingivalis, et à 3 et 4 h dans l'ATP ainsi que P. gingivalis
groupe d'infection, ce qui correspond à l'expression des gènes pro-IL-1β (Fig. 3a). Il n'y avait aucune sécrétion d'IL-1β détectée dans les P. gingivalis
groupe de stimulation par LPS, mais une augmentation notable retardée en réponse à l'ATP ainsi que P. gingivalis
groupe LPS à 5 h (Fig. 3b). Ces résultats indiquent que l'infection de P. gingivalis a une plus grande capacité à induire la sécrétion d'IL-1β que P. gingivalis
LPS. Figue. 3 un changements dans les niveaux pro-IL-1β ARNm dans les cellules H413 traitées avec P. gingivalis
infection et ATP prétraitement. b données ELISA montrant la protéine IL-1β matures libéré de H413 cellules après différents traitements. * P
& lt; 0,05, ** P
& lt; 0,01, t apparié
-test
IL-18 expression en réponse à en réponse à P. gingivalis
, les LPS de P. gingivalis et ATP ainsi que P. gingivalis
/P. gingivalis de LPS
L'expression du gène de l'IL-18 a également été mesurée en temps réel RT-PCR (Fig. 4a). Il n'y avait pas de changement dans la pro-IL-18 mesurée dans le groupe de l'infection des P. gingivalis, mais significativement diminué pro-IL-18 dans les P. gingivalis
groupe stimuli LPS à 2 h. En outre, le pré-traitement des cellules avec ATP pendant 3 h induit la régulation positive de la pro-IL-18 à tous les points de temps et augmenté de façon significative l'IL-18 expression dans les deux gingivalis
infection à P. et P. gingivalis
LPS groupes stimuli. Dans les surnageants de culture cellulaire (Fig. 4b), les cellules stimulées par le LPS de P. gingivalis
a eu une augmentation significative de la IL-18 mature sécrétion qui a atteint un pic entre 4 h et 5 h. Cela n'a pas été évident dans le groupe de l'infection du P. gingivalis. Ce niveau élevé de protéines ne correspond pas à la faible pro-IL-18 niveau de l'ARNm dans le groupe LPS des P. gingivalis, peut-être que la concentration en protéines est influencée par plusieurs paramètres - principalement la synthèse et le clivage [34]. Après que les cellules ont été pré-traitées avec de l'ATP pendant 3 h, la sécrétion d'IL-18 mature dans le milieu de culture cellulaire a été mesurée à l'ATP ainsi que P. gingivalis
groupe d'infection et fait preuve d'une augmentation notable de la concentration des cytokines. Cependant, dans les gingivalis ATP ainsi que P.
groupe LPS, une courbe biphasique a été montré, qui ne reflète pas le niveau d'ARNm [34]. Ces résultats indiquent que P. gingivalis
infection n'a pas induit IL-18 mature sécrétion, tandis que les LPS de P. gingivalis ou ATP stimulation conduit à une maturité la production d'IL-18. Figue. 4 une variation des niveaux pro-IL-18 ARNm dans les cellules H413 avec des traitements différents de P. gingivalis de LPS les stimuli et l'ATP ainsi que P. gingivalis
infection ou P. gingivalis
LPS. b données ELISA montrant IL-18 mature protéine libérée par les cellules H413 après différents traitements. * P
& lt; 0,05, ** P
& lt; 0,01, t apparié
-test
Changements dans le complexe inflammasome NLRP3 après stimulation par P. gingivalis
, les LPS de P. gingivalis et de l'ATP de la figure 5 montre un résumé de la réponse immunitaire innée contre une infection par P. gingivalis et LPS de P. gingivalis et la stimulation par l'ATP dans ce modèle cellulaire. Lorsque les cellules ne sont pas prétraitées avec de l'ATP (panneau de gauche), l'infection par P. gingivalis
dans ce modèle n'a pas déclencher l'activation du complexe inflammasome NLRP3, y compris NLRP3, ASC et de la caspase-1, jusqu'à ce que P. gingivalis
