Résumé de l'arrière-plan
soins bucco-dentaire est importante pour la santé bucco-dentaire et systémique, en particulier pour les personnes âgées vivant en institution et les patients immunodéprimés. Toutefois, le contrôle mécanique classique de la plaque est souvent difficile pour ces patients en raison de la douleur ou le risque d'aspiration. Bien que la thérapie photodynamique antimicrobienne (aPDT), qui est considéré comme une alternative ou complément aux approches mécaniques, a une application potentielle comme une méthode moins stressant de contrôle quotidien de la plaque, aucune application clinique de cette technique a été rapporté.
Méthodes
Nous ont étudié l'effet inhibiteur d'une combinaison de O bleu toluidine (TBO), et une émission de lumière rouge diode (LED) sur la formation de la plaque dentaire chez des volontaires sains. La concentration optimale de TBO a été déterminée in vitro préliminaires
expériences pour évaluer l'effet bactéricide de aPDT sur Streptococcus oralis
et de clarifier sa sécurité dans des cellules de fibroblastes. Pour étudier le mécanisme de TBO médiée aPDT, la qualité et la quantité des espèces réactives de l'oxygène (ROS) générés au cours aPDT ont été examinés aussi en utilisant la résonance de spin électronique (ESR) spectroscopie. Par la suite, l'effet inhibiteur de aPDT sur la formation de la plaque dentaire a été étudiée chez onze sujets comme une étude clinique pilote. Les prémolaires mandibulaires droite ou à gauche ont été assignés au hasard au traitement (avec aPDT) ou le contrôle (sans APDT) groupes. Au total, on a appliqué aPDT six fois (deux fois par jour) pour les dents dans le groupe d'essai sur une période de quatre jours. Le quatrième jour, l'étude a conclu et les analyses ont été effectuées.
Résultats
Une combinaison de 500 ou 1000 pg /ml TBO et l'irradiation LED pendant 20 s a diminué de manière significative le nombre de unités formant colonie de Streptococcus oralis
. La cytotoxicité de aPDT était comparable à celle des antiseptiques classiques utilisés dans la cavité buccale. Les radicaux hydroxyles ont été détectés par l'analyse ESR, mais l'oxygène singulet était pas. Un essai contrôlé randomisé démontré que aPDT avec 1000 ug /ml TBO et l'irradiation LED rouge supprimée de manière significative la formation de la plaque dentaire sans nuire à dents ou les tissus environnants.
Conclusions
aPDT a le potentiel d'être une nouvelle modalité technique prometteuse pour les soins dentaires l'enregistrement d'essai de contrôle de la plaque.
Cet essai a été enregistré avec le Réseau d'information médicale hôpital universitaire registre des essais cliniques (nombre UMIN000012504).
Mots-clés
antimicrobienne thérapie photodynamique lumière rouge diode toluidine bleu contrôle de la plaque dentaire O hydroxyles radical essai randomisé électronique matériel supplémentaire contrôlé
La version en ligne de cet article (doi:. 10 1186 /1472-6831-14-152) contient du matériel supplémentaire, qui est disponible pour les utilisateurs autorisés
Contexte
thérapie photodynamique antimicrobiens (aPDT) est une procédure dans laquelle l'activation dépendant de l'oxygène d'un photosensibilisateur par la lumière (principalement des lasers) conduit à la génération d'espèces réactives de l'oxygène cytotoxiques (ROS). Récemment, cette procédure a été introduite dans le domaine médical [1, 2] et dentaires [3-6] champs. En plus de la confirmation de son potentiel antimicrobienne in vitro
[7, 8], les études cliniques antérieures ont évalué l'application de aPDT pour le traitement de l'acné vulgaire en dermatologie [9] et de périodontique [10, 11], endodontique [12 , 13], et péri-implantaire [14] maladie en dentisterie. En outre, étant donné qu'il utilise des composés de lumière générée, aPDT peut être en mesure d'éradiquer les bactéries multirésistantes sans influencer l'émergence d'une résistance accrue dans les bactéries [15].
