Résumé de l'arrière-plan
Il y a confusion sur la définition du terme «État (s) de viabilité" de micro-organismes. «Coloration Viabilité» ou «techniques de coloration vitale" sont utilisés pour distinguer en direct de bactéries mortes. Ces colorations, d'abord établies sur les bactéries planctoniques, peuvent avoir de graves lacunes lorsqu'elles sont appliquées à biofilms multispécifiques. Les résultats des techniques de coloration doivent être comparées avec les données microbiologiques appropriées.
Discussion
Beaucoup de termes décrivent «états de vie» des micro-organismes, cependant, plusieurs d'entre eux sont trompeurs. Les auteurs définissent «viable» comme «capable de croître". Par conséquent, les méthodes de coloration sont des substituts, car aucune coloration peut prouver la viabilité
La fiabilité d'une «viabilité» commerciale coloration d'essai (Molecular Probes) est discutée sur la base de la fiche d'information du produit correspondant. (I) principe Coloration; (II) Les concentrations de bactéries;. Résultats
(III) Calcul des vivants /morts proportions in vitro du kit "de viabilité" dépendent de la concentration des taches et sur leur relation avec le nombre de bactéries dans le tester. En général, ce système de coloration ne convient pas pour multispécifiques biofilms, donc des déclarations inexactes ont été publiées par les utilisateurs de cette technique.
Pour comparer les résultats de la coloration avec des paramètres bactériens techniques appropriées devraient être sélectionnées. L'évaluation des unités formant colonie est insuffisante, plutôt le calcul de Placage efficacité est nécessaire. Vital coloration de fluorescence avec la fluorescéine diacétate et le bromure d'éthidium semble être la meilleure méthode éprouvée et adaptée à la recherche de biofilm.
En ce qui concerne la mutagénicité de composants de coloration utilisateurs doivent être conscients que non seulement le bromure d'éthidium peut être nocif, mais aussi une variété d'autres substances qui la toxicité et la mutagénicité ne sont pas déclarés
Sommaire -. la nomenclature relative à la «viabilité» et «vitalité» doit être utilisé avec précaution
-. le manuel de la «viabilité» trousse commerciale se fait remarquer que le kit ne convient pas à la recherche plurispécifique naturelle de biofilm, appuyée par un tableau de la littérature
-. les résultats obtenus avec diverses taches sont influencées par la relation entre le nombre de bactéries et la quantité de teinture utilisée dans l'essai. les données de vie correspondantes sont sujettes à décalage artificielle
-. Comme paramètre microbiologique l'efficacité Placage doit être utilisé pour la comparaison
-. éthidium Bromure est mutagène. Les chercheurs doivent être conscients que les composés de coloration alternatives peuvent également être ou même sont mutagène.
Mots-clés
état dentaire plaque biofilm Microorganismes Viabilité fluorescence Vital viabilité bactérienne kit Mutagénicité Contexte
La définition de la soi-disant «état de viabilité ( s) "de micro-organismes a été un sujet de confusion et de discussion depuis des décennies (pour un aperçu de la pléthore de la littérature voir [1-5]). Récemment, deux manuscrits ont discuté ce sujet. Hannig et al. [6] étudié l'influence d'un roman rince-bouche contenant microamas hydroxyapatite sur l'adhérence des bactéries en utilisant le BacLight ™ en direct /mort technique de coloration. Tawakoli et al. [7] par rapport différents vivants /morts "pour des colorations détection et la quantification des micro-organismes adhérents"
dans le biofilm orale initiale. Conformément à la littérature antérieure ces deux articles démontrent que des efforts sérieux ont été faits au cours des dernières décennies pour définir les différents états entre morts et vivants (marins et orales) des micro-organismes, et que «la coloration de viabilité» ou «techniques de coloration vitale" ont été et sont encore utilisés comme un essai pour surmonter le problème de la distinction entre les micro-organismes vivants et morts dans les biofilms.