LPS stimulation, même si, dans un court laps de temps de 2 h (sauf caspase-1). Notamment, la production d'IL-1β n'a pas compté sur l'activation de l'inflammasome NLRP3 et est impliqué dans les premiers stades de l'inflammation. IL-18 la production nécessite à la fois NLRP3 et activation ASC après stimulation par les LPS de P. gingivalis. Lorsque les cellules sont prétraitées avec de l'ATP (panneau de droite), une réponse rapide de l'activation de l'inflammasome NLRP3 a été montré (2 h), avec une production ultérieure des cytokines IL-1 ß et l'IL-18 dans les cellules avec P. gingivalis
infection . Cependant, lorsque les cellules sont stimulées avec du LPS de P. gingivalis, la production d'IL-1β nécessaire caspase-1 et l'activation a montré une augmentation retardée en réponse au traitement de l'ATP (panneau de droite). Les résultats indiquent que P. gingivalis
, LPS de P. gingivalis et l'ATP ont tous des effets différents sur les cellules épithéliales pour produire la réponse inflammatoire finale. Figue. 5 réponse immunitaire innée à l'infection de P. gingivalis, ou les LPS de P. gingivalis et stimulation par l'ATP dans les cellules épithéliales. Dans le panneau de gauche, lorsque les cellules sont stimulées avec l'infection de P. gingivalis ou les LPS de P. gingivalis sans ATP prétraitement, le complexe inflammasome NLRP3 est inhibée jusqu'à ce que P. gingivalis
stimulation par le LPS, à l'exception de la caspase-1 . la production d'IL-1β est pas NLRP3 inflammasome dépend toutefois de l'IL-18 repose sur la sécrétion NLRP3 et l'activation de l'ASC. Dans le panneau de droite, les cellules prétraitées avec de l'ATP, qui active NLRP3 inflammasome, entraîne la libération ultérieure des cytokines IL-1 et l'IL-18 dans P. gingivalis
cellules infectées. ATP peut également favoriser la caspase-1 activation sur P. gingivalis de LPS la stimulation. Sécrétion d'IL-1β est toujours compatible avec la caspase-1 activation après stimulation par P. gingivalis
Discussion de
LPS Dans cette étude, l'infection de P. gingivalis down-régule NLRP3 composants inflammasome, y compris NLRP3 , l'ASC et de la caspase-1 dans les cellules épithéliales à tous les points temporels, ce qui indique que P. gingivalis
peut soit réguler positivement ou négativement réguler l'expression NLRP3, en fonction du type de cellule [35]. Dans ce modèle, P. gingivalis
peut atténuer le critère des réponses immunitaires innées en inhibant l'activation des NLRP3 inflammasome et échapper à la surveillance de l'hôte, offrant un avantage de survie à tous les organismes cohabitants du biofilm [35]. Pendant ce temps, une régulation positive l'expression du gène de l'IL-1β après l'infection de P. gingivalis, montre que l'IL-1β est une cytokine essentiel dans la défense de l'hôte contre l'infection par P. gingivalis
[5]. En outre, l'IL-1β ne NLRP3 ou la caspase-1 dépendante [5, 36] et d'autres facteurs peuvent également influencer la sécrétion de la protéine IL-1β. Par conséquent, nous pensons que la sécrétion d'IL-1β dans les premiers stades de l'infection de P. gingivalis pourrait jouer un rôle très important dans la lutte contre l'invasion pathogène dans le cadre de la réponse immunitaire innée [37]. Ceci est en accord avec la conclusion de Dinarello que l'IL-1β est l'une des premières cytokines sécrétées pendant les phases initiales de l'inflammation et participe à presque tous les événements impliqués dans l'activation et la régulation de l'inflammation [36]. Ce type d'activation IL-1β inflammasome indépendant peut sensiblement contribuer à l'inflammation des tissus [38].
