biofilm
Résumé de l'arrière-plan
Un certain nombre de maladies orales, y compris la parodontite, dérivent de biofilms microbiens et sont associés à une résistance accrue aux antimicrobiens. Malgré l'utilisation répandue des collutoires utilisée comme mesures d'appoint pour contrôler ces biofilms, leur utilisation prolongée est déconseillée en raison de divers effets secondaires. Par conséquent, les antimicrobiens alternatifs à large spectre qui minimisent ces effets sont très recherchés. acide fulvique dérivé Glucides (CHD-FA) est un acide organique qui a déjà démontré que microbicide contre les biofilms de Candida albicans, par conséquent, les objectifs de cette étude étaient d'évaluer l'activité antibactérienne du CHD-FA contre les biofilms dérivés oralement et pour étudier les effets biologiques d'appoint.
Méthodes de concentrations minimales inhibitrices ont été évalués pour CHD-FA et de chlorhexidine (CHX) contre une gamme de bactéries orales en utilisant des tests de microdilution normalisé pour planctoniques et sessiles. La microscopie électronique à balayage a été également utilisé pour visualiser les changements dans les biofilms par voie orale après un traitement aux antibiotiques. La cytotoxicité de ces composés a été évaluée contre les cellules épithéliales orales, et l'effet de CHD-FA sur les marqueurs inflammatoires de l'hôte a été évaluée par la mesure de l'ARNm et l'expression des protéines.: Résultats
CHD-FA a été très actif contre toutes les bactéries orales testées, y compris Porphyromonas gingivalis
, avec une concentration inhibitrice minimale de 0,5% sessiles. Cette concentration a été montré pour tuer les biofilms multi-espèces d'environ 90%, un niveau comparable à celui de la chlorhexidine (CHX). Conclusions Dans un modèle de culture cellulaire de mammifère, le prétraitement des cellules epitheliales avec un tampon CHD-FA a été montrée de manière significative la régulation négative des médiateurs inflammatoires importants, y compris l'interleukine-8 (IL-8), après stimulation par un biofilm multi-espèces. de
Dans l'ensemble, CHD-FA a été démontré de posséder une large spectre d'activité antibactérienne, avec une fonction supplémentaire d'être capable de réguler à la baisse l'inflammation. Ces propriétés offrent une gamme intéressante de fonction à partir d'un composé d'origine naturelle, qui peut être utilisé comme une stratégie de traitement topique des maladies de remplacement de biofilm par voie orale. D'autres études in vitro et in vivo
sont nécessaires pour déterminer le mécanisme précis par lequel CHD-FA modulant la réponse immunitaire de l'hôte.
Matériel supplémentaire Mots-clés
acide fulvique chlorhexidine biofilm antibactérienne parodontite Inflammation électronique
la version en ligne de cet article (doi:. 10 1186 /1472-6831-13-47). contient du matériel supplémentaire, qui est disponible pour les utilisateurs autorisés
Contexte
carie dentaire, la gingivite et la parodontite sont les la plupart des maladies microbiennes courantes de la cavité buccale, la majorité associée à un biofilm polymicrobienne [1, 2]. Les biofilms sont une collection de micro-organismes multicellulaires attachés les uns aux autres ou sur une surface, et sont noyées par une couche protectrice de la matrice extracellulaire (ECM) [3]. Les biofilms sont d'une plus grande importance clinique que leurs homologues planctoniques flottant librement en raison de leur capacité innée à résister à la thérapie et d'accueil défenses antimicrobiennes. Ceci est dû à la production extensive de l'ECM et d'autres facteurs tels que l'augmentation de l'extrusion des antimicrobiens par une activité accrue de la pompe à efflux [3, 4].
Collutoires antimicrobiens sont l'une des principales stratégies thérapeutiques et préventives actuellement utilisées dans la gestion de biofilm par voie orale maladies, dont la chlorhexidine (CHX) est largement acceptée comme le «gold standard» [5]. Cet agent antiseptique a une activité supérieure à ses comparateurs, et est à la fois bactéricide et statique contre les micro-organismes présents dans les biofilms par voie orale ayant un rôle dans la pathogenèse de la maladie bucco-dentaire. De plus, sa substantivité fournit une activité prolongée par sa capacité à adsorber sur la pellicule se trouve sur les surfaces de l'émail des dents [6]. Malgré cela, diverses études ont montré une utilisation à long terme de CHX peut ne pas être pratique car elle est associée à la coloration des dents et altérations du goût [7, 8]. En outre, les récents rapports d'événements indésirables, y compris des réactions anaphylactiques, à ce composé ont été décrits [9]. Il a également été montré récemment inefficaces contre les biofilms cultivés à partir d'isolats cliniques [10].