Ces dernières années, de plus en plus de scientifiques dans la recherche de biofilm dentaire sont devenus familiers avec commercialement disponibles taches vitalité /viabilité, en particulier le BacLight Assay ( BLA; BacLight ™ vivent /morts technique de coloration). Cependant, ce principe de coloration a des lacunes graves lorsqu'il est appliqué à multispécifiques naturels échantillons de biofilms indéfinis. Les résultats de ceci et d'autres techniques de coloration doivent être comparées aux techniques microbiologiques classiques comme l'évaluation des unités formant colonie (UFC) et, plus fiables, le calcul de l'efficacité de plaquage bactérienne (PE). Ces comparaisons avec un «gold standard» sont assez rares quand kits commerciaux sont utilisés dans la recherche de biofilm. En outre, les composants de ces colorants vitaux peuvent être potentiellement mutagène.
En résumé, le but de ce manuscrit est de débattre de la base, l'utilité et le risque de taches "viables" et "vitaux", en particulier dans la recherche de biofilm, avec une attention particulière à biofilms dentaires naturelles et vital coloration de fluorescence avec fluorescéine Diacetate /éthidium bromure [8]. Rapport de partir d'un point de vue scientifique, il est important que les données issues de ces techniques de coloration doivent refléter correctement l'état bactérien.
Quelle est la racine du problème?
D'un point de vue, le débat holistique couvre différents niveaux. Tout d'abord, la discrimination des micro-organismes morts ou vivants représente un problème crucial en bactériologie (environnement). Ce problème fondamental existe depuis des décennies et n'a pas encore été résolu. À cet égard, les termes «vitalité» et «viabilité» sont souvent utilisés et bien souvent mélangés - certains chercheurs échangent complètement ces termes [9]
Deuxièmement, "taches vitales" sont généralement seulement auxiliaires, mais ils sont rapides et simples. dans les études portant sur des dispositifs, par exemple, l'effet antibactérien de substances. Ici, le problème est la grande variété de substances de coloration et donc des principes de coloration, de sorte que la "pléthore de choix ajoute à la confusion"
[10]. De même
Pamp et al. [11] Etat: "taches Plus récemment développés, tels que les taches Syto .... peut efficacement colorer les cellules dans pratiquement toutes les couleurs de l'arc en ciel "
Cela peut sembler humoristique -. mais reflète simplement le problème. Comme nous venons de parler, Tawakoli et al. [7] ont utilisé des combinaisons de plusieurs taches (par exemple, la FDA, le CFDA, TCFDA, EB, ainsi que SYTO 9 /PI, Sytox rouge, en plus de la calcéine AM). Davey [10] se réfère également à la FDA, PI et SYTO 9, mais en plus à des substances comme SYTO I vert, DIBAC4, pyronine Y, rhodamine 123 et orange thiazole. Il est pas étonnant que cet auteur [10] se réfère à un autre quatre avis seulement d'informer sur le «modus operandi»
des différentes taches fluorescentes et la «grande diversité de possibilités en termes de sélection des taches, concentration, temps de coloration, etc ".
Lors de l'analyse plus loin, le problème devient encore plus complexe. Certains auteurs critiquent l'utilisation limitée de l'iodure de propidium (PI) comme une viabilité cellulaire (sic!)
Indicateur [12, 13], tandis que d'autres surveillés différences frappantes entre SYTO 9 et SYTO 12 concernant l'influence des porines sur la cinétique d'absorption de ces colorants [14]. Cela signifie que lorsque des substances antibactériennes perturbant l'intégrité de la membrane cellulaire sont évalués à l'utilisation de ces techniques de coloration vitale peut être trompeur. Un aspect inhérent à ce problème, à savoir la pertinence des méthodes de coloration, est la dépendance sur les concentrations des taches des résultats (voir plus loin).