Accroître la preuve existe que les soins bucco-dentaire est essentielle pour la santé systémique, en particulier dans les patients immunodéprimés. Auparavant, Yoneyama et al
. a rapporté que la bonne hygiène bucco-dentaire réduit le risque de pneumonie et le taux de mortalité chez les personnes âgées vivant en institution [16, 17]. Abe et al
. a également suggéré que l'hygiène buccale était efficace dans la prévention de la grippe [18]. Le US National Institutes of Health (NIH) a recommandé que «tous les patients atteints de cancer devraient avoir un examen oral avant le début de la thérapie du cancer et le traitement de l'préexistante ou d'une maladie orale concomitante est essentiel pour minimiser les complications buccales chez tous les patients atteints de cancer» [19 ]. des outils mécaniques conventionnellement tels qu'une brosse à dents, la soie dentaire ou brosse éponge accomplir l'élimination de la plaque bactérienne dentaire. Toutefois, le contrôle mécanique de la plaque est techniquement exigeante, et peut être physiquement stressant pour les sujets avec une diminution de l'amplitude des mouvements de bras, ou une condition médicale qui les empêche de maintenir une bonne hygiène bucco-dentaire. Par conséquent, l'application d'un moyen non-mécaniques pour commander la formation de la plaque dentaire pourrait présenter un intérêt large.
En 1993, Wilson et al
. [20] ont proposé aPDT comme une alternative à des moyens mécaniques de produits pharmaceutiques et d'éliminer la plaque bactérienne dentaire. Cependant, il n'y a pas de rapports cliniques sur l'utilisation de aPDT comme une méthode de soins bucco-dentaires pour le contrôle préventif de la formation de la plaque dentaire. Si aPDT pourrait être utilisé comme une nouvelle méthode pour contrôler la formation de la plaque dentaire, les patients peuvent être en mesure de recevoir des soins bucco-dentaires efficace sans les contraintes désagréables qui accompagnent le nettoyage mécanique classique des dents, comme des saignements ou des douleurs.
Par conséquent, nous avons cherché à enquêter sur les effets inhibiteurs de aPDT dans la cavité buccale des volontaires en bonne santé comme une étude pilote, avant l'essai clinique portant sur des patients réels. Nous nous sommes concentrés sur O bleu toluidine (TBO), qui est un photosensibilisant classique de sel de phénothiazinium, parce que ses effets bactéricides ont déjà été clarifiées dans les précédentes in vitro
études dans [8, 21-23], ainsi que dans le traitement de la parodontite [4]. En outre, les effets bactéricides de TBO médiée aPDT utilisant diode haute puissance rouge émettant de la lumière (LED) sur deux bactéries typiques parodontopathiques, Porphyromonas gingivalis
et Actinobacillus actinomycetemcomitans
, ont également été démontrée in vitro
[ ,,,0],3].
Avant l'étude pilote chez des volontaires sains, les effets antimicrobiens de aPDT sur oralis Streptococcus (S. de oralis),
un des typiques bactérie anaérobie facultative dans la plaque dentaire humaine, et l'effet cytotoxique de aPDT sur fibroblastes, ont été examinés in vitro
. En outre, la caractérisation des ROS généré pendant le traitement aPDT a été étudiée par la résonance de spin électronique (ESR)
Méthodes
Expérience 1:. Dans l'évaluation des effets bactéricides de aPDT vitro
sur Streptococcus oralis
Préparation de la suspension bactérienne planctonique
S. oralis
OMZ 607 a été maintenue sur des plaques de gélose au sang (E-MP23; Eiken Chemical Co. Ltd., Tochigi, Japon) à 37 ° C dans des conditions aérobies. Une anse de chaque souche a été inoculé dans 9 ml d'infusion de cerveau-coeur (BHI), et mises en culture dans des conditions anaérobies à 37 ° C pendant 16 h. Après cela, 500 ul de la suspension de cellules bactériennes ont été transférés dans 5 ml de bouillon BHI frais, et en outre mises en incubation en anaérobiose à 37 ° C pendant environ 5 heures. Enfin, une suspension bactérienne de 10 8 cellules /ml a été préparée en utilisant une chambre de comptage, et stockés sur de la glace jusqu'à utilisation.