La prévention et le traitement des maladies du biofilm par voie orale telles que les parodontopathies et les infections des muqueuses, peuvent bénéficier d'un composé qui a la puissance de CHX avec un minimum d'effets secondaires, mais suscite également des propriétés biologiques, des adjuvants tels que l'altération des voies de l'inflammation, qui sont manifestement important dans la pathogenèse de la maladie de biofilm par voie orale [11, 12]. Une étude antérieure a montré CHX est capable de réguler vers le bas des médiateurs inflammatoires en cas de contestation avec des stimuli bactériens [13], bien que les aspects toxicologiques de CHX peut être la raison de la diminution de l'expression. Nous avons également montré l'avantage d'utiliser des agents naturels dans la gestion des infections par voie orale, où l'huile d'arbre à thé (TTO) était non seulement non-toxique, mais a été en mesure d'atténuer la réponse immunitaire de l'hôte à un stimulus fongique [14]. De plus, notre groupe ont déjà évalué l'activité antiseptique d'acide glucide dérivé fulvique (CHD-FA), où il a été montré que le composé était tout aussi efficace contre les cellules planctoniques et biofilm de Candida albicans. Mécanistique cela a été identifié comme étant un procédé de rupture de membrane qui n'a pas été affectée par des mécanismes définis biofilm adaptatifs de résistance [15]. CHD-FA est un acide organique colloïdale, qui est un constituant majeur des acides humiques. Une forme purifiée de CHD-FA a récemment été produit par un procédé breveté, qui a été montré pour être non toxique dans un modèle de plaie de rat, avec des suggestions de l'activité anti-inflammatoire [16]. En outre, un, en double aveugle, essai contrôlé randomisé récent a indiqué qu'il a été bien toléré dans une étude clinique de l'eczéma [17].
Le but de cette étude était de déterminer si CHD-FA a un large spectre d'activité contre les biofilms microbiens de pertinence par voie orale afin de déterminer si elle pourrait être utilisée comme une alternative à CHX collutoires base, qui ont connu des effets secondaires de l'utilisation prolongée. L'objectif secondaire de l'étude était de déterminer si la concentration antibactérienne du CHD-FA avait des propriétés immunomodulatrices d'appoint, tel que rapporté par ailleurs [16]. Nous signalons que CHD-FA affiche une activité microbicide rapide contre les biofilms pertinentes par voie orale, et qu'il est également capable de réguler vers le bas l'expression des molécules pro-inflammatoires dans les cellules épithéliales pertinentes par voie orale.
Méthodes
conditions Culture et normalisation
Une sélection de souches de laboratoire de bactéries commensales et pathogènes associés à la maladie de biofilms buccaux ont été utilisés dans cette étude, y compris Porphyromonas gingivalis
ATCC 33277 et Fusobacterium nucleatum
ATCC 10596, qui ont été maintenues à 37 ° C sur anaérobie fastidieux agar (FAA [Lab M, Lancashire, Royaume-Uni]) dans des conditions anaérobies (85% N
2, 10% de CO 2 et 5% H 2, [Don Whitley Scientific Limited, Shipley, Royaume-Uni] ). Streptococcus mutans
10449, NCTC Streptococcus mitis 12261, Actinobacillus actinomycetemcomitans
OSM 1123 et Enterococcus faecalis
NCTC 5957 ont été cultivées et maintenue à 37 ° C sur la Colombie gélose au sang (ABC [Oxoid, Hampshire, Royaume-Uni ] dans 5% de CO 2. Tous les isolats ont été stockés indéfiniment dans des flacons Microbank® (Pro-Lab Diagnostics, Cheshire, Royaume-Uni) à -80 ° C.
P. gingivalis
et F. nucleatum
ont été propagées dans du bouillon anaérobie de 10 ml Schaedler (Oxoid), S. mitis
et A. actinomycetemcomitans
ont été cultivées dans 10 ml bouillon de soja tryptique (TSB [Sigma-Aldrich, Dorset, Royaume-Uni]) additionné de 0,6% extrait de levure et 0,8% de glucose. En.faecalis
a été cultivé dans du TSB avec 0,25% de glucose, et S.mutans
a été cultivé dans 10 ml de cerveau-coeur (BHI [Sigma-Aldrich]), le tout à 37 ° C cultures d'une nuit C et dans des conditions atmosphériques appropriées. on a lavé par centrifugation (1000 x g
) et remises en suspension dans 10 ml de PBS. Toutes les bactéries ont ensuite été normalisées et ajustées à une concentration de travail finale de 5 x 10 4 et 1 × 10 7 cellules /ml pour planctoniques et les tests de sensibilité sessiles, respectivement.