Troisièmement, les utilisateurs sont, pour la plupart, malheureusement pas au courant que ces tests "séduction" ont seulement été validé pour un nombre très limité d'espèces bactériennes [13, 15]. De 15 000 "hits" (250 avis) générés dans PubMed en demandant "cytométrie de flux & amp; bactéries ", trois seulement ont été laissés après filtration de la base de données lors de l'utilisation" biofilm "comme un terme de traçage supplémentaire. Aucun de ces trois articles contribue au débat.
Il est crucial que les «taches vitales» et, bien plus important, leurs combinaisons sont directement comparées aux données bactériologiques classiques. Comme discuté plus loin en détail, cela peut ne pas être l'évaluation des CFU, mais de PE. En dentisterie un travail correspondant a été complété en utilisant une ou plusieurs lucide des espèces in vitro
sans procéder à des tests bactériologiques [6, 16-18], tandis que certaines entreprises ont utilisé cette méthode de coloration de confiance en soi
dans sa fiabilité [ ,,,0],19, 20]. le résultat Lorsque la combinaison SYTO 9 /PI a été en fait lié aux évaluations microbiologiques correspondant était incompatible [21-23]. À notre avis, il est impossible de trouver des études où des exemples particuliers de ces colorants vitaux et ses combinaisons ont été correctement comparés et liés aux données microbiologiques concernant multispécifiques naturelles biofilms comme la plaque dentaire.
Enfin, les colorants peuvent être ou sont toxiques ou mutagènes . En ce qui concerne la liste des composés, comme mentionné précédemment, et issu de [7] et Viabilité
[10], il faut déterminer s'il y a un préjudice ou un risque dans l'utilisation de ces substances. Par rapport Vitalité
Netuschil [8] a enregistré 49 termes pour décrire «états de vie" de micro-organismes (par exemple: les microbes actifs, la croissance cryptique, compte viable directe [DVC], dormance progressive, repos végétatif, les cellules naines, les cellules moribondes, nonculturability, nonplateable, stase survie, la viabilité de la reproduction, viable mais non cultivable [VBNC], non-viable, mais resuscitable, vital, viviform, etc.) tel que cité dans 34 publications différentes correspondantes [1, 2, 4, 24-54] (cf. tableau 1). Alors que le tableau affiche les références de 1962 à 1998, le débat est plus âgé et était déjà pertinent au tournant du 19
e à la 20 e siècle [55-60]. Un exemple est le "Great Plate Count Anomaly" [61, 62] voir aussi [63]. Même à ce moment-là des colorations vitales ont été débattues pour être utilisé comme un essai pour surmonter les insuffisances des techniques de culture [64-68]. Il semble que la discussion passé [69] a été "revitalisé" au tournant de ce siècle [41, 70-78]. Est à noter que certains termes (par exemple, en sommeil, VBNC) sont encore pertinents lorsqu'on se réfère à des bactéries probiotiques [79, 80] .Tableau 1 Les termes utilisés pour décrire les «états de vie" de micro-organismes (à partir de [8])
Acclimatation [ ,,,0],30]
"cellules quiescentes" [17]
microbes actifs [20]
Réanimation [3, 4, 15, 24, 28-31]
Alive "aliveness" [15]
"Arrêtez les cellules", "état d'arrêt" [17]
"Anabiotic (dormance) état »[15]
Somnicells [8, 11, 30]
" Sacs d'enzymes "[4, 12]
Starvation [10, 17, 29]
croissance Cryptic [24, 26, 27, 29]
- "True famine" [15]
cultivable, cultivabilité [4 , 10, 11, 31]