Photosensibilisateur et source de lumière bleue
O Toluidine (TBO) poudre (absorption maximale = 626 nm, Sigma, St. Louis, MO) a été dissous à des concentrations de 100, 500 et 1000 pg /ml dans une solution saline stérile. dispositif (éléments actifs = AlInGaP, longueur d'onde = 600-700 nm, longueur d'onde maximale = 660 nm, densité de puissance = 1.1 LED rouge prototype haute puissance W /cm 2, la taille du spot = 9 mm à l'extrémité de l'appareil; modifié de PenCure ™ avec une bande de 660 nm profonde LED rouge [LZ1-00R205; LedEngin, Inc., Santa Clara, CA]. par J Morita Mfg Kyoto, Japon) a été utilisé comme source de lumière. La durée d'irradiation de LED a été fixé à 20 s, selon les résultats de notre précédente étude in vitro
dans [3], qui a démontré l'élimination bactérienne efficace en utilisant la procédure aPDT TBO médiation avec l'irradiation 20 de.
Photosensibilisation Lethal
une aliquote de 30 ul de suspension bactérienne a été mélangée avec une solution saline ou un volume égal de solution TBO aux différentes concentrations (100, 500, et 1000 pg /ml) dans les puits d'une plaque à 96 puits à fond plat stériles (Falcon®, Becton Dickinson Co., NJ). Les concentrations finales de TPT dans la solution mélangée était de 50, 250 et 500 pg /ml, respectivement. Après incubation à température ambiante pendant 20 s, l'irradiation a été effectuée pendant LED 20 s. L'extrémité d'émission de lumière (diamètre = 8 mm) de la DEL est positionné en correspondance avec l'ouverture du puits (diamètre = 7 mm) pendant l'irradiation. La distance entre la surface supérieure de la suspension bactérienne mixte et l'extrémité d'émission de lumière est de 7 mm et la profondeur de la solution mélangée était de 3 mm. La puissance réelle à la surface de la suspension bactérienne était de 310 mW, et la densité de puissance a été calculée à 0,94 W /cm 2 (énergie totale de 6,2 J pour 20 s irradiation). Chaque suspension bactérienne a été exposée individuellement à une irradiation LED après la préparation de la suspension dans chaque puits. Un total de 7 groupes expérimentaux et un groupe témoin non traité ont été préparés pour chacun d'eux bien (exposition à 100, irradiation 500, 1000 pg /ml TBO seulement, combinaison de TBO et 20 s LED, et 20 s irradiation seule LED).
Après le traitement, une aliquote de 10 ul de chaque puits a été dilué en série 10 2-10 5 fois avec une solution saline, et 10 pl d'échantillons dilués ont été étalées en triple exemplaire sur des plaques de gélose au sang. Toutes les procédures, y compris la préparation de la solution, l'irradiation, et des échantillons de placage ont été réalisées pour chaque puits individuel (à savoir un par un). Les plaques à 96 puits ont été incubées en aérobiose à 37 ° C pendant 48 h, et le nombre d'unités formant des colonies (CFU), ont été déterminées. L'expérience a été répétée cinq fois de façon indépendante
Expérience 2:. Effet cytotoxique sur les fibroblastes aPDT
souris de lignée de cellules de fibroblastes de culture cellulaire L929 (Riken, Saitama, Japon) a été cultivé dans 75 cm 3 tissus des flacons de culture dans 20 ml du milieu RPMI 1640 (Nacalai Tesque, Kyoto, Japon) contenant 100 U /ml de pénicilline, 100 U /ml de streptomycine, et complété avec 2,5 mmol /l de L-glutamine et 5% de sérum de veau foetal inactivé par la chaleur (Gibco ®)
traitement cellulaire
1 × 10 4 cellules ont été ensemencées dans chaque puits de plaques de 96 puits noires d'essai (de fond transparent plat;. COSTAR, Corning, NY), et incubées à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO 2 pendant 48 heures jusqu'à ce que la monocouche cellulaire est devenue confluente.