tests de sensibilité antibactérienne de cellules planctoniques et biofilm
au cours de cette étude deux composés actifs des produits d'hygiène bucco-dentaire Dentracine (Fulhold Ltd, Le Cap, Afrique du Sud) et Corsodyl (Consumer Health Care GlaxoSmithKline, Royaume-Uni) ont été testés, à savoir CHD-FA et CHX, respectivement.
tests antimicrobiens pour déterminer les concentrations minimales inhibitrices (CMI) de cellules planctoniques (de PMIC) a été réalisée à l'aide la méthode de microdilution de bouillon CLSI M11-A8 pour les bactéries anaérobies [18] et CLSI M7-A9 pour les bactéries cultivées dans 5% de CO 2 [19]. concentrations minimales bactéricides (MBC) ont également été déterminées par des méthodes de placage standard.
Pour les essais de biofilm standardisés P. gingivalis
, F. nucleatum, S. mitis
et A. actinomycetemcomitans
ont été cultivées pendant 72 h et E. faecalis
pendant 24 h dans leurs milieux respectifs et aux conditions atmosphériques, à l'exception de S. mutans
qui a été cultivé dans du BHI supplémenté avec 2% de saccharose pendant 48 heures. Les biofilms ont été cultivées statiquement dans disponibles dans le commerce plat à 96 puits des plaques de microtitrage à fond (Corning Incorporated, NY, USA) et les tests de sensibilité sessile a été effectuée comme décrit par ailleurs [20]. Après le traitement antimicrobien, les biofilms ont été lavées deux fois avec du PBS et 10% alamarBlue® (Invitrogen, Paisley, Royaume-Uni) ont été ajoutés aux films biologiques avant l'incubation pendant 4 heures dans l'obscurité [21]. concentrations minimales inhibitrices sessiles (SMIC) ont été lus visuellement et aucun changement de couleur a été défini comme le SMIC. Test de tous les planctoniques et sessiles isolats a été réalisée en quatre à deux occasions distinctes.
Tests de sensibilité antibactérienne d'un biofilm parodontale multi-espèces
Un multi-espèces modèle de biofilm parodontale constitué de P. gingivalis
, F. nucleatum, S. mitis
et A. actinomycetemcomitans
a été développé pour les tests antimicrobiens. Toutes les espèces bactériennes ont été normalisés à 1 x 10 7 ufc /mL dans de la salive artificielle (AS) comme décrit précédemment [22]. Ceci a été constitué de mucine d'estomac de porc (0,25% p /v), du chlorure de sodium (0,35 p /v), du chlorure de potassium (0,02 p /v), du chlorure de calcium dihydraté (0,02 p /v), extrait de levure (0,2 p /v ), poudre de Lemco de laboratoire (0,1 p /v), de la peptone de proteose (0,5 p /v) dans ddH 2O. L'urée a été diluée dans du PBS (40% p /v) et ajouté à une concentration finale de 0,05% (v /v) dans l'AP. Les biofilms ont été préparées dans des plaques de 24 puits (Corning, NY, USA) contenant des lamelles Thermanox ™ sur mesure (diamètre 13 mm, Fisher Scientific). Pour l'addition de chaque espèce bactérienne du biofilm une suspension bactérienne standardisée a été préparée dans 500 pi d'AS. Dans un premier temps, les biofilms S. mitis ont été cultivées pendant 24 h. Le milieu a été ensuite éliminé et normalisé F. nucleatum
ajouté, qui a été mis en incubation en anaérobiose pendant 24 heures supplémentaires. Le surnageant a été de nouveau enlevé et P. gingivalis normalisés
et A. actinomycetemcomitans
AS ajouté au biofilm. On a ensuite mis à incuber à 37 ° C dans une chambre anaérobie pendant 4 jours; chaque surnageants de jour ont été remplacés par des frais AS. Comme on l'a montré CHD-FA à être actif à 0,5% v /v contre tous les biofilms bactériens testés dans cette étude, cette concentration a été utilisée en plus de 0,2% v /v CHX pour traiter multispécifiques biofilms pendant 30 minutes, avant de rincer soigneusement avec du PBS et la viabilité déterminée à l'aide biofilm alamarBlue®. L'absorbance a été lue à 570 nm et la longueur d'onde de référence à 600 nm. La réduction du pourcentage de viabilité biofilm a été calculé selon les instructions du fabricant. Cette étude a été réalisée à trois reprises, en triple exemplaire.