"substrat mort accélérée", "substrat
- non cultivables, nonculturability [22, 24]
le stress accéléré" [6 , 15, 26, 29, 31, 33]
Affaiblissement [9]
Survival [5, 11, 20, 22, 29]
mort, mort [3, 4, 9, 11, 15, 16, 20, 26], [29]
- "survivabilité" [3]
- "Death la phase "[15, 29]
-" survie Stasis "[25]
" Die-off "[31]
viable [3, 10, 15, 16, 18, 30, 31]
nombre viable direct (DVC), méthode DVC [3, 4, 10, 15, 18, 29-31, 34]
- non viable [3, 15, 16, 20]
viabilité [3, 4, 6, 9, 12, 13, 15, 16], [19, 22, 23, 26, 29]
Dormant, dormance [11, 12, 15, 20, 23, 28-30, 32]
- «viabilité apparente» [6, 15]
- "dormance progressif" [1, 30]
- «viabilité de la reproduction» [23]
- "dormance Vegetative" [15]
- "True viabilité" [6]
cellules nains, nains inactifs, ultramicrobactérie [6, 14, 15, 29, 32]
"viable, mais non cultivables» ( VBNC) [3, 4, 8, 10, 12, 15, 16, 21], [22]
croissance arrestation [25]
- VBNC hypothèse [2-4 , 7]
"killer phénotype" [15]
- état VBNC [3, 4, 10, 22, 24, 29, 31, 33], [34]
Lysis [20]
- "viable mais nonrecoverable" [31] cellules
moribonds [29]
- "non -viable mais resuscitable "[16]
'Nonplateable" [24]
- "non cultivables mais viables" [28]
Protistes pâturage [ ,,,0],11]
Vital, vitalité [15, 16, 26]
"Pseudosenescent" [29]
Viviform [11, 30]
Références:
1Barcina et al. 1989 [24]
18Kogure et al. 1979 [40]
2Barer et al. 1993 [25]
19Korber et al. 1996 [41]
3Bogosian et al. 1996 [26]
20Mason et al. 1986 [1]
4Bogosian et al. 1998 [27]
21McKay 1992 [42]
5Bowden & amp; Hamilton 1998 [28]
22 Morgan et al. 1993 [43]
6Button et al. 1993 [29]
23Nebe-von Caron et al. 1998 [44]
7Colwell 1993 [30]
24 Nilsson et al. 1991 [45]
8 Colwell et al. 1985 [31]
25Nyström 1995 [46]
9 Dawe & amp; Penrose 1978 [32]
26 Postgate 1977 [47]
10 Duncan et al. 1994 [33]
27 Postgate & amp; Hunter 1962 [48]
11 Gonzáles et al. 1992 [34]
28 Rose et al. 1990 [49]
12Gribbon & amp; Barer 1995 [35]
29Roszak & amp; Colwell 1987a [2]
13Höfle 1983 [36]
30 Roszak & amp; Colwell 1987b [50]
14 Hood et al. 1987 [37]
31 Roszak et al. 1984 [51]
15Kaprelyants et al. 1993 [4]
32Stevenson 1978 [52]
16Kell et al. 1991 [38]
33 Whitesides & amp; Oliver de 1997 [53]
17Koch 1996 [39]
34 Wilson & amp; Lindow 1992 [54]
Malheureusement, plusieurs des termes trouvés et utilisés dans les publications sont incorrectes, trompeuses ou même paradoxal, en particulier le terme souvent utilisé "viable mais non cultivable (VBNC)", qui brouille la ligne entre la vitalité et la viabilité. Afin de minimiser la confusion autant que possible nous nous référons au Kaprelyants et al. [4]: "Plusieurs classifications des états physiologiques de micro-organismes ont été présentés. Nous avons déjà suggéré
[3] que tous les types de cellules considérées pourrait être réduite à trois groupes, comme suit: «viable» pour faire référence à une cellule qui peut former une colonie sur une plaque de gélose, «vital» pour désigner celui qui ne peut le faire après la réanimation et «non viable» pour faire référence à une cellule qui ne peut pas le faire dans toutes les conditions testées. Selon cette terminologie, les cellules dormantes sont vitales "
(voir le tableau 2) .Table 2" Glossaire des termes utilisés pour décrire les 3 principaux états physiologiques définis ici »(cité dans [3])
état Physiological
Phénotype
viable
Capable de division; formeront une colonie sur une plaque de gélose.