pour les groupes expérimentaux, après élimination du milieu, TBO 100 ul (100, 500 ou 1000 ug /ml) on a ajouté à chaque puits. Les cellules ont été incubées pendant 20 s, et la solution a ensuite aspiré TPT de tous les puits. Après que les cellules ont été lavées deux fois avec 100 ul de PBS, moyenne de 100 ul a été ajouté au puits, et immédiatement la cellule a été exposée à la lumière à LED de la partie supérieure de la plaque à 0,94 W /cm 2 à 20 s ( énergie totale = 6,2 J). Les témoins étaient soit non traitées ou traitées avec TPT (100, 500, et 1000 pg /ml) seul, et on a lavé deux fois avec du PBS. Le plus le groupe de cellules traitées avec 1000 pg /ml TBO et la DEL est comparée à une groupe de cellules traitées avec 2,5-3% H 2O 2 (Oxydol; Yoshida Pharmaceutical Co. Ltd., Saitama, Japon), ou 0,025% de chlorure de benzalkonium (OSVAN®; Nihon Pharmaceutical Co. Ltd., Tokyo , Japon), qui sont les antiseptiques standard pour la muqueuse buccale. Les cellules ont été exposées à H 2 O 2 et du chlorure de benzalkonium à 20 s, et lavées deux fois avec du PBS. Toutes les expériences ont été réalisées en triple et répétées cinq fois.
Test de cytotoxicité
un dosage colorimétrique contenant le composé de tétrazolium le 3- (4,5-diméthylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxyméthoxyphényl) -2- (4-sulfophényl) -2H-tétrazolium, sel interne; MTS (CellTiter 96® aqueuse Cell One Solution Essai de prolifération; Promega, WI), a été utilisé pour déterminer la viabilité cellulaire [21]. A propos aliquotes de 100 ul de milieu de croissance et 20 ul de réactif MTS sont ajoutés à chaque puits. Après incubation pendant 2 h à 37 ° C dans un 5% de CO 2 incubateur, l'absorbance de chaque puits a été mesurée à 490 nm en utilisant un lecteur de microplaques, et la viabilité des cellules a été calculée
Expérience 3:. Analyse de ROS générée lors de la spectroscopie ESR de aPDT a été utilisée pour l'évaluation qualitative et quantitative des ERO générée lors aPDT. Les réactifs de spin trap 2,2,6,6-tétraméthyl-4-pipéridinol (4-OH-TEMP; 98% de pureté, Sigma) et 5,5-diméthyl-1-pyrroline-N-oxyde
(DMPO ; dojin Chemicals, Kumamoto, Japon) ont été utilisés pour l'oxygène singlet et de détection radical hydroxyle, respectivement. Un mélange de 800 ul de PBS, 100 ul 1000 pg /ml TBO et 100 ul de 4-OH-TEMP a été utilisé pour la mesure de l'oxygène singulet. Un mélange de 400 ul de PBS, 50 mM DMPO 50 ul et 50 ul de 1000 pg /ml TBO a été utilisé pour mesurer les radicaux hydroxyle. Les mesures ont été obtenues après le transfert des mélanges dans une cuvette plate de quartz et l'exposition à la lumière LED rouge pour 20 s. La mesure a été réalisée en utilisant ESR (JES-RE 3X, JEOL, Tokyo, Japon) relié à un analyseur WIN-RAD ESR données (Radical Research, Tokyo, Japon) avec les réglages d'instruments suivants: micro-ondes puissance = 8 mW, le champ magnétique = 335,8 mT, de modulation de largeur = 0,079 mT, le temps de balayage = 1 min, et constante de temps = 0,03 s. Toutes les expériences ont été réalisées en triple à la température ambiante
Expérience 4:. Effet de l'inhibition de la aPDT sur la formation de la plaque dentaire
Un essai randomisée en simple aveugle clinique ouverte avec la conception split-bouche (chaque sujet a reçu test et de contrôle des traitements, chaque à un côté séparé de la bouche) a été réalisée pour étudier l'effet inhibiteur de aPDT sur la formation de la plaque dentaire (figure 1). La figure 1 Consort organigramme de l'essai clinique de l'efficacité de aPDT pour l'inhibition de la plaque dentaire.
sujets: Cet essai clinique a été approuvé par le comité d'éthique de la Faculté de médecine dentaire, Tokyo Université médicale et dentaire (TMDU) (n ° 836), et a été réalisée conformément à la Déclaration d'Helsinki. Cet essai a été enregistré avec le Réseau d'information médicale hôpital universitaire registre des essais cliniques (nombre UMIN000012504) et a été réalisée en suivant les lignes directrices CONSORT pour les essais cliniques fichiers supplémentaires 1. Le recrutement des sujets et des expériences ont été menées à partir de Janvier 2013 à Février 2013 au Département de parodontie , Dental Hospital de TMDU.