Dans la présente étude, LPS induit une réponse immunitaire frappante par la régulation de l'expression génique de NLRP3 et ASC, mais pas caspase -1, ce qui indique que les LPS de P. gingivalis, il est un facteur clé dans le déclenchement de la réponse inflammatoire qui conduit à l'état maladif [16] et est considérée comme un facteur de virulence important dans la pathogenèse de la maladie périodontique. Cependant, la recherche de Jain et Darveau a élucidé que l'activation de NLRP3 et ASC après des stimuli pro-inflammatoires comme le LPS peuvent être impliqués dans l'apoptose des cellules hôtes, qui soutient l'idée de P. gingivalis
la mort cellulaire induite par [39], qui serait alors de faciliter periodonto-pathogènes pour envahir et détruire les tissus épithéliaux. En outre, la caspase-1 est synthétisé sous forme d'un zymogène inactif. Son activation est étroitement régulée par inflammasomes et associé à une forme rapide et lytique de la mort cellulaire connu sous le nom pyroptosis [40]. Cela pourrait expliquer le mécanisme que la caspase-1 activation est inhibée après P. gingivalis
LPS stimulation jusqu'à activé avec des stimuli ATP dans la présente étude.
ATP est un signal de détresse extracellulaire très efficace [41]. En tant que l'un des premiers activateurs décrits pour induire la formation de Inflammasome NLRP3, il est attribué au groupe de amortit endogènes, qui proviennent de cellules mourantes [22]. Dans cette étude, nous démontrons que l'ATP active le inflammasome NLRP3, libérant ensuite des cytokines IL-1 β et l'IL-18, même si l'effet est très transitoire et la concentration ne peut pas être suffisamment élevée pour maintenir le niveau de activé inflammasome NLRP3. Ces résultats confirment que l'ATP extracellulaire, comme un signal de danger, les résultats dans l'assemblage de NLRP3 inflammasome et la sécrétion de cytokines matures dans P. gingivalis
cellules infectées par [26]. En outre, un dénominateur commun de l'ATP extracellulaire activant NLRP3 a la capacité de former des pores de la membrane qui induisent des dommages de l'intégrité membranaire ou provoquent une perturbation de la concentration ionique intracellulaire [22].
En outre, après une stimulation avec de l'ATP et de P. gingivalis
LPS, la réduction de l'expression du gène de l'ASC peut servir de mécanisme pour arrêter l'inflammation, ce qui évite l'excès de zèle des réponses immunitaires [32]. De même, la lignée cellulaire epitheliale (H413) utilisé dans cette étude a pour fonction de retenir l'activité et la sécrétion d'IL-1β [42] pour protéger la cellule contre la destruction tissulaire. Conclusions de Cela peut expliquer notre constatation montrant une augmentation reportée de l'IL-1β en réponse à l'ATP ainsi que P. gingivalis
stimulation par le LPS.
Les résultats indiquent que P. gingivalis
stimulation par le LPS induit une plus grande proinflammatoire réaction que l'infection de P. gingivalis, et cette action devient plus intense après le pré-traitement de l'ATP. Ces résultats peuvent fournir de nouvelles perspectives sur les objectifs des stratégies thérapeutiques pour traiter les maladies inflammatoires telles que la parodontite
abréviations
ASC:.
Apoptose protéine associée speck-like
ATP:
adénosine triphosphate
Damps:
Danger-associé motifs moléculaires
NLRP3:
Nod récepteur -comme (NLR) famille, le domaine contenant 3-pyrine
PAMP:
pathogen-associated molecular patterns
P . gingivalis
:
Porphyromonas gingivalis
LPS de P. gingivalis:.
lipopolysaccharide de P. gingivalis
Déclarations de les Remerciements
Nous remercions le professeur Neil Hunter et le Dr Ping Ye pour leur technique et de laboratoire prend en charge. Nous remercions également le Dr Jinlong Gao et le Dr Xiaoyan Zhou pour fournir P. gingivalis
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