Vital ou dormant
Impossible de diviser ou pour former une colonie sur une plaque de gélose sans une phase de réanimation précédent .
non viable
Incapable de division; ne formera pas une colonie sur une plaque de gélose dans toutes les conditions testées.
Nous utilisons de la famine »des phrases ou des« cellules qui meurent de faim »de se référer aux conditions environnementales dans lesquelles les cellules sont incubées, plutôt que d'un état physiologique. Ainsi les cellules affamés (ou des cellules qui ont subi d'autres contraintes) peuvent ou non être en sommeil. Malgré l'utilisation historique de ces termes, «directe viable comptage» des phrases et misnomères «viables mais non cultivable 'sont, puisque ces cellules ne sont pas viables tels que définis ci-dessus.
Conformément à [4] nous définir "viable" strictement "capable de croître". A cet égard, tous les autres tests, par exemple des tests d'allongement (DVC; [50]) ou les procédés de coloration, ne sont que des procurations, puisque aucun type de coloration peut prouver la viabilité. Ainsi, le terme "tache de viabilité» est un terme impropre par définition
et ces taches doit être correctement nommé «taches vitales». Malheureusement, l'abus de langage est fréquemment utilisé par Invitrogen Ltd (BacLight ™), et est par conséquent - mais à tort - adopté par les utilisateurs de ces tests de vitalité
Le BacLight ™ kit de viabilité bactérienne (BacLight Assay, BLA)
. Selon le fabricant [81] BLA se compose de deux taches, l'iodure de propidium (PI) et Syto 9, qui à la fois des acides nucléiques tache. SYTO9 est une fluorescence verte membrane intercalant molécule perméable et colore toutes les cellules. En revanche, PI est une tache rouge intercalant et est imperméable à la membrane, et est donc exclue par les cellules "saines". Le fabricant décrit que PI a une plus forte affinité pour les acides nucléiques que SYTO 9; Ainsi, lorsque les deux taches sont présentes dans une cellule, le SYTO 9 sera déplacé à partir d'acides nucléiques et la cellule (s) va émettre une fluorescence rouge. Pour prouver les stocks de mécanisme [82] effectué des mesures physico-chimiques "sans cellules" avec le "Viabilité Teinté, Bac de lumière", et pourrait révéler que le principe de coloration est pas si simple. Cet auteur a établi un soi-disant transfert d'énergie de résonance de fluorescence (FRET), bien que, dans certaines conditions de coloration, SYTO 9 émission surpasse l'émission de PI. L'augmentation de la concentration SYTO 9 peut ainsi améliorer l'émission de PI, ce qui provoque une double coloration des cellules. Stocks [82] souligne à plusieurs reprises que, pour une interprétation des résultats de coloration "les concentrations relatives des PI, SYTO9 et l'ADN étaient d'une importance cruciale"
et "que les expériences de contrôle ou de validation appropriées (devrait être) effectué".