Onze dentistes bénévoles ont été recrutés pour cette étude, et le consentement éclairé a été obtenu à partir de tous les participants. Les sujets inclus sept hommes et quatre femmes, âgés de 26-33 ans (moyenne = 28,0 ± 2,3 ans). Les critères d'inclusion pour objet l'inscription inclus une bonne santé générale, aucun apport antimicrobien au cours des trois derniers mois, la présence d'au moins 20 dents, l'éruption normale de tous les prémolaires mandibulaires, l'absence de gonflement ou une rougeur de la gencive, et l'absence de sites avec la profondeur de sondage ≥ 4 mm
. calcul de la taille de l'échantillon
La taille de l'échantillon a été calculée en utilisant une puissance statistique de 80%, taux d'erreurs de 5%, et une différence supposée de 10% et SD de 10% avec les valeurs de la zone de dépôt de plaque. Sur la base de ces données, le nombre de sujets requis pour mener cette étude a été calculé comme 10. Toutefois, compte tenu de la possibilité d'avoir un sujet d'abandon, l'inscription de 11 participants a été prévu.
La aPDT procédure
les première et seconde prémolaire sur les côtés gauche et droit de la mandibule ont été évalués. La sélection des dents a été basée sur l'emplacement et l'aptitude à l'irradiation LED, photographie, et la collecte des échantillons, ainsi que la plaque d'accumulation étant donné les conditions d'étude. L'essai clinique a été réalisé sur quatre jours, commençant et se terminant dans la soirée (Figure 1). Le premier jour, la plaque dentaire déposée sur les surfaces vestibulaire et linguale des prémolaires mandibulaires des deux côtés ont été teints en rouge avec une solution plaque de divulgation (ProSpec®; GC, Tokyo, Japon). La plaque supra- et sous-gingival a ensuite été soigneusement éliminé par nettoyage professionnel des dents (PTC) en utilisant un grattoir à ultrasons, ainsi qu'une coupelle en caoutchouc et une brosse en forme de cône monté sur une pièce à main micromoteur.
Par la suite, le droit ou prémolaires côté gauche ont été répartis au hasard pour le traitement (par aPDT) ou en tant que témoins non traités (sans aPDT) en utilisant la méthode de l'enveloppe, dans lequel les participants sélectionnés au hasard une enveloppe opaque contenant une note allocation du côté de traitement (droite ou gauche). TBO (1 mg /ml) a été doucement appliquée sur les surfaces buccales et linguales des dents du groupe de test à l'aide d'une petite boulette de coton. Après 10 s, TBO a été emporté par le rinçage de la bouche. Après le lavage, la DEL est focalisée à un angle de 90 ° sur chaque surface buccale et linguale de chaque dent pendant 20 secondes, ce qui entraîne une durée totale d'irradiation de 80 s sur les quatre faces de deux prémolaires de chaque séance de traitement (figure 2). Au total, aPDT a été appliquée six fois (deux fois par jour, une fois le matin et une fois le soir) aux dents de groupe de test pendant quatre jours. Au cours de la période d'essai, les participants ont été autorisés à se brosser les prémolaires et les dents adjacentes, et d'utiliser un rince-bouche. Le quatrième jour, l'étude a conclu et les analyses ont été réalisées. Figure 2 photographies montrant la procédure clinique aPDT. (A) avant aPDT. (B) Après le retrait initial de la plaque dentaire (avant la première procédure aPDT). (C) Au cours de l'application de TBO. (D) Après l'application de TBO et bouche-rinçage. (E) Au cours de l'irradiation LED. (F) Après irradiation LED.