Après le traitement antimicrobien, les biofilms ont été conservés et utilisés pour quantifier le nombre de chaque espèce bactérienne trouvée après CHD-FA et le traitement CHX par rapport au témoin non traité. En bref, les biofilms ont été soniquées dans 1 ml de PBS pendant 10 minutes et l'ADN extrait en utilisant le kit MasterPure Gram positif Purificiation ADN (Epicentre®, Cambridge, Royaume-Uni), en suivant les instructions du fabricant. 1 ul d'ADN extrait a été ajouté à une mastermix contenant 12,5 pi SYBR® Greener ™, 9,5 pi UV-eau traitée RNase et 1 pl de 10 uM d'amorces avant /arrière pour chaque espèce bactérienne. Les amorces utilisées sont les suivantes:
A. actinomycetemcomitans
F - 5'GAACCTTACCTACTCTTGACATCCGAA3 ', A. actinomycetemcomitans
R - 5'TGCAGCACCTGTCTCAAAGC3', F. nucleatum
F - 5'GGATTTATTGGGCGTAAAGC3 ', F . nucleatum
R - 5'GGCATTCCTACAAATATCTACGAA3 ', P. gingivalis
F - 5'GCGCTCAACGTTCAGCC3', R P. gingivalis - 5'CACGAATTCGCCTGC3 ', S. mitis
F - 5'GATACATAGCCGACCTGAG3' , le R de S. mitis -. Trois répliques indépendantes 5'CCATTGCCGAAGATTCC3 'de chaque paramètre ont été analysés en triple en utilisant la machine MxProP PCR quantitative et MxProP logiciel 3000 (Stratagene, Amsterdam, Pays-Bas). Les échantillons ont été quantifiés basés sur une courbe standard établie précédemment constituée de comptes bactériens connus.
Ultrastructurales changements de biofilms bactériens
microscopie électronique à balayage (MEB) a été effectuée sur S. mutans
, E. faecalis
et les multispécifiques biofilms. Les cellules ont été normalisées dans des milieux appropriés, comme décrit ci-dessus, et ont été cultivées sur des lamelles directement Thermanox ™ (Nunc, Roskilde, Danemark) afin de permettre la formation de biofilm. Après biofilms de maturation ont été soigneusement lavées avec du PBS avant que leurs traitements respectifs. Biofilms ont ensuite été soigneusement lavées deux fois avec du PBS puis fixées dans 2% de para-formaldéhyde, 2% de glutaraldéhyde et 0,15 M de cacodylate de sodium et 0,15% p /v de bleu alcian, pH 7,4, et préparé pour SEM comme décrit précédemment [23]. Les échantillons ont été revêtus par pulvérisation cathodique d'or et visualisées sous un microscope électronique à balayage Jeol JSM-6400. Les images ont été assemblées à l'aide du logiciel Photoshop (Adobe, San Jose, CA, USA) Toxicité de. Du CHD-FA sur une lignée de cellules épithéliales orale
OKF6 /TERT2 cellules (offert par le laboratoire Rheinwald, Hôpital Brigham and Woman, Boston, États-Unis), une lignée humaine immortalisée de cellules kératinocytes par voie orale, ont été utilisés pour déterminer la cytotoxicité du CHD-FA. Les cellules ont été cultivées jusqu'à 90% de confluence dans un milieu sans sérum des kératinocytes (KSFM) à 37 ° C dans 5% de CO 2 et ensemencées à une densité de 1 x 10 5 cellules /ml dans une plaque à 24 puits. Une fois que les cellules ont atteint 80-90% de confluence, les cellules ont été soigneusement lavées avec du PBS avant le traitement avec 0,5% (v /v) CHD-FA au pH natif 2,0 et un pH neutre de 7,0 et 0,2% (v /v) CHX pendant 30 min. Au bout de 30 min, les composés ont été enlevés et les cellules lavées soigneusement avec du PBS pour éliminer toutes les matières actives résiduelles. Les cellules ont été incubées dans KSFM pendant 4 et 24 heures avant que la viabilité cellulaire a été évaluée en utilisant le dosage alamarBlue®, tel que décrit ci-dessus. Études de faisabilité ont été réalisées en triple, à trois occasions distinctes.