Double coloration et /ou FRET a également été documentée par d'autres auteurs [41, 83], qui ont examiné les paramètres de viabilité des cultures viables et de formaldéhyde tués ou UVA-traités, respectivement. La discussion suivante du manuel d'SONDES MOLÉCULAIRES doit être considérée dans ce contexte
Concernant la fiabilité du "kit de viabilité" utilisé dans la recherche de biofilm, nous aimerions citer directement la feuille (s) d'informations sur les produits de SONDES MOLÉCULAIRES 2001. Information sur le produit, LIVE /DEAD Kit BacLight ™ bactérienne Viabilité ®, Révisé: 26-Janvier-2001, ainsi que Révisé: 15-Juillet-2004 (par lequel ce dernier représente la version la plus récente en Octobre 2013) [81] :( I) «... les taches diffèrent à la fois par leurs caractéristiques spectrales et de leur capacité à pénétrer dans les cellules bactériennes saines. Lorsqu'il est utilisé seul, le SYTO 9 tache étiquettes généralement toutes les bactéries dans une population - ceux avec des membranes intactes et celles avec des membranes endommagées. A l'opposé de l'iodure de propidium ne pénètre que les bactéries ayant des membranes endommagées, entraînant une réduction de la tache SYTO 9 lorsque les deux colorants sont présents. Ainsi, avec un mélange approprié des Syto 9 et propidium iodure taches, des bactéries avec des membranes cellulaires intactes tache verte fluorescente, alors que les bactéries avec des membranes endommagées tache rouge fluorescent. "
(II)" Bactéries Coloration avec soit L7007 Kit ou L7012 - 4.1 Ajuster les suspensions de E. coli (en direct et tué) à 1 × 10
8
bactéries /ml ou les suspensions de S. aureus (vivre et tué) à 1 × 10
7
bactéries /ml. suspensions de S. aureus doivent généralement être 10 fois moins concentré que E. coli pour la microscopie de fluorescence. "
d'où le nombre de E. coli
et S . aureus
diffèrent par un logarithme.
(III) Enfin, en raison de (I) un mélange de 50% de vie et 50% des bactéries mortes, normalement, ne conduit pas à un 50/50 vert /fluorescence rouge . Et vice versa:
50% des bactéries vertes fluorescentes dans un échantillon ne signifie pas qu'il ya des cellules vitales 50%. Par conséquent, "ratios
fluorescence vert /rouge (doivent être) calculé pour chaque proportion de live /morts E. coli."
Ce dernier point a été confirmé par Hannig et al . [6] dans leur document sur la viabilité de S. mutans in vitro
. Ils ont déterminé qu'une "concentration initiale de bactéries viables dans le dosage"
de 50% conduit à différentes «émission de bactéries mortes rapport émissions /vitales" valeurs
d'environ 9,5, 6,5 ou 8,0 dans leurs échantillons NaCl-contrôle. En outre, Hannig et al. [6] indiquent que «la proportion de bactéries Avital augmenté comme indiqué par le rapport entre avital aux cellules vitales. Il se situait entre 0,1 ... et ... 29,0 ... Après rinçage avec de la chlorhexidine, le ratio est élevé à 190 (6 h) ou 10.2 (12 h) ... "
Prendre les informations de leur figure un compte, on ne sait pas ce que ces différents ratios effectivement peut signifier en termes de «vrais» des valeurs de vie.
en résumé, les points mentionnés ci-dessus trois décrites dans le show manuel de l'utilisateur BLA que, conformément aux stocks [82], un «mélange
approprié" des deux taches doit être déterminée et établie pour une seule espèce de bactéries avant de les utiliser dans une expérience. Cela peut être possible dans une vitro
situation, où le BLA peut aider à gagner du temps dans le long terme suivant, prudent, et pas de temps d'étalonnage consommant critiques pour chaque espèce bactérienne individuelle. Cependant, ceci est impossible à gérer dans les biofilms en raison de l'unicité de la matrice biofilm de la plaque dentaire, où, en réalité, il peut y avoir plus ou moins de 1000 espèces microbiennes différentes [84] se produisant naturellement. En outre, l'application de la tache SYTO 9 /PI est pas considéré comme convenable pour biofilms, en raison de phénomènes de diffusion en raison de exo-polymères qui en résultent "dans une sous-estimation des comptes viables"
[21].
Cependant, il semble être un inconvénient supplémentaire. Giertsen et al. [23] ont critiqué des écarts considérables entre attendre la vitalité de biofilm et le résultat de la méthode de coloration SYTO 9 /PI. De plus, ces auteurs ont décrit un comportement instable et un changement de la couleur de coloration du vert au rouge, à savoir
vers la surveillance plus de bactéries "mortes". Tout récemment, ces résultats ont été expliqués par Tawakoli et al. [7] postulant que les cellules marquées ont perdu leur viabilité peu après intercalation des colorants, écrit: «Cette hypothèse a été confirmée par l'analyse TEM dans l'étude actuelle (Figure deux). Les images ont montré une immense lyse et la destruction des cellules adhérentes ... ».