Détermination de la zone de dépôt de plaque dentaire
Une fois que les surfaces des dents ont été colorées avec une solution de plaque-divulgation, la voie buccale et linguale des premiers et deuxièmes prémolaires dans le traitement et le contrôle les groupes ont été photographiées à un angle de 90 ° par rapport à la surface de la dent. Les photographies linguales ont été prises avec un miroir conçu spécialement pour mandibulaire lingual photographie (Photographic Mirror ST pour linguale 13262, YDM Corp., Tokyo, Japon). La zone de couleur rouge teinté de dépôt de plaque dentaire, ainsi que la zone de la totalité de la surface de la dent sur les vestibulaire et linguale côtés, a été déterminée sur les photographies à l'aide d'un logiciel (Photoshop CS5 Extended, Adobe Systems Inc., CA). Afin de réduire la variabilité inter, la détermination des zones est réalisée de manière indépendante pour chaque site par deux examinateurs en aveugle aux groupes expérimentaux (A. A. et Y. T.) et la moyenne des deux mesures a été utilisée comme valeur de zone représentative de chaque site. Le pourcentage de la zone de dépôt de la plaque dentaire par rapport à la surface de la dent totale a été calculée.
Détermination du nombre de bactéries dans la plaque dentaire collectées à partir de la surface linguale des deuxièmes prémolaires
La surface linguale des deuxièmes prémolaires a été choisi comme représentant le site de collecte de la plaque, car la surface linguale a généralement l'accumulation de plaque plus constante que la surface buccale, la seconde prémolaire présente une surface linguale plus grande que la première prémolaire. des échantillons de plaque supragingival ont été recueillies avec une curette Gracey de la surface linguale de la deuxième prémolaire avant le traitement (ligne de base), et 4 jours après l'achèvement de l'essai clinique par des examinateurs en aveugle (A. A. ou Y. T). Le nombre de bactéries a été mesurée en utilisant un compteur bactérien disponible au niveau du côté de la chaise (appareil de détection de bactéries buccales rapide, Panasonic Healthcare, Tokyo, Japon) qui a été adapté pour compter rapidement un grand nombre de bactéries. Le dispositif de comptage utilisé la méthode de mesure d'impédance diélectrophorétique, qui a été rapporté pour montrer une bonne corrélation avec la méthode classique de culture [24].
Analyse statistique
données à partir de la première expérience ont été évaluées en utilisant une analyse de variance (ANOVA) , suivie d'un test de Dunnett. L'influence de TBO et l'irradiation LED sur les fibroblastes ont été analysés à l'aide de deux voies ANOVA factorielle, suivie d'un test de Tukey. La comparaison de l'application combinée de 1000 ug /ml TBO et l'irradiation LED avec les deux antiseptiques connus a été réalisée avec ANOVA, tandis que la quantité de ROS générée pendant aPDT a été analysé à l'aide d'un t
-test. Les données de la quatrième expérience ont été analysées en utilisant un t apparié
-test. Toutes les analyses ont été effectuées en utilisant le logiciel de statistique JMP 8.0 (SAS Institute, Cary, NC), à l'exception des deux voies ANOVA factoriel, qui a été réalisée par SPSS 18.0 (SPSS, IBM, Tokyo, Japon). A P
& lt; 0,05 a été considérée comme statistiquement significative pour toutes les analyses
Experiment 1 de Résultats:. Bactéricide l'effet de aPDT sur S. oralis in vitro
Dans les groupes traités avec soit LED ou TBO seul, le nombre de CFU ne diffèrent pas de ceux des témoins non traités. A l'inverse, les groupes qui ont reçu TBO + LED présentaient nombre de CFU significativement inférieurs à 500 et 1000 pg /ml (P
& lt; 0,01 et P
& lt; 0,05, respectivement), par rapport au témoin. Le nombre le plus bas de CFU a été observée dans le groupe traité avec 500 ug /ml TBO + LED (réduction de 1,42 log, 96,2% Taux de tuer, Figure 3). Figure 3 Dans les effets de réduction bactérienne in vitro de aPDT avec TBO et LED sur S. oralis. Les barres bleues montrent l'effet de TBO seulement, et les barres rouges présentent l'effet de TBO avec irradiation LED. Les données représentent la moyenne ± écart-type (n = 5)