Évaluation des propriétés immunomodulatrices de CHD-FA
OKF6 /TERT2 cellules ont été cultivées à 90% de confluence dans des plaques à 24 puits dans définies KSFM puis pré-traitée avec 0,5 % CHD-FA (pH 7,0) pendant 30 min. CHD-FA à pH 2,0 était toxique contre la lignée cellulaire utilisée dans cette étude et ne pouvait donc pas nous permettre d'analyser les propriétés immunomodulatrices potentiels de ce composé. Par conséquent, CHD-FA tamponnées à un pH de 7,0 a été utilisée pour évaluer d'autres propriétés biologiques du composé. 0,5% CHD-FA à pH 2,0 et 0,2% CHX ont été montrés pour être toxiques pour les cellules épithéliales, donc on n'étudiée plus. Les cellules ont été lavées avec du PBS pour éliminer les résidus CHD-FA. Comme agoniste inflammatoire, nous avons utilisé les multispécifique biofilm périodontique, comme décrit ci-dessus, qui a été fixée à la partie inférieure d'un insert de culture de cellules de suspension (Millipore, Massachusetts, USA) en utilisant Vaseline, puis posé à côté de la monocouche cellulaire. Les cellules ont été mises en incubation avec le biofilm pendant 4 périodontique et 24 h à 37 ° C dans 5% de CO 2. Les cellules non pré-traités par CHD-FA, ou non contestées avec biofilms, ont servi de contrôles appropriés. Après la stimulation, les surnageants et les lysats cellulaires ont été retenus pour évaluer la régulation d'un groupe de médiateurs pro-inflammatoires.
L'analyse initiale de l'expression des gènes a été réalisée à l'aide d'une mesure conçue RT Array 2 Profiler PCR (Qiagen, Crawley, Royaume-Uni ). RT 2 tableaux de Profiler sont en temps réel SYBR® Greener ™ basée sur la PCR qui permettent la détection de plusieurs gènes d'intérêt, en même temps. En bref, 24 ul d'une mastermix contenant SYBR® Greener ™, l'ADNc synthétisé en utilisant la RT 2 kit First Strand (Qiagen) et de l'eau sans RNase a été ajouté à chaque puits de la RT 2 plaque de Profiler, qui a déjà contenait les amorces avant et arrière pour les gènes d'intérêt (IL-1alpha, IL-1ß, IL-6, TNF, CSF2, CSF3, IL-8, CXCL1, CXCL3, CXCL5, CCL1 et GAPDH). Deux répétitions de chaque condition ont été utilisés dans la RT 2 Profiler, qui a été réalisée en deux occasions distinctes.
IL-8 l'expression des gènes a été analysée à l'aide sur la base SYBR® verte qPCR (Invitrogen), en utilisant GAPDH comme un ménage gène. Les amorces utilisées étaient les suivantes: IL-8 F 5'CAGAGACAGCAGAGCACACAA3 'IL-8 R 5'TTAGCACTCCTTGGCAAAAC3', F GAPDH 5'CAAGGCTGAGAACGGGAAG3 ', R 5'GGTGGTGAAGACGCCAGT3 GAPDH. En bref, l'ARN a été extrait à partir de lysats cellulaires (Qiagen, Crawley, UK) et 55 ng /pl de l'ADNc synthétisé en utilisant la RT 2 du premier brin d'ADNc kit de synthèse (Qiagen, Crawley, UK) selon les instructions du fabricant. 1 pi d'ADNc synthétisé a été ajouté à une mastermix contenant 12,5 pi SYBR® Greener ™, l'eau RNase 10,5 pi UV-traitée et 0,5 pi de marche avant /arrière amorces. Trois répliques indépendantes de chaque paramètre ont été analysés en double en utilisant la machine MxProP PCR quantitative et MxProP logiciel 3000 (Stratagene, Amsterdam, Pays-Bas) et l'expression génique normalisée à l'GAPDH de gène de ménage selon la 2 -ΔΔCT
méthode [24 ].
interleukine 8 (IL-8) libération dans les surnageants de culture de cellules a été évaluée par ELISA (Invitrogen, Paisley, Royaume-Uni), selon les instructions du fabricant. Les résultats ont été calculés en utilisant un ajustement de courbe à 4 paramètres, quantifier les changements colorimétrique à 630 nm (BMG-Labtech, Ortenberg, Allemagne).