Le tableau 3 présente une pléthore d'études [5-7, 9, 16-20, 22, 23, 41, 71, 73], [ ,,,0],82, 83, 85-98] qui ont utilisé le BLA. Cependant, dans presque toutes les études, il a dû éclairci (a) si biofilms de plaque semblable ou, au moins, des échantillons de salive ont été évalués, ou si les enquêtes ont été faites avec des espèces bactériennes simples et /ou artificiels (monospécifique) biofilms; (B) si le régime de coloration des échantillons de biofilms a été ajusté selon le manuel BLA (validation); (C) facteur de dilution, qui a été utilisé entre le SYTO 9 et PI, grâce à une procédure de validation selon (b); (D) la manière dont la procédure d'incubation a été suivie, en particulier le temps d'incubation des échantillons bactériens ainsi que le mélange des taches; (E) si les résultats de l'ABL ont été comparés à d'autres paramètres, et si celui-ci était approprié (g) ou pas (f); (H) si la BLA résultats concordent avec les autres paramètres (que ce soit approprié ou non). Enfin et surtout nous étions intéressés (i) si les résultats BLA ont répondu aux attentes de l'information de fond users.Table 3 concernant l'utilisation du test BacLight® (BLA) pour l'évaluation de (dentaire) biofilm vitalité
études utilisant la BLA (n = 30)
[5-7, 9, 16-20, 22, 23, 41, 71, 73], [82] * [83, 85-98]
(a) Étiez biofilms plaque-comme évalué
No:? [5, 16-18, 22, 23, 41, 82, 83, 86], [87, 93, 96-98]
Oui: [6, 7, 9, 19, 20, 71, 73, 85], [88-92, 94, 95]
(b) validation
No: [5, 7, 9, 16-18, 20, 22, 23, 41], [71, 73, 82, 85-91, 94-98]
Oui: [6, 19 ?, 83, 92, 93?]
facteur (c) dilution
Non déclaré: [16, 18, 23, 73, 86, 94, 95, 98]
1: 1 [6, 7, 9, 17, 20, 22, 41, 71], [85, 87-92, 96, 97]
2: 1 [93]
4: 1 [5]
6: 4 [19]
1: 6 [83]
(d) la procédure d'incubation
Non déclaré: [16, 18, 71, 86, 95, 96]
10 min, RT [6, 7, 20]
15 min, RT [5, 9, 17, 19, 22, 23, 41, 73], [85, 87 -91, 97, 98]
20 min, RT [83, 92]
& gt; 20 min, 2 ° C [93]
30 min [94]
(e) Comparaison
No: [16-18, 20, 22, 71, 82, 83, 85, 88], [90, 91, 94, 95]
Oui: [5-7, 9, 19, 23, 41, 73, 86, 87], [89, 92, 93, 96-98 ]
(f) ... avec des méthodes inappropriées
[6, 7, 9, 19, 23, 41, 73, 86], [87, 89, 92, 93, 96-98]
(g) ... avec des méthodes appropriées
[5] *
(h) Est-ce que la BLA résulte en forme à l'autre paramètres
No:? [7, 19, 86, 89, 92, 93] (DAPI), [96, 97]
Oui: [5, 23, 41, 93] (FDA), [98]
(i) Est-ce que les résultats BLA répondent aux attentes de l'utilisateur (s)
No:? [23, 83, 86]
Oui: [5, 7, 16, 18-20, 22, 41, 71, 82], [85, 87-98]
(a) (i) voir la description dans le texte
Non déclaré:. Soit aucune information n'a été donnée par les auteurs ou les auteurs a déclaré que la coloration a été réalisée "conformément aux instructions du fabricant", ce qui signifie généralement un facteur de dilution de 1 : 1 et un temps d'incubation de 15 minutes
* [5]:. Decker a enregistré les comptes bactériens totaux (comme log BC /ml) et la CFU (comme log UFC /ml), cependant donné aucune donnée concernant le PE .