Expérience 2:. Effet cytotoxique sur les fibroblastes aPDT
TBO seul a provoqué une diminution dose-dépendante de la viabilité cellulaire. Deux voies factorielle ANOVA a révélé que LED, TBO et TBO + LED significativement réduit la viabilité cellulaire (P
& lt; 0,01). En outre, l'application de la LED à toutes les concentrations de TPT a amélioré la réduction de la viabilité des cellules (figure 4A). Toutefois, la viabilité des cellules traitées avec 1000 pg /ml TBO et l'irradiation LED n'a pas été significativement différente de la viabilité des cellules traitées avec 2,5 à 3% de H 2 O 2 ou 0,025% de chlorure de benzalkonium (figure 4B). Figure 4 Les effets cytotoxiques de aPDT sur les fibroblastes. (A) L'effet de la concentration TPT sur la viabilité cellulaire. (B) Comparaison de la viabilité cellulaire entre aPDT et antiseptiques classiques. Les données représentent moyenne ± écart type (n = 5)
Expérience 3:. Analyse de ROS généré pendant aPDT
Aucune différence significative n'a existé dans la production d'oxygène singlet entre le PBS + LED et le TBO + groupes LED (Figure 5A). Toutefois, comparativement au témoin, la production de radicaux hydroxyle était significativement plus élevée dans le groupe TBO + LED (P
& lt; 0,01, la figure 5B). Le DMPO-OH de spin produit d'addition spécifique, ce qui prouve la production de radicaux hydroxyle, a été observée dans le groupe TBO + LED (figure 6). Figure 5 ROS détecté lors de la procédure aPDT TBO-médiée. (A) Singlet oxygène. (B) un radical hydroxyle.
Figure 6 spectre ESR typique pendant TBO médiée procédure aPDT.
Expérience 4: Effet d'inhibition sur la formation de aPDT plaque dentaire
Aucune complication systémique ou locale n'a été observé après l'application aPDT au cours de la période expérimentale. La coloration bleue résiduelle sur la gencive après l'application TBO était pas visible macroscopiquement, et n'a été noté immédiatement après l'application. La coloration était à la fois minime et temporaire, et n'a pas causé de problèmes esthétiques pour les sujets.
La formation de la plaque sur les dents du groupe aPDT était évidemment inhibée après quatre jours de aPDT, qui est apparu dans les photographies intrabuccales représentatives (figure 7). Les pourcentages de zones de dépôt de la plaque à buccale totale (Figure 8A) et les surfaces des dents linguales (figure 8B) ont été réduits de manière significative dans le groupe aPDT (buccal = 14 ± 9,1% et linguale = 12 ± 5,4%, moyenne ± écart type, respectivement), par rapport au groupe témoin (buccal = 25 ± 13% et linguale = 21 ± 7,0%, respectivement; P
& lt; 0,01). Figure 7 Résultats d'un essai clinique de l'efficacité des aPDT pour l'inhibition de la plaque dentaire. Photographies de prémolaires mandibulaires de sujet n ° 6 après aPDT. Buccal (A) ou lingual (C) surface des dents du groupe APDT et buccale (B) ou lingual (D), la surface des dents de contrôle.
Figure 8 Le rapport de la surface de la plaque déposée à la surface totale de la voie buccale ( A) et linguale (B) dent surface prémolaires mandibulaires.
Aucune différence significative n'a été détectée au niveau de référence entre le groupe aPDT (6,17 ± 0,38 log) et le groupe témoin (6,29 ± 0,39 log; P
= 0,49) dans le nombre total de bactéries dans la plaque dentaire recueillies depuis la la surface linguale de la deuxième prémolaire. Cependant, le nombre total de bactéries dans la plaque dentaire était significativement plus faible 4 jours après l'essai clinique dans le groupe aPDT (6,17 ± 0,49 log) par rapport au groupe témoin (6,68 ± 0,48 log; P
& lt; 0,01; Figure 9). Figure 9 Le nombre de bactéries dans la plaque dentaire ont été recueillies à partir de la deuxième prémolaire.