Analyse statistique
production graphique, la distribution des données et des analyses statistiques ont été effectuées en utilisant GraphPad Prism (version 4, La Jolla, CA, USA). Après avoir évalué si les données conformes à une distribution normale par avant et après les transformations de données, analyse unidirectionnelle de la variance (ANOVA) et des tests t ont été utilisés pour étudier les différences significatives entre les groupes indépendants de données qui estimés à une distribution gaussienne. Une correction de Bonferroni a été appliquée à la valeur p pour tenir compte des comparaisons multiples des données. les données non paramétriques ont été analysées en utilisant le U de Mann-Whitney
-test pour évaluer les différences entre les deux groupes d'échantillons indépendants. t-tests de Student ont été utilisés pour mesurer les différences statistiques entre les valeurs Δ
Ct des deux groupes indépendants évalués dans les études d'expression génique, bien que les données peuvent être représentées en pourcentage ou plier le changement dans les chiffres. La signification statistique a été atteint si P & lt; Le CHD-FA: Résultats de 0,05
. possède une activité antibactérienne rapide et à large spectre
Corsodyl® (0,2% CHX) et Dentracine (0,8% CHD-FA) sont des formulations orales contenant les ingrédients actifs CHX et CHD-FA, respectivement. Les deux agents se sont révélés être très actifs contre les bactéries planctoniques et sessiles orales testées (données non présentées). Les études décrites dans ce manuscrit a porté sur l'ingrédients actifs CHX et CHD-FA et les deux se sont avérés très efficaces pour inhiber et de tuer tous les isolats testés par voie orale lorsqu'il est cultivé soit planctonique et comme biofilms (tableau 1). PMICs pour les isolats oraux allaient de 0,0625% à 0,25% pour CHD-FA et de & lt; 0,00039% à 0,00078% pour CHX. Le rapport qualité /PMIC PBMC pour CHD-FA et CHX étaient ≤4, indiquant les deux composés présentaient une activité bactéricide. Aucune des espèces bactériennes testées étaient nettement plus sensibles ou résistantes à l'un des composés. À la fois CHD-FA et CHX ont montré une activité contre les biofilms matures, avec SMIC de 0,5% pour CHD-FA et de 0,003% à 0,025% pour CHX. Fait intéressant, bien que CHX était efficace à des concentrations plus faibles, le changement de pli PMIC au SMIC varie de seulement 2 à 8 pour CHD-FA, alors que pour ce CHX variait de 2 à 64. Dans l'ensemble, P. gingivalis
était le plus sensible organisme aux thérapies antimicrobiennes testées, en particulier pour les cellules planctoniques. En outre, tous les biofilms bactériens étaient également sensibles à la CHD-FA avec un SMIC de 0,5% .Table profil 1 Susceptibilité des bactéries buccales cliniquement pertinentes à quatre agents antimicrobiens
MIC (%)
CHD-FA
CHX
Organism
PMIC
MBC
SMIC
Plier changer
PMIC
MBC
SMIC
Pliez changement
(SMIC /PMIC)
(SMIC /PMIC)
A. a *
0.25
0.25
0.5
2
0.00078
0.00313
0.025
32
S. mitis
0.0625
0.125
0.5
8
0.00078
0.00156
0.0125
16
S. mutans
0.25
0.25
0.5
2
0.00039
0.00078
0.025
64
E. faecalis
0.125
0.25
0.5
4
0.00156
0.025
0.003
2
F. nucleatum
0.125
0.5
0.5
4
0.00039
0.00078
0.195
32
P. gingivalis
0.0625
0.5
0.5
8
≤0.00039
0.00078
0.0625
≥16
*UNE. . Actinomycetemcomitans
CHD-FA - (Fulhold Ltd, Afrique du Sud), CHX -. (GlaxoSmithKline Consumer Health Care, Royaume-Uni)
Une analyse plus approfondie de l'impact de CHD-FA sur la structure cellulaire physique a été évaluée par SEM pour les biofilms représentatives. traitement CHD-FA a réduit la quantité globale de ECM de S. mutans (figure 1B) et a également provoqué une perturbation de la membrane cellulaire, comme l'a démontré par l'apparition percé de E. faecalis
(figure 1D). La figure 1 CHD-FA réduit ECM et compromis structure de la membrane cellulaire. S. (le x2000) de mutans et E. faecalis
(X5000) biofilms ont été soit non traitées (A et C, respectivement), ou traités avec 0,5% (v /v) CHD-FA (B et D respectivement) pendant 24 h sur des lamelles Thermanox ™. Ceux-ci ont ensuite été traitées et visualisées sur un microscope électronique à balayage Jeol JSM-6400 et des images assemblées à l'aide du logiciel Photoshop. CHD-FA Notez la réduction de la matrice extracellulaire (B) et la perturbation des membranes bactériennes de cellules (D), désignées par des flèches sur les cellules sessiles. Est efficace contre plusieurs espèces biofilm parodontale