* [82]:. mesures physico-chimiques "sans cellules" pour élucider le mécanisme de la procédure de coloration BacLight
sur les 30 enquêtes énumérées dans le tableau 3 de la moitié (15) a été classés dans la rubrique "plaque- comme biofilm ". Cette partie haute est due au fait que nous nous sommes efforcés de considérer la littérature concernant les biofilms buccaux. salive naturelle a également été inclus par exemple
[89-91] ainsi que des «plaques microcosme», qui ont été cultivées dans une bouche artificielle et /ou ont été mis en place par exemple de la salive [20, 71, 92] ou à partir d'une plaque sous-gingivale échantillon [96]. D'autres études ont porté sur des grands fonds bactéries des sédiments ou des échantillons d'eaux usées [73, 93], qui ont été considérées par nous comme des systèmes plurispécifiques naturels.
Il est étonnant, mais attend, que seulement cinq études ont été basées sur une procédure de validation précédente (ligne (b) dans le tableau 3) [6, 19, 83, 92, 93], dont deux cas étaient encore discutable [19, 93]. Néanmoins, un étalonnage pourrait y être supposé. La description de Filoche et al. [92] précise la méthodologie laborieuse (cf. leurs Matériaux & amp; section Méthodes, paragraphes 2.5 Génération de la norme de viabilité; 2.6 Préparation de la norme de viabilité de la plaque individuelle, 2.7 Préparation de la norme de viabilité groupée; 2.8 protocole Coloration pour Live /Dead® BacLight ™ et 2,9 fluorescence mesure et analyse des données). Étonnamment, la procédure d'étalonnage de ces auteurs [92], même semblé fonctionner lorsque les échantillons et les contrôles ont été fixés dans 4% de paraformaldehyde, et /ou ont été stockés pendant trois mois.
En conséquence de ne pas avoir la validation des utilisateurs maximum compter dans les conseils du fabricant concernant le facteur de dilution entre les deux taches Syto 9 et PI. Seulement quatre groupes de recherche n'a pas suivi la recommandation dilution 1: 1. Fait intéressant, les facteurs couvrent une plage de 1: 6 à 4: 1 (ligne (c) dans le tableau 3). Cela reflète généralement la nature séduisante de la procédure de coloration [13] et les demandes des chercheurs ont vers une application facile et rapide. La préoccupation des stocks [82] que les concentrations relatives des PI, SYTO9 et les acides nucléiques sont d'une importance cruciale est le plus souvent négligé par les utilisateurs.
À première vue, la même chose vaut pour la procédure d'incubation (de ligne (d) Le tableau 3), cependant, cela peut être un problème plus grave. Vingt-deux des utilisateurs ne précisait pas la procédure ou invoqué les instructions du fabricant. D'autres ont réduit la 15 minutes d'incubation recommandée à 10 minutes [6, 7, 20], tandis que d'autres ont prolongé la durée d'incubation entre les taches Baclight et leurs échantillons à 20 ou 30 minutes [83, 92-94]. Cependant, le constat de Tawakoli et al. [7] que les cellules colorées sous enquête ont changé ou ont même perdu leur viabilité peu après intercalation des colorants suggère que le temps "simple" d'incubation est un facteur crucial et potentiellement destructrice. Il est à la question de savoir si un temps de 10, 20 ou 30 minutes ( "dans le noir", mais à la température ambiante, et une seule fois à 2 ° C [93]), peut exercer un effet néfaste sur le résultat de la procédure de coloration. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.