Discussion
À notre connaissance, ceci est le premier essai clinique visant à démontrer l'efficacité de aPDT pour inhiber la formation de la plaque dentaire sur les dents sans induire d'effets nocifs pour accueillir les tissus. En outre, cette étude a confirmé que TBO avec LED rouge réduit efficacement les bactéries S. Oralis,
qui est connu comme un colonisateur initial dans la formation de la plaque dentaire, et est souvent détectée dans le sang des patients qui souffrent de l'endocardite infectieuse [25, 26]. L'utilisation de TBO avec un dispositif LED haute puissance et un 20 de temps d'irradiation, conduit à une réduction dose-dépendante significative de la CFU in vitro
. Cependant, la diminution était moins lorsque 1000 pg /ml TPT (concentration finale de 500 pg /ml) a été utilisée que lorsque 500 pg /ml (concentration finale de 250 pg /ml) a été appliquée. Une explication possible est le fait que la solution bactérienne de couleur bleue 1000 ug /ml TBO mixte était trop sombre pour la lumière rouge de pénétrer à travers la solution au fond de la plaque de 96 puits, et donc la sensibilisation des TBO par irradiation LED était potentiellement bloqué. Néanmoins, 1000 pg /ml TBO a été utilisé parce que dans des situations cliniques, la dilution immédiate de TBO avec de la salive et de sa propagation superficielle sur la surface de la dent pourrait conduire à la sensibilisation lumière plus efficace de TBO que témoin in vitro
. Dans la présente étude, l'accent a été mis uniquement sur S. oralis
; Cependant, la formation de biofilm dentaire se compose de différents colonisateurs primaires et les interactions inter-microbiennes complexes. Par conséquent, plusieurs autres bactéries formant des plages, y compris Actinomyces viscosus
et Streptococcus sanguis
devraient être étudiées dans les études futures.
En ce qui concerne la sécurité de la procédure, TBO seul influencé négativement la viabilité des fibroblastes dans une concentration- manière dépendante, et l'application de LED amélioré l'affect. Toutefois, la réduction in vitro
la viabilité cellulaire dans les conditions actuelles APDT (1000 pg /ml avec 20 TBO s irradiation LED) ne dépasse pas celle observée avec d'autres antiseptiques, qui indiquent que la cytotoxicité était aPDT dans les limites conventionnelles . En outre, bien que des rapports précédents ont montré la résistance des bactéries aux antiseptiques tels que le chlorure de benzalkonium, qui est un agent tensioactif cationique d'ammonium quaternaire qui interrompt la membrane lipidique des cellules [27, 28], l'absence de résistance bactérienne après l'application de aPDT serait une autre bénéficier de l'application clinique [29]. Dans la présente étude, cependant, nous n'observé cytotoxicité aiguë à 2 h après l'application unique de aPDT, et donc d'autres études sont nécessaires pour étudier l'influence à long terme de aPDT sur la prolifération cellulaire, ainsi que l'action cumulative suivante applications répétées.
l'analyse des ROS générées pendant TBO médiée aPDT a abouti à la découverte nouvelle que le radical hydroxyle est le produit primaire. Bien que le mécanisme de aPDT [30] est généralement considérée comme lieu par un type I processus, qui produit un radical hydroxyle par transfert d'électrons, ou un procédé de type II, ce qui donne de l'oxygène singlet par transfert d'énergie, aucune modalité de la mort cellulaire par TBO médiée aPDT a été clarifiée. L'oxygène singulet est considéré comme les principales espèces nuisibles en aPDT [31], et le bleu de méthylène photosensibilisant commun est un producteur connu de l'oxygène singulet. Dans notre étude pilote précédente (données non présentées), nous avons confirmé la production de l'oxygène singulet en bleu médiée méthylène aPDT. Cependant, l'analyse ESR a révélé clairement que le radical hydroxyle est le produit prédominant de TBO médiée aPDT. En outre, les machines de type I a été spéculé à jouer un rôle important dans cette procédure aPDT.
Suite aux résultats des expériences in vitro
, nous avons essayé l'application clinique de aPDT pour l'inhibition de la formation de la plaque dentaire, et observé une suppression significative des dépôts de plaque sur les dents traitées avec aPDT. La durée de quatre jours de l'essai clinique a été courte, et donc une plus longue durée était souhaitable. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.