Étant donné que les biofilms de l'oral cavité sont polymicrobienne dans la nature, nous avons développé un modèle multi-espèces représentatives simple et reproductible de la plaque sous-gingivale pour tester CHD-FA (figure 2A). L'activité antimicrobienne de CHD-FA à 1 x SMIC a permis de réduire de façon significative la viabilité des cellules à moins de 10% (p & lt; 0,0001), ce qui est comparable à la chlorhexidine, ce qui a également réduit de manière significative la viabilité des cellules à 8% (p & lt; 0,0001). Cependant, le traitement suivant le nombre de chacune des espèces au sein des biofilms ont été quantifiés et n'a montré aucune réduction significative de la biomasse après CHD-FA ou le traitement CHX, par rapport au témoin non traité (figure 2B). Figure 2 CHD-FA tue et perturbe multi-espèces biofilms parodontales. Multi-espèces biofilms parodontales ont été cultivées sur des lamelles Thermanox ™ dans les plaques à 24 puits pour un total de 5 jours, avec AS médias changés tous les jours. Lors du développement du biofilm, les cellules ont été traitées avec 0,5% (v /v) CHD-FA et 0,2% (v /v) CHX pendant 24 heures avant d'être lavés avec du PBS. La réduction de l'activité métabolique a été mesurée en utilisant le dosage alamarBlue® (A). Tous les échantillons ont été analysés en triple, à trois reprises. Les données représentent moyenne ± SD (*** p & lt; 0,0001). Les biofilms ont été retenus après le traitement avec CHD-FA ou CHX et l'ADN a été extrait pour la quantification de chaque espèce en utilisant SYBR® Greener ™ à base de qPCR (B). Biofilms ont également été analysés par MEB à l'une ou l'autre 2000x (C, E, G) et 5000x (D, F, H). Ceux-ci ont été traitées et visualisées sur un microscope électronique à balayage Jeol JSM-6400 et des images assemblées à l'aide du logiciel Photoshop. multispécifiques non traitées biofilms ont d'abord été comparés à faible grossissement (C) pour les biofilms traités avec 0,2% (v /v) CHX (E) et 0,5% (v /v) CHD-FA (G) pendant 24 h et il a été montré que le biofilm traitements causés désagrégation. A plus fort grossissement biofilms traités avec 0,5% (v /v) CHD-FA pendant 24 heures ont donné lieu à un ECM fibreux, comme indiqué par des flèches (H), par rapport au témoin (D) et CHX (F).
analyse MEB de ces biofilms a ensuite été réalisée afin d'évaluer un effet quelconque sur l'architecture du biofilm (figure 2C-H). À faible grossissement (x2000) à la fois CHX-FA et la maladie coronarienne se sont avérées perturber l'architecture du biofilm (figure 2E et G) par rapport au témoin non traité (figure 2C), comme représenté par des zones de biofilms ventilées clairsemées. Par ailleurs, à fort grossissement (x5000) CHD-FA a également semblé altérer l'apparence physique globale de la matrice du film biologique avec une plus grande quantité d'ECM fibreux observées comme indiqué par les flèches (figure 2H), par rapport au contrôle et à la CHX (figure 2D et F). CHD-FA modifie l'expression des médiateurs pro-inflammatoires de CHD-FA la toxicité a été évaluée en utilisant une lignée de cellules épithéliales pertinentes par voie orale afin de déterminer s'il y avait des effets néfastes des composés testés avant les enquêtes immunomodulateurs. Deux CHX et CHD-FA, à son pH natif de 2,0, se sont révélés être très toxiques envers les cellules epitheliales, ce qui réduit la viabilité inférieure à 10% après 30 minutes d'exposition (figure 3). Cependant, lorsque CHD-FA a été tamponnée à un pH neutre de 7,0, aucune diminution significative de la viabilité des cellules a été observée. La figure 3 CHD-FA est non toxique contre une lignée de cellules épithéliales par voie orale. Une ligne pertinente par voie orale des cellules épithéliales (OKF6 /TERT2) a été cultivé à 90% de confluence dans des plaques à 24 puits pour les études de toxicité. Les cellules ont été traitées avec 0,5% (v /v) CHD-FA à un pH de 2,0 et 7,0 et 0,2% CHX pendant 30 min. Après traitement, les cellules ont été soigneusement lavées avec du PBS et la viabilité cellulaire évaluée en utilisant le test alamarBlue®, avec l'absorbance lue à 570 et 600 nm. Tous les échantillons ont été dosés en triple exemplaire, à trois reprises indépendantes. Les données représentent moyenne ± SD (*** p & lt; 0,0001).
Nous avons ensuite cherché à déterminer si oui ou non CHD-FA était capable d'induire une réponse biologique à partir des cellules épithéliales, principalement en mesurant les changements médiateurs immunitaires. Afin d'évaluer cela, un modèle de biofilm quatre espèces ont été mis au point, en l'absence de problèmes de toxicité n'a été observé lors du contact avec la lignée cellulaire epitheliale à 4 h (données non représentées). Par ailleurs, nous avons montré que les cellules traitées CHD-FA ne modifient pas significativement la libération d'IL-8 après 4 h et 24 h (données non représentées). Des études d'expression génique initiale en utilisant la RT 2 Profiler sur les cellules épithéliales pré-traitées avec CHD-FA avant la provocation de biofilm ont montré une régulation générale des médiateurs pro-inflammatoires (figure 4A). gènes régulés à la baisse significatives inclus IL-6 (8,5 fois [p = 0,018]), IL-1β (7,05 fois [p = 0,012]), le TNFa (5,22 fois [p = 0,013]) et IL-8 (4,24 fois [ ,,,0],p = 0,021]). La figure 4 CHD-FA module médiateurs inflammatoires clés in vitro. Une lignée de cellules épithéliales par voie orale (OKF6) a été cultivée jusqu'à 90% de confluence dans des plaques à 24 puits pour évaluer l'effet de CHD-FA sur la réponse immunitaire de l'hôte. Les cellules ont été pré-traitées avec 0,5% (v /v) CHD-FA pH 7,0 pendant 30 min, on l'a lavé avec du PBS et stimulées avec le multi-espèces biofilm parodontale pendant 4 h et 24 h. des témoins non traités ont été inclus. Les échantillons ont été dosés en triple exemplaire, et à trois reprises. L'ARN a été extrait à partir des 4 h lysats cellulaires, l'ADNc synthétisé et utilisé dans les profils RT2 pour analyser l'expression d'un panel de médiateurs pro-inflammatoires (A). Des échantillons en double de deux expériences indépendantes ont été utilisées dans le RT2 Profiler. Les données sont représentées par moyenne + 95% CI, par rapport au témoin non traité. Des échantillons ont également été analysés pour l'expression du gène IL-8 en utilisant qPCR base SYBR® Greener ™ (B). L'expression de l'IL-8 est représenté par rapport au gène de ménage; GAPDH. surnageants conservés ont également été utilisés pour mesurer l'IL-8 libération de protéines par ELISA (C). Tous les échantillons ont été dosés en triple exemplaire, à trois reprises indépendantes. Les données représentent moyenne ± SD (* p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01)
Nous avons ensuite mis l'accent sur l'IL-8 expression, l'un des gènes fortement touchés et un médiateur clé de l'inflammation parodontale.. Au niveau de l'ARNm, IL-8 était significativement régulée à la baisse dans les cellules pré-traitées avec CHD-FA après 4 h, par rapport au témoin non traité (p = 0,0383) (figure 4B). Aucune différence statistiquement significative n'a été observée après stimulation h 24 (p = 0,1712). En outre, au niveau de la protéine, l'IL-8 libération a été montré pour être significativement régulée à la baisse lorsque les cellules ont été pré-traitées avec CHD-FA, après 4 h (p = 0,008) et 24 h (p = 0,0037) stimulation biofilm ( La figure 4C). . CHD-FA seul n'a eu aucun effet sur les cellules épithéliales de l'IL-8 par voie orale expression d'ARNm ou de protéine (données non représentées) Rapport de
maladies microbiennes par voie orale sont généralement médiée par les biofilms; communautés de micro-organismes qui co-ensemble comme structures collantes et tenaces et qui ont augmenté de façon caractéristique la résistance aux antimicrobiens [25]. Nous avons récemment rapporté que les bains de bouche, y compris CHX étaient inefficaces contre une gamme de souches de SARM cliniques [10], ce qui suggère que d'autres agents antimicrobiens doit être étudiée. En effet, des études récentes de C. albicans
ont montré que l'utilisation de molécules d'origine naturelle sont efficaces contre les deux isolats dérivés par voie orale et systémique [14, 15]. Nous rapportons ici que CHD-FA, une molécule antiseptique d'origine naturelle, présente une activité antimicrobienne à large spectre rapide, et provoque également une activité immunomodulatrice.
Nous avons d'abord entrepris une évaluation comparative des CHD-FA et CHX contre une gamme de bactéries importantes associées avec des infections biofilm orale.
